تعديل التزجيج MicroSecure: وفعالة للغاية إجراء الحفظ بالتبريد آمنة وبسيطة والكيسات الأريمية الإنسان

Summary

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

Abstract

السريرية الجنين التزجيج تطورت مع تطور الأجهزة التزجيج فريدة من نوعها في ^القرن 21 ومع الاعتقاد الخاطئ بأن تبريد فائقة السريع في نظام "فتح" (أي مباشرة LN ₂ الاتصال) كان ضرورة لتحسين نجاح التزجيج. أدت العقيدة المحيطة أهمية معدلات التبريد لممارسات غير آمنة تخضع لاختلاف التقنية، وإنشاء أجهزة التزجيج أن تجاهل العوامل الهامة لمراقبة الجودة (على سبيل المثال، وسهولة الاستخدام، التكرار، والموثوقية والأمن ووضع العلامات، وسلامة التخزين). فهم العيوب مراقبة الجودة من الأجهزة الأخرى المسموح بها لتطوير طريقة ميكرو-VTF آمنة ومأمونة، للتكرار، وموثوق بها تهدف إلى تقليل التباين داخل الأقاليم وفيما بين فني. بنفس القدر من الأهمية، والجمع بين توافر جهازين ادارة الاغذية والعقاقير المتوافقة القائمة: 1) 0.3 مل ionomeric القش الراتنج الجنين مع المنضوية، ثنائي اللون، العبث فوضع العلامات على السطح مع تكرار إمكانات اللحام ختم. و2) تقصير، وتستخدم عادة، الرقم 300 ميكرون flexipettes عقيمة لتحميل مباشرة على الجنين (ق) من أجل إنشاء جهاز التزجيج العالمية عالية الفعالية. مثل العقيم أخرى، أغلقت أنظمة التزجيج (على سبيل المثال، وارتفاع الأمن التزجيج (HSV)، رابيد-ط، وVitriSafe) تستخدم على نحو فعال في الطب التناسلي، microSecure التزجيج (ميكرو-VTF) أثبتت أنه يمكن تحقيق ارتفاع البقاء على قيد الحياة بعد ارتفاع درجات الحرارة والحمل النتائج مع اهتمامها إلى البساطة، وخفض التباين الفني. على الرغم من أن القش الجنين 0.3 مل تحتوي على المكونات مسعور الداخلية تم استبدال تجاريا مع القش المني القياسية التي تمتلك pyrrolidone القطن البولي فينيل (PVP) المقابس، وأنها حافظت تكوينها الراتنج ionomeric لضمان اللحام الختم. ومع ذلك، يمكن للسدادات قطنية الفتيل من محتويات السائل الجنين من flexipettes عند الاتصال. وقد تم تكييف طريقة ميكرو-VTF تعديلها لتشمل اللحام الداخلي إضافيةختم قبل المكونات على الجانب تحميل الجهاز. الخطوة الفنية إضافة إلى إجراء ميكرو-VTF لم تؤثر في التطبيق الناجح، ومعدلات البقاء على قيد الحياة عالية كما (> 95٪) وتستمر معدلات الحمل اليوم.

Introduction

التزجيج هو واحد الأكثر تأثيرا تكنولوجيا المساعدة على الإنجاب في صناعة التخصيب في المختبر (IVF) منذ تطوير حقن الحيوانات المنوية بالبويضة. اليوم، الكيسات الأريمية هي cryopreserved دون خسارة في بقاء الجنين المرتبطة سابقا مع التقليدية أساليب بطيئة تجميد ^1. مع موثوقة بعد ارتفاع درجة حرارة بقاء الجنين، وصناعة العقم هو تحويل إلى استخدام المفضل لدورات نقل الأجنة cryopreserved، والتي تسفر عن نتائج الحمل مماثلة أو أعلى من نقل الأجنة الطازجة التقليدي. بالتعاون مع خزعة الكيسة والفحص الجيني قبل الغرس (PGS)، أصبح التزجيج أداة السريرية الحيوية لتحسين نتائج الولادة الحية صحية عن طريق سوي الصيغة الصبغية واحد نقل الأجنة ^{2 و 3.}

وقد وضعت الفئران التزجيج الجنين في منتصف 1980s ^{4، 5} وتكييفها للزراعة الحيوانات بحلول عام 1990 ^(6). واستنادا إلى فرضية أن الحلول التزجيج تشكل دولة glasseous متبدل الاستقرار، وخالية من الاضرار تشكيل الكريستال الجليد، وقد ثبت ذلك للحفاظ على أكثر كفاءة ونزاهة الخلوية كاملة من الأجنة. ومن المثير للاهتمام، فإن القبول واعد من التزجيج في علم الأجنة البشرية لم تبدأ تتحقق حتى ^القرن 21. وتزامنت المنشورات مبكرة تشجيع استخدام التزجيج مع تطور أجهزة النظام "فتح" فريدة من نوعها ^{7، 8، 9.} ومع ذلك، فإن اعتماد التزجيج في الممارسة السريرية بطيئة، كما جاءت في وقت التحسينات في بطء الكيسة تجميد وقد يحدث أيضا. نجاح تجميد بطء التقليدية، بالإضافة إلى التزجيج هي التي تنسجم، مع إدخال تحسينات في نظم الاستزراع الجنين، وكذلك مع incorporatأيون النهج انهيار جوف الأريمة، مما عزز كل من البقاء على قيد الحياة من الأديم الظاهر الغاذي، وبعد ذلك، زرع ^10.

في العقد الماضي، تكنولوجيا التزجيج ألقى بظلاله بسرعة الممارسات التجميد التقليدية. إلى حد كبير، ويرجع ذلك إلى تطوير أجهزة التزجيج المتخصصة بذلك. وقد أعاقت بعض من هذه الأجهزة السلامة العامة والكفاءة والفعالية من التزجيج السريري عن طريق إدخال عيوب التصميم الكامنة في الأجهزة المستخدمة في صناعة IVF ^11. وبالفعل، فإن الفروق الدقيقة في الأجهزة المختلفة إدخال الاختلاف الفني الكبير بين البرامج، التي يشار إليها عادة باسم "التوقيعات التقنية" ^(12). وهكذا، والمجلات العلمية، مثل مجلة التجارب متصور (إن الرب)، يمكن أن تكون مصدرا قيما لإظهار التفاصيل التقنية، والتي سوف تساعد على تقليل التباين النتيجة. مشكلة مستمرة أخرى هي أن لياليتستمر لى بعد علم الأجنة إلى أن معلومات خاطئة، وحتى اليوم، بناء على مزاعم بأن "تبريد فائقة السريع للأجنة أو بويضات في" نظام التزجيج فتح '(أي اتصال الجنين المباشر مع النيتروجين السائل (LN ₂₎₎ هو شرط أساسي لتحسين معدلات النجاح ". ومن الواضح أن هذا الاعتقاد غير دقيق، استنادا إلى نجاح مؤكد من العقيم مغلقة أنظمة ^{13، 14، 15.}

واستنادا إلى مبادئ cryobiological من التزجيج، وفعالية التزجيج تعتمد أكثر كبير على معدلات ارتفاع درجات الحرارة من على معدلات ^{16، 17، 18} التبريد. بشكل عام، بغض النظر عن الجهاز التزجيج المستخدمة، يجب أن يتجاوز معدل ارتفاع درجات الحرارة ومعدل التبريد لضمان بقاء معدلات عالية. معدلات ارتفاع درجات الحرارة العالية تقليل الفرصة لأي نمو الجليد (أي recrystallization من الشوائب الأنوية في حلول البرد) خلال المرحلة devitrification من ارتفاع حرارة الارض. منح، واستقرار الحل التزجيج (أي نوع وتركيز وكلاء واق من البرد المستخدمة) قد يكون له تأثير الخلط، ولكن هذا تم تناولها في منشور مستقل ^11. النظر في المسائل معدل التبريد والاحترار، وقد وضعت MicroSecure التزجيج (ميكرو-VTF) في عام 2008 باعتبارها غير التجاري طريقة ادارة الاغذية والعقاقير المتوافقة وغير مكلفة، أن أمثل الجوانب مراقبة الجودة من التزجيج. وكان فريد من نوعه من حيث أنه قدم للتزوير، المنضوية، ووضع العلامات المزدوجة اللون. وعلاوة على ذلك، عن طريق تحميل وتخزين الأجنة مباشرة في flexipette معقمة تستخدم لpipetting ل(أي بدون pipetting للسطح جهاز ثانوي) وباستخدام القش الراتنج ionomeric أن ختم اللحام تماما باستخدام سداده الآلي، وقد تم القضاء على التباين الفني على نحو فعال.

عند تقييم جompleteness من التزجيج الأجهزة لاستخدامها المحتمل، وهناك العديد من العوامل لمراقبة الجودة التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار، بما في ذلك: أن يلتزم 1) وسم علامات -هل تمنع المحتملة بشكل آمن؟ هم تزويرها؟ أنها لا تقدم ثنائي اللون إمكانية تحديد؟ هل تتطلب تسمية الثانوي، ويمكن تسمية إزالتها بسهولة لأغراض حفظ السجلات (أي المريض التحقق) بعد ارتفاع درجات الحرارة؟ 2) يتم تحميلها بسهولة التقنية الأجنة -هل تمنع بسهولة إلى / على الجهاز في الوقت المناسب وببساطة تحديد وتعقب ما بعد الاحتباس الحراري؟ 3) البساطة الإجرائية / التكرار -Does طريقة التزجيج عرض البساطة والموثوقية التي تسمح بسهولة عن التكرار، مما يقلل من التباين بين الفنيين (الداخلية) وبرامج (الخارجية)؟ 4) LN ₂ سعة التخزين هل يمكن أن الأجهزة بسهولة وأمان التعامل معها وحددت؟ هو ستو بهمالغضب الفضاء المحتملين كفاءة؟ هل جهاز عرض الأمن والسلامة من ضرر مادي أو الملوثات المحتملة كنظام مغلق العقيم؟ 5) إمكانية الاسترداد / قابلية البقاء -هل تصميم الجهاز عرضة للمشاكل المحتملة في انتعاش مضمونة من الأجنة، وأنها سوف موثوق تزجج والحفاظ على كامل سلامة الخلوية بعد ارتفاع درجات الحرارة؟ القلق نوعية محددة الأخير، ومعدل الاسترداد، وفعلا تم التقليل من المستغرب في التقارير المنشورة. يتم ذلك عن طريق إخفاء عموما نتائج سلبية (أي الجنين المفقود أو البيض) في معدلات البقاء على قيد الحياة عادة-جيدة. أي جهاز عرضة للانتعاش يتعارض (<99٪) معيب بشكل خطير ويشكل التزاما الإجرائية.

لدينا العقيم، أغلق طريقة ميكرو-VTF وقد وضعت استراتيجيا لحساب كل تدبير لمراقبة الجودة. ومع ذلك، وبعد 5 سنوات من النجاح السريري متفوقة والتحقق من صحة ^14، وكان الإجراء رس يكون تعديلها. تم إزالة الأصلي 0.3 مل القش الجنين (امتلاك المكونات مسعور) من صناعة التلقيح الاصطناعي واستبدالها مع القش المني 0.3 مل امتلاك المكونات القياسية القطن / PVP (أي يعاد تغليف باعتباره السائل المنوي / جنين القش). تلخص هذه الورقة الإجرائية الخطوات والاستراتيجيات المحددة اللازمة لتنفيذ ميكرو-VTF بأمان، ببساطة، وعلى نحو فعال. وعلاوة على ذلك، نسلط الضوء على التعديل () المطلوبة لحساب موثوق لفرض قيود على العرض، إلى أن يحين الوقت الذي يتم فيه يعيد حاوية القش مثالية بديلة مرة أخرى في المختبرات الطبية.

Protocol

وقد أجريت تطوير إجراءات ميكرو-VTF كجزء من دراسة وافق مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في الفترة 2008-2009 (أسباير IRB، سانتي، كاليفورنيا) على بويضة الإنسان والحفظ بالتبريد الجنين. ومنذ ذلك الحين تم تطبيق إجراء روتيني لعلاج السريرية للمرضى العقم الذين وقعوا استمارات الموافقة المستنيرة.

1. اعتبارات مراقبة الجودة

1. استخدام ألوان مختلفة (على سبيل المثال، والأقلام، والعلامات، أو تحديد الهوية) قضبان (أو شمعات) للتمييز بين المرضى إذا cryopreserving أكثر من مجموعة من الأجنة في يوم واحد.
2. استخدام أطباق والماصات مختلفة لكل مريض. تقليل حجم متوسطة نقل عند نقل الكيسات الأريمية من حل واحد إلى آخر.
3. Cryopreserve الكيسة واحد لكل من القش أو الجهاز. الحفاظ العقيم / تقنية معقمة وتلتزم جميع احتياطات السلامة.
4. تأكيد نموذج الإحالة على الأطباء وقعت موافقة المريض قبل initiatinز الإجراءات. تحقق التخلص من الجنين المرضى (ق) في المخزون.
5. استخدام "الإفراج عن المسؤولية والموافقة على نقل" إذا كان الكيسات الأريمية هي أن يتم تحويلها إلى منشأة أخرى. التأكد من أن جميع التوقيعات وشهد الموقع أو موثق.
6. تأكيد التدابير المناسبة لمراقبة الجودة على المدى المتوسط ​​ومكملات البروتين، حسب الاقتضاء، بما في ذلك اختبارات بيولوجية، قرارات الذيفان الداخلي، وانتهاء / الكثير رقم التحقق وتتبع.
7. إقامة الحدود الحرجة (أي انخفاض مستويات القلق) لالسريري مراقبة نتائج الحفظ بالتبريد والتقييم، مثل معدلات الاسترداد: <95٪، ومعدلات البقاء على قيد الحياة: <80٪، ومعدلات الحمل السريرية باستخدام الكيسات الأريمية وحيدة سوي الصيغة الصبغية: <50٪.

2. إجراء الحفظ بالتبريد

1. تجهيز
   1. استكمال الأوراق المناسبة، بما في ذلك إدخال البيانات في أوراق العمل وقاعدة بيانات الحفظ بالتبريد وسجل المخزون(ق).
   2. إعداد حلول الحفظ بالتبريد الطازجة أو استخدام مصدر تجاري (الالتزام التخزين وفترة الصلاحية الظروف الموصى بها الشركة المصنعة).
   3. إعداد القش.
      1. فتح الجانب وسم الحزم معقمة فردية. فصل ملء فوهة وجدت على التقليدي 0.3 مل الجنين القش عن طريق الامساك بها ضد التعبئة والتغليف وجزئيا رفع وسحب القش بها؛ هذا سوف يعرض نهاية التسمية إلى الظروف المحيطة في حين هدأ القشة جو معقم و مطهر داخل حزمة من البلاستيك.
         1. (تعديل) ل0.3 مل السائل المنوي / القش الجنين، ودفع المكونات بنسبة 0.5 سم. تطبيق الختم الداخلي في الجبهة من المكونات القطن حماية الأصناف النباتية من خلال استخدام سداده الطاولة دفعة الأساسية.
         2. تعيين القش على سطح تفلون من القطب، عادل امام من المكونات. خفض المؤشر إلى تفعيل الحرارة. الافراج عن التعامل عند ظهور الضوء الأحمر. لضمان ختم لحام كاملة، الحرارة عند درجة حرارة هذا بما فيه الكفاية flatteNS الأسطح معارضة، ثم اقلبها 180 درجة وختم سطح المعاكس ¹⁹ حسب الحاجة.
   4. باستخدام cryomarker، تسمية كل من القش / الجهاز وcryogoblet مع اسم المريض، وهو رقم فريد (على سبيل المثال، SSN، تاريخ الميلاد، أو رقم المريض)، وتاريخ التجميد. وتشمل أيضا عددا فريد على كل من القش / جهاز (على سبيل المثال، 1، 2، 3، الخ).
      1. تأمين التسمية (ويفضل اللون) على قضيب معرف المرجحة اللون لإدراجها ومختومة إلى الجنين القش 0.3 مل. العودة القشة إلى حزمة العقيمة الفردية لحين الاستخدام.
         ملاحظة: إذا كانت قضبان معرف المرجحة اللون 30 ملم فقط المتاحة، ثم هناك حاجة إلى إدخال إضافي اثنين من الكرات، المتاخمة لكل جانب من قضيب الهوية.
   5. تحديد كل قصب مع رقم المدرج فريدة من نوعها. تحديد LN ₂ تخزين عدد دبابة وعدد اسطوانة حيث عينة كل مريض (ق) يمكن أن يكون الواحدored على المدى الطويل.
   6. إعداد أطباق البرد الطازجة (100 ملم) التي وصفها السطح السفلي مع اسم المريض، معرف الحل، والجنين / عقد معرف الحبرية (الشكل 1A). على وجه التحديد، وإنشاء 4 صفوف من قطرات: مخزنة HEPES-متساوي التوتر المتوسط ​​(أعلى)، V1 (حل موازنة (ES))، V2 (الحل الوسط (IS))، V3 (الحل التزجيج (VS)؛ القاع). إرسال معرف الجنين في الجانب الأيمن العلوي مع الأعمدة المسمى.
      ملاحظة: سلسلة من 25- إلى 50 ميكرولتر غسل قطرات (ن = 3) يستخدم للتأكد من أن كل فرد نهائي 10- إلى 15 ميكرولتر عقد قطرة / نوع الحل (أي V1، V2، أو V3) هو محض و مخفف. يمكن استخدام هذا النهج، ما يصل إلى خمسة أجنة الفردية المزجج باستخدام صحن واحد. الحفاظ على كل طبق مغطى عندما لا تكون قيد الاستعمال لتجنب أي درجة حرارة الغرفة التبخر / الجفاف قطرات.
   7. إعداد flexipettes عقيمة عن طريق قطع 3 سم من نهاية قاعدتهم (المشار إليها باسم "نصائح VTF"). إدراجها على الفردالماصات (وضعت في 3 ميكرولتر) وتعيين نصائح ماصة VTF تستقيم في رف أنبوب الستايروفوم (الشكل 1B).
2. اختيار الجنين
   1. تأكيد المريض / عينة تحديد الهوية.
   2. باستخدام مجهر مقلوب (200 - 400X التكبير) والرتبة وتصنيف الكيسات الأريمية وفقا لنظام الدرجات غاردنر ^20، وذلك باستخدام تصنيف رقمي من 1-6 لفي وقت مبكر لالكيسات الأريمية الفقس، على التوالي، وA، B، أو C الصف تعيين إلى الخلية كتلة الداخلية (ICM) والأديم الظاهر الغاذي (TE).
      ملاحظة: في إطار التحضير لخزعة الكيسة وتحليل المجموعية، والمنطقة الشفافة هو ما قبل تحاك من قبل الاستئصال بالليزر في يوم 3 إلى تعزيز فتق في وقت مبكر من الشركة المصرية للاتصالات، وبالتالي يتطلب تعديل تصنيف الدرجات ^2. وباختصار، الصف 3 كامل الكيسات الأريمية المعرض تصل إلى 10٪ TE فتق، الصف 4 توسيع الكيسات الأريمية و10-50٪ تحاك، ودرجة 5 الكيسات الأريمية الفقس لها> 50٪ TE extrusioن (الشكل 2A-C).
      ملاحظة: لدينا تفضيل هو cryopreserve الصف 3 أو الكيسات الأريمية أعلى من الجودة ≥BB في يوم 5 أو 6. ومع ذلك، الكيسات الأريمية المزجج أقل جودة (C) والأجنة بعد الضغط في مراحل سابقة (بما في ذلك أواخر تويتة إلى الصف 1 أو 2 الكيسات الأريمية ) بالتأكيد يمكن البقاء على قيد الحياة الاحترار سليمة تماما وتسفر عن أجنة قابلة للحياة قادرة على تحقيق ولادة حية.
   3. طي جوف الأريمة كل الكيسة قبل بداية عملية cryodilution التي كتبها micropuncturing تقاطع الأديم الظاهر الغاذي أو عن طريق إجراء الاجتثاث نبضة ليزر من خلية trophectodermal ²¹ في حالة استخدام حلول التزجيج-المولية منخفضة (<6.5 م أو 40٪ ت / ت).
      ملاحظة: إن الحاجة إلى انهيار الكيسات الأريمية ليست جهاز يعتمد. في تنميتنا الأولى الخاصة ميكرو-VTF (2008)، وكنا في البداية جلايكول الإثيلين (EG) / حلول DMSO بنجاح مع البويضات (1 من 1 الحمل فترة ولاية كاملة)، ولكن دون المستوى الأمثل (<80٪)وقد شهدت البقاء على قيد الحياة / تطوير الكيسات الأريمية الماوس ¹⁶ قبل الآخرين ^21. منذ حلول عالية القائم على الجلسرين المولي (تتجاوز 7.9 M) وتستخدم في نظام VTF الحالي لدينا (منذ عام 2009)، وانهيار جوف الأريمة المادي هو غير ضروري. ومع ذلك، فإن الفقس الانتقائي للالكيسات الأريمية التي تحاك ينصح بشكل عام.
3. Cryodilution والكيسة تحميل
   1. إزالة الطبق الثقافة المريض من الحاضنة وتأكيد هوية المريض / عينة مع شخص آخر (أي التي شهدتها مصدر ثانوي) قبل إزالة الجنين (ق) إلى أن المزجج.
   2. تأكيد تطوير الكيسة في خطوة 2.2.2، تحديث ورقة البيانات البرد، وتحت stereomicroscopy، ماصة الكيسة الأريمية (ق) من الطبق الثقافة إلى قطرة عقد متساوي التوتر الطبق البرد.
   3. نقل كل الكيسة إلى قطرات عقد الفردية باستخدام flexipette التزجيج (أي طرف VTF).
   4. نقل كلالكيسة إلى V1 (ES) حل.
      1. تعبئتها بشكل مسبق flexipette مع حل V1 (3 ميكرولتر) ووضع نصف محتويات على الجنين.
      2. نضح الجنين والانتقال إلى الأول من ثلاثة V1 قطرات تغسل (المشار إليها في الخطوة 2.1.6)، ماصة الجنين 2-3 مرات حول محيط، ومسح محتويات ماصة في الحبرية (تجنب تشكيل فقاعة) أو خارج على سطح الطبق.
   5. ملء غيض VTF مع القادم انخفاض غسل V1 وتكرار تطلع الجنين (ق). أكرر للمرة الثالثة ونقل الكيسة الأريمية (ق) إلى انخفاض V1 عقد فردي. يجب أن الخطوات تخفيف / الغسيل تستغرق 30 إلى 45 ثانية. قبل تحميل كل طرف VTF مع الحل التالي (على سبيل المثال، V2)، إدراج ماصة في رفوف، واستخدام ماصة القادمة (وفقا لبرنامج الإعداد في خطوة 2.1.7) (الشكل 1B).
      ملاحظة: بما أن مجموع وقت التعرض في سلفوكسيد غير ثنائي ميثيل ([دمس]) التي تحتوي على حلول V1 و V2 هو 5 دقائق لكل منهما، وpipetting لمن indiviالكيسات الأريمية المزدوجة يجب متداخلة بشكل متساو في تلك الفترة، معتبرا أن الخطوة V3 النهائية ستتطلب 1 دقيقة على الأقل في الكيسة لأداء. على سبيل المثال، إذا كان هناك 4 الكيسات الأريمية في مجموعة التزجيج، الكيسات الأريمية ماصة # 1-2-3-4 على فترات 75 ق.
      ملاحظة: مبتكرة بروتوكول تخفيف البرد الشركات (ICE) المذكورة أعلاه تختلف اختلافا واضحا من معظم الإجراءات التزجيج التجارية الأخرى، والتي تشمل عموما الحلول التي تحتوي على DMSO. هذه البروتوكولات على تحقيق نفس التخفيفات تدريجية من خلال تدريجي، ولكن أقل رقابة، دمج لغسل الحل (أي والمتوسطة متساوي التوتر)، وفاق، وضد.
   6. كرر الخطوات من 2.3.4 و 2.3.5 باستخدام حلول V2 (IS).
   7. كرر الخطوات من 2.3.4 و 2.3.5 حلول باستخدام V3 (VS).
   8. على وضع كل الكيسة في V3 عقد الحبرية، قم بإلغاء تحديد الحل المتبقية وفقاعات من طرف VTF (خارج الحبرية)، ثم ملء الحافة تماما مع V3 نظيفة حول الجنين. إكسبشرم حوالي ثلث حجم (1 ميليلتر) وماصة للالكيسة الأريمية (ق) والمتبقي V3 تماما في تلميح VTF.
   9. إزالة غيض VTF من ماصة، ومسح الجافة طرف V3 المتبقية على السطح الخارجي باستخدام شاش معقم، وإدراج غيض نهاية لأول مرة في نهاية مفتوحة من القش وصفت مسبقا. أ "طرف الجافة" أمر بالغ الأهمية لمنع الممكن التمسك القش الداخلي.
   10. عكس القش (التسمية يغلق منخفضا)، ومراقبة طرف في المكونات الداخلية أو الختم، وبأمان اغلاق نهاية مفتوحة مع 1 سم للمجال الجوي. يفضل استخدام جهاز الختم التلقائي (على سبيل المثال، سيمز الأول) للقضاء على التفاوت التقني.
       ملاحظة: الاستفادة من استخدام القش التي تتألف من البلاستيك الراتنج ionomeric (على سبيل المثال، HSV أو ميكرو-VTF) هو أن استخدام أي حرارة تعمل بشكل صحيح ختم الجهاز يخلق موثوق "لحام" ختم، كما لوحظ في خطوة 2.1.3.1.
   11. مرة واحدة مختومة، ويغرق القشة مغلقة مباشرة إلى LN ₂ في الفولاذوفاق سطيف الصلب ديوار قارورة ووضع القش (ق) في كأس مفتوحة تعلق على قصب المريض للتخزين.
       ملاحظة: لأن القش ميكرو-VTF استخدام 40 ملم قضبان الرقم مرجح للتعويض عن الطفو من القش مليئة بالهواء، واستخدام كؤوس مقلوب أو cryovials فارغة لتغطية العينة (ق) غير مطلوب إلا إذا شاركت وسائل النقل.
4. ارتفاع درجات الحرارة والبرد-حل شطف / التخفيف
   1. تأكيد نموذج على الأطباء الإحالة فيما يتعلق المزجج تاريخ نقل الأجنة، والوقت المقرر، وتفاصيل الجنين (العدد إلى ذوبان الجليد / نقل، عدد الأجنة محددة إذا اختبرت PGS، وما إلى ذلك).
   2. إعداد حلول الاحتباس الطازجة (1.0 M السكروز حل الأسهم) و / أو استخدام مصدر تجاري (موصى به 1 أسبوع 1 شهر من الحياة الرف مرة واحدة قيد الاستخدام، 4 ° C التخزين).
      1. قسامة 17.1 غرام من السكروز في 50 مليلتر قوارير معقمة عند فتح الأولي (على سبيل المثال، مصدر العرض الأسبوعي) بسبب مخاطر تراكم الذيفان الداخلي في الجرانيت السكروزnules عند التعرض المحيطة المتكررة.
      2. مزيج زنه قبل السكروز محبب إلى الحل (1.0 M الأسهم = 3.42 جم / 10 مل من السوائل البوقي البشري مخزنة HEPES-[H-HTF]) وتدفئة حل ما يصل الى 37 درجة مئوية إلى زيادة ذوبان حبيبات. عكس مرارا الحاوية للمساعدة في تسريع واستكمال خلط النهائي.
         ملاحظة: الترشيح (0.22 ميكرون فلتر) يقوم باستخدام وحدات ضغط الترشيح إيجابية يستحب للحلول لزجة (> 0.5 M السكروز) أو بكميات كبيرة. مضخات ضغط اليد كافية وغير مكلفة، في حين أن مضخة كهربائية صاخبة، تسبب الاهتزازات، وببساطة غير مطلوب.
   3. دافئ (37 درجة مئوية) واحد 10 مل أنبوب كل من 1.0 M حل السكروز والمتوسطة H-HTF لكل مريض لميكرو-VTF استخدام حمام الاحتباس الحراري.
   4. إعداد أطباق ذوبان الطازجة (6 جيدا لوحة) التي وصفها سطح غطاء مع اسم المريض ومعرفات الحل.
      ملاحظة: في هذه الحالة، استخدمنا: (1) غسل T1 (200 μ، L دون تراكب النفط، (2) T1 (100 ميكرولتر) مع 1 مل من النفط، (3) T2 (100 ميكرولتر) مع النفط، (4) T3 (100 ميكرولتر) مع النفط، (5) T4 (100 ميكرولتر) مع النفط، و (6) متوسطة مخزنة HEPES-T5 / 200 ميكرولتر متساوي التوتر مع 10٪ ألبومين المصل البشري (HSA) أو 20٪ بديلا المصل دون تراكب النفط. تطبيق السكروز عالمي حل تنحى البروتوكول-T1 = 1.0 M، T2 = 0.5 M، T3 = 0.25 م، وT4 = 0.125 M-إذا كان ICE أو مصدر تجاري آخر غير متوفر، كما هو مقترح للأجنة بطيئة المجمدة ²² . وعلاوة على ذلك، لاحظ أن غسل T1 الأولي وequilibrations T5 نهائي لا يمكن أن يؤديها في 30 ملم أطباق بتري وطبق 4 جيدا تستخدم لخطوات 2-5 أعلاه، التي تنطوي على تراكب النفط.
   5. ذوبان الجليد الجنين مريض واحد فقط (ق) في وقت واحد.
      1. تحقق نموذج الإحالة على الأطباء والتأكد من دورة قبل ارتفاع درجات الحرارة وأشار عدد (أي 1 أو 2 الكيسات الأريمية)؛ تقييم البقاء على قيد الحياة / الجدوى المحتملة من خلال مراقبة التغيرات الأسموزية (أي SHRinkage والإماهة) والأغشية سليمة، وإذا كان مشكوك فيها، اتصل الطبيب و / أو المريض قبل ارتفاع درجة حرارة الكيسة آخر.
   6. تأكيد هوية المريض / عينة مع زميل في العمل (أي التي شهدتها مصدر ثانوي).
   7. وضع قصب المريض في قارورة ديوار مليئة LN ₂ وعزل تحديد القش لأن تكون درجة حرارة.
   8. تقديم طبق التخفيف 6 جيدا إلى وسط المسرح مجهر تشريحي. وضع طبق من عيار 60 ملم بيتري قبالة لجانب واحد (أي، اعتمادا على الأيسر أو تفضيل اليد اليمنى لفني)، إضافة السكروز حرارة (1.0 م) والحلول H-HTF لخلق ظاهرة الاحتباس 0.5 M السكروز حمام (كشف).
      ملاحظة: درجة حرارة نصائح VTF فقط في 0.5 M حلول السكروز كضمان لمراقبة الجودة، لضمان الإبقاء على حيوية الجنين في حالة نادرة أن الجنين يطرد على الاحترار السريع ^22.
   9. عقد ختم القش العلوي فوق سطح السائللتأكيد الهوية، ومن ثم فهم وتأمين القش تحت المكونات الداخلية باستخدام مقص مايو (يجب أن لا تزال مغمورة طرف VTF في LN _2).
      1. بحزم الاستفادة من مقص على قارورة ديوار (بضع مرات) لإزالة غيض VTF من جدار القش الداخلي كإجراء احترازي مراقبة الجودة؛ إذا كان طرف VTF غير ملتصقة، والتنصت يضمن أن القاعدة طرف قطرات إلى نهاية مغلقة قبالة نهاية المسمى، وبالتالي توفير مساحة الهواء قرب نهاية المكونات.
   10. رفع القش مع مقص إلى الهواء المحيط في وضع أفقي (بجانب أو تحت سطح المجسام) وفهم نهاية غير المسمى (التسمية إلى الجانب الأيمن). قطع القش في المكونات الداخلية أو ختم ورفعه فوق طبق حمام الاحتباس الحراري. صب طرف VTF في حمام دافئ السكروز في زاوية 60 درجة حتى أنه مقذوف تماما، وكان سريعا حرارة (> 6000 درجة مئوية / دقيقة). سوف قاعدة flexipette راحة فوق جدار صحن.
       1. السماح لمنظمة الشفافية الدولية VTFع لتحرير السقوط في الحمام. اضغط برفق على سطح القش العلوي إذا لم طرف يخرج على الفور. إذا كان يبدو فقط جزء الطريق، والمساعدة في قذف عن طريق استيعاب رمح من flexipette مع مقص أو ملقط غرامة.
   11. بعد 5-10 الصورة، فهم قاعدة ماصة وإدراجها في جهاز pipetting لالمتاح. ثقب في مصباح يعمل على اطلاق سراح الضغط على الإدراج. تغطية حفرة لمبة مع السبابة والضغط برفق لمبة للافراج عن الكيسة المزجج في غسل T1 (رقم 1)، في حين عرض من قبل stereomicroscopy. أكد مرة واحدة، واضحة الحل وفقاعات المتبقية V3 (VS) من خلال الضغط الايجابي، اخلاء محتويات في المركز، تجاهل غير المستخدمة جيدا. بدء الموقت 5 دقائق.
       ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات تخفيف السكروز في درجة حرارة الغرفة (21 ± 2 درجة مئوية).
   12. إزالة VTF طرف وضعه على ماصة. المضي قدما من خلال نقل الجنين إلى T1 رقم 2 تحت النفط للمرة المتبقي (حوالي 3-4 دقائق). <رأ>
   13. إذا كنت بحاجة لالكيسة الثانية للنقل، الحارة فورا القش الثاني وVTF طرف (تكرار الخطوات 2.4.9 - 2.4.11) من المريض قبل الشروع في خطوة 2.4.12. نقل كل الكيسات الأريمية معا من أجل الحد الأدنى من شطف في T1 (1.0 M السكروز) من 3 دقائق على الأقل.
5. قبل ملء flexipette مع الحل التالي، ومن ثم التحرك وتمييع الكيسة الأريمية (ق) في T2، T3، T4 وعلى فترات 3 دقائق. إذا كانت المنطقة الشفافة لم يتم سابقا الليزر ذاب (أي تحاك)، أن تفعل ذلك في T4. وضع طبق على خشبة المسرح من مجهر مقلوب وصورة الجنين على شاشة الحاسوب. محاذاة زونا داخل دائرة حمراء المعينة وتفعيل 2 أو 3 نبضات ليزر ديود (ابتداء من حافة الفضاء محيط بالمح والانتقال الى الخارج) لإنشاء افتتاح ^{2، 19.}
6. تتوازن الكيسات الأريمية في T5 (أي والمتوسطة متساوي التوتر) لمدة 5 دقائق على سطح دافئ (37 درجة مئوية).
7. تقييم بقاء الجنين الأولي بناء على وجود السائد لأغشية الخلايا سليمة مع cytoplasms حتى، شفافة خالية من سواد تغلظية. وضع الجنين (ق) في ثقافة 2-6 ساعة قبل نقل الأجنة، في الوقت الذي والجنين تنمية / البقاء على قيد الحياة يجب إعادة تقييمها وتوثيقها.
   ملاحظة: في حالة وجود أكثر من 1 الكيسة قابلة للحياة في وقت نقل والمريض اختارت المضي قدما في 1 فقط الكيسة، الكيسة تكميلية يمكن بعد ذلك بنجاح إعادة المزججة (rVTF) بتكرار الخطوات 2.3.3 - 2.3.11. لدينا العديد من المواليد الأحياء التأكيد على ما يلي الأحداث rVTF واحدة.
   ملاحظة: rVTF وقد تم تنفيذ التجربة تصل إلى 5 مرات من دون تأثير كبير على البقاء على قيد الحياة / سلامة الكيسات الأريمية الإنسان عدم توازن الصبغيات المزجج في حل يستند إلى الجلسرين متبدل الاستقرار.

النتائج

وقد تحسنت 1341 الكيسات الأريمية المزجج بين عامي 2012 وحتى يونيو عام 2014، وانتشال 1341 الأجنة (100٪)، في حين نجا 1316 (98.1٪). الكيسات الأريمية تحتاج فحص شهدت أكثر من 99.5٪ البقاء على قيد الحياة. على نقل الغالب واحدة، واختبارها وراثيا، سوي الصيغة الصبغية والأجنة المزجج، كنا قادرين على تحقيق بعض من أعلى معدلات التوطين ومعدلات المواليد الأحياء في الولايات المتحدة الأمريكية، بغض النظر عن العمر (الشكل 3) ^20، وفقا لإحصاءات الوطنية الأخيرة التي أبلغ عنها المركز السيطرة على الأمراض وجمعية تكنولوجيا التناسل المساعدة (الجدولين 1 و 2). تقييم عدد سكانها المريض التشخيص الجيد (أقل من 35 سنة) لدورات cryopreserved وحدها (الجدول 1)، تفوق مختبرنا المعدل الوطني لكلا معدلات زرع (أي كفاءة الجنين إلى وضع الحمل) ويعيشون في نهاية المطاف معدلات المواليد أكثر من 30٪. بالإضافة إلى ذلك، أدى التحقق من صحة / التحقق الأولي لدينا القش تخزين تعديل في منتصف 2014 باستخدام 70، الكيسات الأريمية مختل الصيغة الصبغية إعادة المزجج-البحوث وافق في استرداد 100٪ و 100٪ البقاء على قيد الحياة.

الشكل 1. إعداد MicroSecure VTF. يتم تجميع الطبق VTF (A) مع 3 صفوف متميزة من الحلول التزجيج، التي تستخدم 3 قطرات تغسل قبل وضع في المتميزة، قطرات عقد مرقمة. بالإضافة إلى ذلك، يتم تأمين الماصات الفردية مع نصائح VTF تقصير (أي flexipettes الرقم 300 ميكرون)، ونظمت في رفوف أنبوب الستايروفوم (ب)، والتي يمكن أن تكون استدارة للاستخدام منظم. لاحظ أن المتاح لمبة micropipette التجمع pipetting لتمثيل يوضع على الرف الستايروفوم. arget = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. التعديل الكيسة نظام الدرجات. حساباتنا غاردنر نظام الكيسة الدرجات المعدلة للفتق الناجم عن الخلايا TE لتسهيل الكيسة الخزعة. ويعتبر التعديل تفريخ السابق لأوانه الكيسات الأريمية الكاملة (A: الصف 3 = أقل من 10٪ فتق) والكيسات الأريمية الموسعة (B: الصف 4 = ما يصل الى 50٪ فتق)، في حين أن الكيسة الفقس (C) لديه أكثر من 50٪ فتق ^16. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

54871fig3.jpg "/>
الشكل 3. نتائج الحمل مقارنة. على مدى فترة التراكمي لمدة 1.5، وتمت مقارنة البيانات الحمل لتقييم آثار نقل حرارة المزجج-الكيسات الأريمية سوي الصيغة الصبغية (ن = 172 دورة / 144 نقل) مقارنة بالدورات غير PGS (ن = 160 دورة / 153 نقل) التي تنطوي في الغالب جديدة نقل ^18. لأغراض تجريبية لدينا، هذه البيانات يكشف بوضوح أن الكيسات الأريمية الخزعة المزجج قبل إجراء ميكرو-VTF حفاظ على بقائها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مصدر البيانات	# دورات	يعني # الأجنة المنقولة	زرع الاسعار (٪)	أسعار الميلاد الحية (٪)
ملحوظة: مختبر *	144	1.2	74.00٪	74.50٪
متوسط ​​الوطنية	20423	1.7	39.60٪	44.10٪
* بلغ متوسط ​​البيانات على أساس الأداء عام 2014 مقاطعة أورانج الخصوبة، مركز الخصوبة جنوب كاليفورنيا، ومركز جنوب كاليفورنيا للعيادات لطب التناسلي باستخدام الحفاوة الحالي الخصوبة مختبر (ملحوظة مختبر) التي تأسست الإجراء microSecure التزجيج في عام 2008.

الجدول 1. 2014 CDC بمساعدة الاحصائيات الإنجابية. المجمدة نقل البيانات الجنين الحمل من النساء تحت سن 35 سنة من ثلاثة الإبلاغ عيادات الطبيب باستخدام لدينا ملاحظة مختبر مقارنة مع المتوسط ​​القومي للولايات المتحدة عام 2013 أكثر من 450 عيادة التقارير.

المتوسطات سرت الوطنية
العيادة - الدولة	نساء	نساء	نساء	نساء
	<35 عاما	35-37 عاما	38-40 عاما	41-42 عاما
SCCRM-CA *	63.1٪	58.3٪	40.6٪	32.3٪
CCRM-CO *	64.7٪	61.5٪	40.4٪	32.2٪
الجيش الملكي المغربي-NJ *	63.2٪	59.7٪	34.6٪	18.7٪
متوسط ​​الوطنية	48.6٪	38.3٪	24.3٪	12.3٪
مركز كاليفورنيا SCCRM الجنوبي للطب التناسلي. مركز CCRM كولورادو لللطب التناسلي. والجيش الملكي المغربي-Reproductive الطب شركاه
* هذه العيادات الرائدة نفذت جميع الغالب المزجج دورات نقل الأجنة، وذلك بالتعاون مع الاختبار الجيني قبل الغرس، في الممارسة المعتادة للرعاية المرضى لتحسين نجاح ولادة حية في جنين المزروعة.

الجدول 2. 2014 التراكمي معدلات المواليد الحية، وكما ذكرت من قبل المجتمع لتقنيات التناسل المساعدة (سرت)، لعيادة SCCRM استخدام لدينا الحفاوة الخصوبة مختبر في نيوبورت بيتش، كاليفورنيا، يتناقض مع العديد من البرامج المحترمة الأخرى، وكذلك مع سرت المعدلات الوطنية.

Discussion

اليوم، هناك توقعات عالية لتحقيق بقاء الكيسة كاملة (> 95٪)، وتحقيق النجاح زرع مماثلة لتلك الأجنة الطازجة. وقد اقترح بعض الجماعات أن معدلات المواليد الحية دورات نقل الأجنة المزجج وربما أعلى من الكيسات الأريمية جديدة عندما يتم زرع الجنين cryopreserved سليمة في بيئة صحية الرحم، وحفز غير هرمونية. تشير البيانات المتوفرة لدينا بشكل واضح أن التزجيج تحتفظ بشكل فعال وموثوق سلامة الجنين جديدة. وعلاوة على ذلك، وقد أثبتنا أن لدينا العقيم، طريقة مغلقة، ودعا MicroSecure التزجيج (ميكرو-VTF)، ويمكن تحقيق هذه النتيجة المثلى مماثلة أو أكبر من المعايير التجارية (أي أنظمة جهاز مفتوحة) المستخدمة في صناعة التلقيح الاصطناعي.

ويرتبط الاختلاف مع التكرار التقني والموثوقية بين الأفراد الذين يستخدمون العديد من التزجيج الأجهزة / الأساليب. بدوره، أدى هذا في inconsistencies بين برامج تطبيق التزجيج. ولذلك، فإنه ليس من المستغرب أن الألفة جهاز هو عامل مهم فيما يتعلق الكفاءة المختبر ونتائج ناجحة. هذا هو مفهوم "التوقيع الفني" ¹¹ الذي يفسر لماذا التكرار بين البرامج قد يكون مشكلة. وليس فقط تطوير أكثر من عشرة أجهزة التجارية تعقيد هذه الظاهرة، فقد أنشأت المخاوف مراقبة الجودة. لحسن الحظ، أغلقت أنظمة التزجيج، مثل ميكرو-VTF، رابيد-I، وVitriSafe، تثبت الآن أن تكون فعالة بنفس القدر لفتح أنظمة الجهاز ^{12 و 13 و 14.}

MicroSecure VTF هو الرواية، وتقنية التزجيج العقيم وضعها مع سهولة التقنية، والموثوقية، والبرد الأمن في الاعتبار. من خلال الجمع بين استخدام اثنين من الأجهزة المعتمدة سابقا، ادارة الاغذية والعقاقير المتوافقة، بل هو نظام التزجيج غير التجاري ثإيث ميزة واضحة من وجود منخفضة التكلفة المعمول بها، على النقيض من الأجهزة المتخصصة. وبالإضافة إلى ذلك، جعلت لها تزويرها فريدة من نوعها والمنضوية ثنائي اللون نظام وضع العلامات، فضلا عن العديد من المزايا الأخرى لمراقبة الجودة، ميكرو-VTF خيارا جذابا العالمي ^11. كجهاز VTF غير التجاري، إلا أن تطبيقه الصناعة على نطاق واسع يتطور ببطء. فقط من خلال نشر المستمر للسلامة والأمن وفعاليته السريرية وكسب ميكرو-VTF تزايد استخدام.

في أغسطس عام 2014، عندما تواجه مع عدم القدرة على الحصول على الأصلي 0.3 مل الجنين القش المصنعة مع، غير فتل المكونات مسعور الداخلية، وكنا قادرين على تعديل موثوق طريقة ميكرو-VTF. باختصار، تم تكييفها على نحو فعال السائل المنوي 0.3 مل / القش الجنين جديدة مع المقابس القطن PVP بهم. وقد تحقق ذلك ببساطة عن طريق إنشاء ختم الداخلية قبل المكونات القطن، وبالتالي منع الاتصال وسائل فتل معغيض VTF فتح باب العضوية (أي flexipette تحتوي على الجنين أو البيض). وعلاوة على ذلك، إذا قضبان ID-40 ملم لا يمكن الوصول إليها، قضية الطفو المرتبطة أخف قضبان 30 مم ويمكن counterweighted باستخدام اثنين من الكرات.

وقد جعلت هذه خطوات إضافية تقنية أقل قليلا بسيطة، ولكن لا تزال فعالة للغاية. اليوم، والاقتصاد والفعالية أصبحت المخاوف تتزايد أهميتها، وعادة ما تكون المزججة الكيسات الأريمية الخزعة على حدة حتى يتم تأكيد وضعهم المجموعية على تقرير الوراثة. الكيسات الأريمية مع حالة عدم توازن الصبغيات غير قابل للحياة أكد عادة ما يحصل تجاهل، مع موافقة المريض، في غضون أسابيع. وبالتالي، يتم تجاهل أغلبية (> 50٪) من أجهزة VTF بعد التخزين على المدى القصير، مما تسبب في تصاعد التكلفة السنوية عند استخدام الأجهزة التجارية. وعموما، ميكرو-VTF هو إجراء عالية فعال وموثوق به، وتكرار لحفظ البرودة من الكيسات الأريمية الإنسان. متفوقة مراقبة الجودة تصميم securelتسميات ص وأمان بتخزين الأجنة / البويضات حين القضاء على فشل الانتعاش وتحسين البقاء على قيد الحياة بعد ارتفاع درجات الحرارة والحيوية، الأمر الذي يبرر استخدام النظام كنهج الجميع على التزجيج الجنين.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cane	IVM	XC055
Ball bearings, 3/32"	VXB.com	KIT15977	stainless steel
CBS semen/embryo straw, 0.3 mL	CryoBioSystems	25292	individual sterile
Color, ID rods, 30 mm	CryoBioSystems	019021-26	weighted
Culture tubes, 15 mL	Falcon	352099	Conical
Culture tubes, 10 mL	Falcon	352057	Snap-cap
Cryosleeves	Nalgene	5016-001
Filter, 250 mL	Fisher Sci.	09-740-2A	0.22 μm
Flasks, Tissue Culture 50 mL	Falcon	353014
Flexipettes, 300 μm ID	Cook Med.	K-FPIP-1300-10BS-5	Sterile, 20/pack
Forcep, Large	Miltex	6-30TC
Forcep, Splinter - fine	Miltex	17-305
Goblet	IVM	PA003
Heat Sealer, SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110 V or 220 V with adapter
Hepes-buffered media	Life Global or	LGGH-100; 100 mL, or	stored at 2 - 8 ºC
	Irvine Scientific	H-HTF; 90126; 100 mL	with non-essential AA's
Labels, Cryo	GA International	CL-23T1	Various colors
Liquid Nitrogen Tank, 40 L	MVE or Taylor Warton	various	liquid storage
LN2; Dewar flask, 0.5 L	Hampton Research	HR4-695	Stainless steel
6-well Custer Dishes	Biogenics	015/020	plasticware by case
Pipette Bulb, Micro Cap	Drummond	Fisher#13681451	Hole on bulb apex
Petri Dishes, 35 mm	Falcon	351006
Petri Dishes, 58 mm	Nunc	150288
Petri Dishes, 100 mm	Falcon	351029
Pipette Tips, ART long	Fisher Sci.	02-707-80	10 - 100 μL
Pipet Aid	Drummond or Falcon	various	rechargeable
Pipetting Device, Stripper	Cooper Surgical	MXL3-STR
Pipettes, Serological 1 mL	Falcon	357521
Pipettes, Serological 2 mL	Falcon	357507
Pipettes, Serological 5 mL	Falcon	357543
Pipettes, Serological 10 mL	Falcon	357551
Scissors, Surgical Mayo	Miltex	5-SC-16
Stereomicroscope	Nikon, Olympus, Leica	various
Sterile Gauze pads, 4" x 4"	Kendall Healthcare	6939
Synthetic serum	Life Global, or	LGPS-20; 20 mL, or	stored at 2 - 8 ºC
	Irvine Scientific	SS-99193; 12 x 10 mL	purchase low endotoxin lot
Sucrose	Sigma Chemical Co.	#S9378	Aliquot into 50 mL flasks, 1 year; 17.1 g/flask + Medium to 50 mL; makes a 1 M solution; Filter with 0.22 µm unit
Timer	Nalgene	5016-001
Thawing Solution	Innovative Cryo Enterprises	BL-TS (≤1.0 M Sucrose)	T1, T2, T3, T4; tored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening
Vitrification Solution*,**	Innovative Cryo Enterprises	BL-VS (≥7.9 M [Glycerol/EG])	V1, V2, V3; stored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening
* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate
** Other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8 M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2 M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property.