Vitrification MicroSecure השתנה: כספת, פשוט מאוד נוהל Cryopreservation אפקטיבי עבור blastocysts אנוש

Summary

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

Abstract

Vitrification עובר קליני התפתח עם התפתחות מכשירי vitrification ייחודיים במאה ^{ה -21} ועם התפיסה המוטעית כי קירור אולטרה-מהיר מערכת "פתוחה" (כלומר, מגע ישיר LN ₂₎ היה הכרח כדי לייעל הצלחת vitrification. הדוגמא סביב חשיבות שיעורי קירור הובילה נהלי שימוש לא בטוחים נתונים לשינויים טכניים ליצירת התקני vitrification כי התעלמו גורמי בקרת איכות חשובות (למשל, קל שימוש, דירות, אמינות, אבטחת תיוג, ובטיחות אחסון). הבנת הליקויים-בקרת איכות של מכשירים אחרים אפשר את התפתחותה של שיטה בטוחה ומאובטחת, הדיר, ואמין מיקרו-שניות-VTF שמטרתה למזער וריאציה התוך והבין-טכנאי. לא פחות חשוב, זה בשילוב הזמין של שני מכשירים FDA תואמים קיימים: 1) קשית עובר שרף 0.3 מיליליטר ionomeric עם הפנים, כפול בצבע, לחבל-pתיוג גג עם פוטנציאל חותמים לרתך דיר; ו -2) קצר, נפוץ בשימוש, 300 מיקרומטר מזהה flexipettes סטרילי כדי לטעון את העובר ישירות (ים) כדי ליצור מכשיר vitrification העולמי יעיל. כמו-ספטית אחרים, סגור מערכות vitrification (למשל, vitrification אבטחה גבוהה (HSV), ראפיד-i, ו VitriSafe) להשתמש ביעילות ברפואה הרבייה, vitrification microSecure (מיקרו-שניות-VTF) הוכיחה שהיא יכולה להשיג הישרדות והריון שלאחר התחממות גבוהה תוצאות עם לידיעתה לפשטות, וריאציה טכנית מופחתת. למרות קש העובר 0.3-מ"ל המכיל תוסף הידרופובי הפנימי הוחלף מסחרית עם קשית זרע סטנדרטי בעל כותנה-פוליוויניל pyrrolidone (PVP) תקעים, שמרה על הרכב שרף ionomeric להבטחת איטום לרתך. עם זאת, אטמי כותנה יכול הפתיל את תכולת נוזל העובר של flexipettes לנוגע בהם. שיטה שונה מיקרו-שניות-VTF הותאמה לכלול לרתך פנימיות נוספותלאטום לפני תקע בצד טעינת המכשיר. השלב הטכני הוסיף לנוהל מיקרו-שניות-VTF לא השפיע יישום מוצלח שלה, כמו בהישרדותם (> 95%) ושיעורי ההריון ממשיכים היום.

Introduction

Vitrification הוא טיפולי פוריות השפעה ביותר יחיד הפריה חוץ גופית (IVF) בתעשייה מאז הפיתוח של הזרקת זרע intracytoplasmic. היום, blastocysts הוא cryopreserved ללא אובדן כדאיות עובר הקשורים בעבר עם שיטות קונבנציונליות איטית-הקפאת ^1. עם הישרדות העובר שלאחר התחממות אמינה, תעשיית הפוריות הוא והפכה את השימוש המועדף של מחזורי חזרת עוברת cryopreserved, אשר להניב תוצאות הריון דומות או גבוהות יותר עוברים טריים מסורתיים. בשיתוף עם ביופסיה הבלסטוציסט והקרנה גנטית preimplantation (PGS), vitrification הפך לכלי קליני חיוני להשגת תוצאות אופטימליות לידת חי בריאה באמצעות העברה עוברים יחיד euploid ^{2, 3.}

Vitrification העובר Murine פותח באמצע 1980 ^{4, 5} ומותאמת חקלאות בעלי חיים ב -1990 ^6. בהתבסס על ההנחה כי פתרונות vitrification להקים מדינת glasseous metastable, ללא פגיעת היווצרות קרח קריסטל, היא הוכיחה בצורה יעילה יותר לשמור על שלמות הסלולר השלמה של עוברים. מעניין לציין, כי קבלת המבטיח של vitrification לתוך אמבריולוגיה אדם לא החלה להתממש עד המאה ה ^-21. פרסומים מוקדמים קידום שימוש vitrification התרחשו במקביל להתפתחותה של התקני מערכת "פתוחים" ייחודיים ^{7, 8, 9.} עם זאת, אימוץ vitrification לתוך פרקטיקה קלינית היה איטי, כפי שהוא בא בזמן שיפורי הקפאת הבלסטוציסט איטי גם התרחשו. הקפאה איטית ממדרגה קונבנציונלית מוצלחת, בנוסף vitrification, העולה בקנה אחד עם שיפורים במערכות תרבות העוברת, כמו גם עם incorporatיון של גישות blastocoele-קורסת, שהגדיל את רמת ההישרדות הכוללת הן של trophectoderm, ולאחר מכן, השתלה ^10.

בעשור האחרון, טכנולוגיית vitrification החליפה שיטות הקפאה קונבנציונליות במהירות. במידה רבה, זה היה עקב ההתפתחות של מכשירי vitrification מיוחדים. יתכן שחלק מהמכשירים הללו נכה הבטיחות, היעילות הכוללת של vitrification הקליני על ידי החדרת פגמים בעיצוב טבועים מכשירים המשמשים בתעשיית IVF ^11. ואכן, את הדקויות של מכשירים שונים להציג וריאציה טכנית משמעותית בין תוכניות, המכונית גם "חתימות טכניות" ^12. לפיכך, כתבי עת מדעיים, כמו Journal of ניסויים דמיינו (יופיטר), יכול לשמש משאב יקר ערך עבור הוכחת פרטים טכניים, אשר יסייע להפחית וריאציה התוצאה. בעיה מתמשכת נוספת היא כי הסעיףשתי embryologists ממשיך להיות מידע מוטעה, גם היום, על בסיס הטענות כי "קירור אולטרה-המהיר של עוברים או ביציות בתוך 'מערכת vitrification פתוחה" (כלומר, קשר עובר ישיר עם חנקן נוזלי (LN ₂₎₎ הוא תנאי הכרחי כדי אופטימיזציה אחוזי הצלחה. " האמונה ברורה, זה לא מדויק, מבוסס על ההצלחה המוכחת של ספטית סגורת מערכות ^{13, 14, 15.}

בהתבסס על עקרונות cryobiological של vitrification, את היעילות של vitrification היא יותר גבוה בהתחשב בשעורי התחממות מאשר על קירור שיעורים ^{16, 17, 18.} באופן כללי, ללא תלות בהתקן vitrification בשימוש, שיעור ההתחממות יעלה את קצב הקירור להבטיח בהישרדותם. שיעורי התחממות גבוהים למזער את ההזדמנות עבור כל צמיחת קרח (כלומר, recrystallization של זיהומים בעלי גרעין בפתרונות-קריו) בשלב devitrification של ההתחממות. אמנם, יציבות פתרון vitrification (כלומר, הסוג וריכוז סוכני cryoprotective בשימוש) עשויה להיות השפעה מבלבלת, אבל זה מופנה בפרסום נפרד ^11. בהתחשב בעיות קצב הקירור מחמם, vitrification MicroSecure (מיקרו-שניות-VTF) פותחה בשנת 2008 שיטה זולה, לא מסחרי, FDA תואמי אופטימיזציה ההיבטים-בקרת איכות של vitrification. זה היה ייחודי בכך שהוא הציע לחבל הוכחה, הפנים, תיוג כפול בצבע. יתר על כן, על ידי טעינה ואחסון עובר ישירות flexipette סטרילי משמש pipetting (כלומר, ללא pipetting למשטח התקן משני) ועל ידי שימוש בקשיות ionomeric-שרף לחלוטין חותם לרתך באמצעות אוטם אוטומטי, וריאציה טכנית מוגרת ביעילות.

בהערכות גompleteness של מכשירי vitrification לשימוש פוטנציאלי, ישנם גורם בקרת איכות כמה שצריך להילקח בחשבון, כולל: 1) תיוג תוויות "בסדר." "החנות פוטנציאל להיות דבקות בצורה מאובטחת? האם הם tamperproof? האם הם מציעים פוטנציאל זיהוי כפול צבע? האם זה דורש תווית משנית, והוא יכול התווית להסירו בקלות לצורכי רישום ומעקב (כלומר, אימות חולה) שלאחר ההתחממות? 2) בקלות טכנית עוברת "בסדר." "החנות לטעון בקלות לתוך / על גבי המכשיר במועד וזיהה פשוט ואיתר מחמם פוסט? 3) פשטות פרוצדורלי / נשנה -Does פשטות הצעת vitrification השיטה ואמינות המאפשרת בקלות עבור דירות, אשר ממזערת את השונות בין טכנאים (פנימיים) ותוכניות (חיצוניות)? 4) קיבולת אחסון LN ₂ "בסדר." "החנות המכשירים להיות בקלות ובבטחה טיפל וזיהה? האם שלהם STOזעם פוטנציאל המרחב ביותר? האם מציעים אבטחה ובטיחות המכשיר מפני נזק פיזי או מזהמים אפשריים כמערכת סגורה ספטית? 5) פוטנציאל Recovery / שרידות -זה עיצוב המכשיר נוטה בעיות פוטנציאליות בהתאוששות המובטחת של עוברים, האם הם מהימנים לַהֲפוֹך לִזְכוּכִית ולשמור שלמויות הסלולר להשלים מחמם פוסט? חשש האיכות הספציפית האחרון, קצב ההתאוששות, למעשה מוזער מפתיע בדוחות שפורסמו; זה נעשה על ידי הסתרת התוצאה השלילית בדרך כלל (כלומר, עובר או ביצה אבודות) בשיעורי הישרדות בדרך כלל-טובים. כל מכשיר נוטה להחלמה עקבית (<99%) הוא פגום ברצינות מהווה התחייבות פרוצדורליים.

ספטית, נסגרה שיטה מיקרו-שניות-VTF פותחה אסטרטגית לתת דין וחשבון על כל מידה בקרת איכות. עם זאת, לאחר 5 שנים של הצלחה קלינית מעולה ואימות ^14, ההליך היה לאo להיות שונה. הקשיות העובר 0.3 מ"ל המקורי (בעל תקע הידרופובי) הוסרו מתעשיית IVF והחליפו עם קש זרע 0.3 מ"ל בעל תקע סטנדרטי כותנה / PVP (כלומר, relabeled כקש זרע / העובר). נייר פרוצדורליים זה מתאר את הצעדים ואסטרטגיות הספציפיים הדרושים כדי ליישם מיקרו-שניות-VTF בבטחה, בפשטות, ביעילות. יתר על כן, אנו מדגישים את השינוי (ים) צריך לתת דין וחשבון מהימן עבור מגבלות היצע, עד הזמן אפשר אריזת קש אידיאלית חלופית מחדש בחזרה למעבדה הקלינית.

Protocol

התפתחות ההליך מיקרו-שניות-VTF נערך במסגרת הדירקטוריון סקירה מוסדיים אושרה מחקר (IRB) בשנים 2008-2009 (Aspire IRB, סנטי, קליפורניה) על הביצית האנושית cryopreservation העובר. ההליך מאז יושם באופן שגרתי לטיפול הקליני של מטופלי פוריות שחתם על טופס הסכמה מדעת.

1. שיקולי בקרת איכות

1. השתמש בצבעים שונים (למשל, עטים, מדבקות, או זיהוי (ID) מוטה או אטמים) להבחין חולים אם cryopreserving יותר מקבוצה אחת של עוברת בתוך יום.
2. השתמש מנות טפטפות שונות לכל מטופל ומטופל. מזער נפח בינוני הועבר בעת הזזת blastocysts מפתרון אחד למשנהו.
3. Cryopreserve הבלסטוציסט אחד לכל קש או מכשיר. לשמור על הטכניקה aseptic / סטרילי לדבוק כל הוראות הבטיחות.
4. אשר את טופס הפנייה 'רופאים וחתם הסכמת החולה לפני initiating ההליכים. בדוק את אופיו של העובר של המטופלים (ים) במלאי.
5. השתמש "שחרור החבות והסכמה התחבורה" אם blastocysts יועברו למתקן כליאה אחר. ודא שכל חתימות עדים באתר או נוטריונים.
6. אשר מדדי איכות-בקרה נאותה לטווחים הבינוניים תוספי חלבון, על פי הצורך, כולל bioassays, קביעות רעלן פנימי, ופקיעת / אימות ממספרת ומעקב.
7. נקבע מסגרות קריטית (כלומר, רמות נמוכות של דאגה) לניטור תוצאת cryopreservation קליני והערכה, כגון שיעורי החלמה: <95%, שיעורי הישרדות: <80%, ושיעורי הריון קליניים באמצעות blastocysts חד euploid: <50%.

2. נוהל Cryopreservation

1. הכנה
   1. השלם את הניירת המתאימה, כולל הזנת נתונים לתוך גליונות עבודה ובסיס הנתונים cryopreservation ויומן המלאי(ים).
   2. הכן פתרונות cryopreservation טריים או להשתמש במקור מסחרי (יתנגד תנאי חיי מדף האחסון המומלצים על ידי היצרן).
   3. הכנה קש.
      1. פתח את צד התיוג של מנות סטרילי אישיות. לנתק את זרבובית המילוי המופיעה על גבי הקש העובר 0.3 המ"ל המסורתי ידי אחיזה אותו נגד האריזה חלקית הרמה ומושך את הקש החוצה; זה יחשוף סוף התווית לתנאי סביבה בעוד הקש מוטל בסביבה נקיה מחיידקים בתוך חבילת הפלסטיק.
         1. (שינוי) עבור 0.3 מיליליטר זרע / קשיות עוברת, לדחוף את תקע ירידה של 0.5 סנטימטר. החל חותם פנימי מול תקע הכותנה-PVP דרך שימוש אוטם דחף שולחן בסיסי.
         2. הגדר את הקלוע על משטח טפלון של האלקטרודה, ממש מול התקע. לדכא את הידית כדי להפעיל את החום. שחרר את הידית כאשר האור האדום מופיע. כדי להבטיח חותמים לרתך מלא, חום בטמפרטורה כי מספיק flattens משטחים מנוגדים, ואז להעיף אותו מעל 180 ° ו reseal פני השטח מול ¹⁹ לפי הצורך.
   4. באמצעות cryomarker, כל תווית קש / מכשיר cryogoblet עם שם החולה, מספר זיהוי ייחודי (למשל, SSN, תאריך לידה, מספר תעודת זהות או מטופל), לבין מועד הקפאה. כמו כן כולל מספר ייחודי על כל מנה ומנה / מכשיר (למשל, 1, 2, 3, וכו ').
      1. אבטח את התווית (רצוי צבעוני) על מוט מזהה צבע המשוקלל להיות מוכנס וחתום לתוך קשית עובר 0.3 מיליליטר. להחזיר את הקש חבילת סטרילי הפרט שלה עד השימוש.
         הערה: אם מוטות מזהה צבע משוקלל של 30 מ"מ בלבד זמינים, אז החדרה נוספת של שני מיסבים נדרשת, סמוך כל צד של המוט מזהה.
   5. זהה כל מקל עם מספר זיהוי כתובת ייחודי. זיהוי מספר מיכל אחסון ₂ LN ומספר המכל שבו כל דגימה של המטופל (ים) יכול להיות stלטווח ארוך ored.
   6. הכינו מאכלים קריו טריים (100 מ"מ) על ידי תיוג את המשטח התחתון עם שם החולה, מספר פתרון, ואת העובר / מחזיק אגל מזהה (איור 1 א). באופן ספציפי, להקים 4 שורות של טיפות: איזוטוני HEPES שנאגרו בינוני (למעלה), V1 (פתרון איזון (ES)), V2 (פתרון ביניים (IS)), V3 (פתרון vitrification (VS); התחתון). כתוב את המזהה העובר בצד הימני העליון עם עמודות בשם.
      הערה: סדרת 25 עד 50 μL לשטוף טיפות (n = 3) משמש כדי להבטיח כי כל אדם הסופי 10 עד 15 μL מחזיק אגל / סוג פתרון (כלומר, V1, V2, או V3) הוא טהור חַי. בגישה זו, עד חמישה עוברי אדם יכול ידי מזוגג באמצעות מנה אחת. שמור כל מנה מכוסה כשאינו בשימוש כדי למנוע התייבשות אידוי בטמפרטורת החדר / של הטיפות.
   7. הכן flexipettes סטרילי על ידי חיתוך 3 ס"מ מעל הקצה לבסיסם (המכונה "טיפים VTF"). הכנס אותם על הפרטטפטפות (נקבע על 3 μL) ולהגדיר את הטיפים-VTF פיפטה זקוף מתלה צינור קלקר (1B איור).
2. בחירה העובר
   1. אשר זיהוי מטופל / דגימה.
   2. באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (200 - 400X ההגדלה), כיתה ו לסווג את blastocysts פי מערכת לדירוג גרדנר ^20, באמצעות סיווג המספרי של 1 עד 6 עבור מוקדם blastocysts בקעו, בהתאמה, וכן בכיתה א ', ב', או ג 'מוקצה אל מסת התאים הפנימית (ICM) ואת trophectoderm (TE).
      הערה: לקראת ביופסית הבלסטוציסט וניתוח euploidy, את המעטפת השקופה היא מראש בקעה ידי אבלציה ליזר ביום 3 לקדם את הפריצה מוקדם של TE והדבר דורשת סיווג לדירוג שונה ^2. בקיצור, התערוכה blastocysts מלא כיתה 3 עד 10% בקיעה TE, כיתה 4 מורחבת blastocysts הם 10 - 50% בקעו, ו כיתה 5 blastocysts הבקיעה יש> 50% TE extrusion (איור 2 א-ג).
      הערה: ההעדפה שלנו היא cryopreserve בדרגה 3 או blastocysts גבוה של איכות ≥BB ביום 5 או 6. עם זאת, blastocysts מזוגגת באיכות נמוכה יותר (C) ועוברים-הדחיסה פוסט בשלבים מוקדמים יותר (כולל מורולה מאוחר כיתה 1 או 2 blastocysts בהחלט) יכול לשרוד התחממות בשלמותו תשואת קיימא עובר מסוגל להשיג לידה חייה.
   3. כיווץ blastocoele של כל הבלסטוציסט לפני תחילת תהליך cryodilution ידי micropuncturing צומת trophectoderm או על ידי ביצוע אבלציה הדופק לייזר של תא trophectodermal ²¹ אם באמצעות פתרונות vitrification נמוכה molarity (<6.5 V M או 40% / V).
      הערה: הצורך לכווץ את blastocysts אינו מכשיר תלוי. בהתפתחות המוקדמת שלנו של מיקרו-שניות-VTF (2008), בתחילה השתמשנו אתילן גליקול (EG) / פתרונות DMSO בהצלחה עם ביציות (1 מתוך 1 הריון מלא ארוך), אלא תת אופטימלית (<80%)הישרדות / פיתוח של blastocysts עכבר ¹⁶ נחוותה על ידי אחרים ^21. מאז פתרונות גבוהים טוחנים מבוסס גליצרול (העולה 7.9 M) משמש במערכת VTF הנוכחית שלנו (מאז 2009), התמוטטות blastocoele פיזית מיותר. עם זאת, הבקיעה סלקטיבית של blastocysts בקע מומלצת בכלל.
3. טוען Cryodilution ו הבלסטוציסט
   1. הסר את צלחת תרבות החולה מן החממה לאשר זיהוי מטופל / דגימה עם אדם אחר (כלומר, עדי מקור משני) לפני הסרת העובר (ים) להיות מזוגגים.
   2. אשר הבלסטוציסט פיתוח לכל שלב 2.2.2, לעדכן את גליון הנתונים קריו, ותחת stereomicroscopy, הבלסטוציסט פיפטה (ים) מצלחת התרבות לתוך אגל ההחזקה איזוטוני של המנה קריו.
   3. להזיז כל הבלסטוציסט לטיפות החזקת פרט באמצעות flexipette vitrification (כלומר, קצה VTF).
   4. להזיז כלהבלסטוציסט לתוך V1 פתרון (ES).
      1. מלא מראש flexipette עם פתרון V1 (3 μL) ומקום בחצי את תוכנו על העובר.
      2. לשאוב את העובר ולעבור הראשון מבין שלושה V1 טיפות לשטוף (המכונה בשלב 2.1.6), פיפטה העובר 2 - 3 פעמים סביב ההיקף, ונקה את תוכן פיפטה אגל (הימנעות היווצרות בועה) או בחוץ על משטח צלחת.
   5. מלא את קצה VTF עם הירידה לשטוף V1 הבא וחזור על השאיפה של העובר (ים). חזור פעם שלישית ולעבור הבלסטוציסט (ים) האחרונים ירידה החזקה V1 הפרט. הדילול / צעדי הכביסה צריכים להימשך 30 עד 45 שניות. טרום עומס כל טיפ VTF לפתרון הבא (למשל, V2), הכנס את פיפטה במעמד, ולהשתמש פיפטה הבא (בהתאם להתקנה בשלב 2.1.7) (איור 1 ב).
      הערה: מאחר את זמן החשיפה הכולל sulfoxide הלא דימתיל (DMSO) המכיל פתרונות V1 ו- V2 הוא 5 דקות כל אחד, את pipetting של indiviblastocysts הכפול צריך ייפרס שווה בתוך המרווח הזה, בהתחשב שצעד V3 הסופי ידרוש לפחות 1 דקות לכל הבלסטוציסט לבצע. לדוגמה, אם יש 4 blastocysts בקבוצה vitrification, blastocysts פיפטה # 1-2-3-4 במרווחים 75-s.
      הערה: חברות Cryo חדשני (ICE) פרוטוקול דילול שתוארו לעיל הוא בבירור שונה מרוב נהלים vitrification מסחריים אחרים, אשר בדרך כלל כרוכים פתרונות המכילים DMSO. פרוטוקולים אלה להשיג את אותה דילולים בשלבים דרך הדרגתית, אך פחות מבוקר, מיזוג של פתרון הכביסה (כלומר, בינוני איזוטוני), ES, ו VS.
   6. חזור על שלבים 2.3.4 ו 2.3.5 באמצעות V2 (IS) פתרונות.
   7. חזור על שלבים 2.3.4 ו 2.3.5 V3 אלקטרוני (VS) פתרונות.
   8. לאחר הצבת כל הבלסטוציסט ב אגל מחזיק V3, נקה את הפתרון שיורית ובועות מהקצה VTF (מחוץ אגל), ולאחר מכן למלא את קצה לחלוטין עם V3 נקי סביב העובר. Expאל כשליש מנפח (1 μL) ו פיפטה הבלסטוציסט (ים) ו הנותרים V3 לחלוטין לתוך קצה VTF.
   9. הסר את הקצה VTF מן פיפטה, לנגב את יבש קצה V3 שיורית על פני השטח החיצוני באמצעות פד גזה סטרילי, והכנס את קצה הקצה הראשון לתוך הקצה הפתוח של קש מראש שכותרתו. "טיפ יבש" הוא קריטי למניעת הדבקות קש הפנימי אפשריות.
   10. הפוך את הקש (תווית בסופו למטה), לקיים את הטיפ התקע או החותם הפנימי, ובבטחה לאטום את הקצה הפתוח עם 1 סנטימטר של מרחב אווירי. רצוי השתמש במכשיר איטום אוטומטי (למשל, סימס לי) לחסל וריאציה טכנית.
       הערה: היתרון של שימוש בקשיות המורכבים של פלסטיק שרף ionomeric (למשל, HSV או מיקרו-שניות-VTF) היא כי באמצעות חום כלשהו כמו שצריך המופעלים איטום המכשיר יוצר חותם "לרתך" אמין, כאמור בשלב 2.1.3.1.
   11. לאחר אטום, לצלול הקש הסגור ישירות לתוך LN ₂ בתוך נירוסטה מזפלדת ESS בקבוק דיואר ומקום הקש (ים) לתוך הגביע הפתוח המצורף של קני החולה לאחסון.
       הערה: בגלל קשיות מיקרו-שניות-VTF להשתמש 40 מ"מ מוטות מזהה המשוקלל על מנת לאזן את כוח העילוי של קש מלא אוויר, השימוש גביעי הפוכה או cryovials ריק כדי לכסות את הדגימה (ים) אינה נדרשת אלא אם כן תחבורה מעורבת.
4. מחמם Elution קריו פתרון / דילול
   1. אשר את טופס הפנייה 'הרופאים לגבי מועד חזרת עוברים מזוגג, ובשעה שנקבעה, ופרטים עוברים (מספר להפשיר / העברה, מספר עובר ספציפי אם PGS נבדק, וכו').
   2. הכינו פתרונות להתחממות טריים (1.0 M סוכרוז פתרון המניות) ו / או להשתמש במקור מסחרי (מומלץ 1 שבוע-1 חודש חיי המדף פעם בשימוש, 4 ° C אחסון).
      1. Aliquot 17.1 גרם של סוכרוז לתוך צלוחיות סטריליים 50 מיליליטר עם פתיחה ראשונית (למשל, מקור אספקה שבועי) בשל הסיכונים של הצטברות רעלן הפנימית ב גרא סוכרוזnules בחשיפת הסביבה חזרה.
      2. מערבבי סוכרוז פרטני טרום שקל לתוך פתרון (1.0 מ 'מניות = 3.42 גר' / 10 מיליליטר של HEPES שנאגר נוזל תובל אדם [H-HTF]) ולחמם את הפתרון עד 37 ° C כדי להגדיל את המסיסות של הגרגרים. שוב ושוב להפוך את המכל כדי לעזור להאיץ ולהשלים את הערבוב הסופי.
         הערה: סינון (מסנן 0.22 מיקרומטר) שבוצע באמצעות יחידות סינון לחץ חיוביות מומלץ עבור פתרונות צמיגים (> 0.5 M סוכרוז) או כמויות גדולות. משאבות לחצו יד מספיקות וזולות, ואילו משאבה חשמלית רועשת, גורם רעידות, והוא פשוט לא נדרש.
   3. חם (37 ° C) בצינור 10 מ"ל כל אחת של תמיסת סוכרוז 1.0 M ובינוניים H-HTF לחולה לשימוש באמבט ההתחממות מיקרו-שניות-VTF.
   4. הכן מאכלי הפשרה טריים (6-גם צלחת) על ידי סימון השטח המכסה עם שמו של החולה ואת מזהי הפתרון.
      הערה: במקרה זה, השתמשנו: (1) לשטוף T1 (200 μ; L ללא כיסוי שמן, (2) T1 (100 μL) עם 1 מ"ל של שמן, (3) T2 (100 μL) עם שמן, (4) T3 (100 μL) עם שמן, (5) T4 (100 μL) עם שמן, (6) T5 / 200 μL איזוטוני בינוני HEPES שנאגרו עם 10% אלבומין בסרום אדם (HSA) או 20% תחליף בסרום ללא כיסוי שמן. למרוח למטה צעד פתרון אוניברסלי סוכרוז פרוטוקול-T1 = 1.0 M, T2 = 0.5 M, T3 = 0.25 M, ו- T4 = 0.125 M-אם ICE או אחרת המקור המסחרי אינו זמין, כפי שהוצע עבור עוברים מוקפאים איטי ²² . יתר על כן, יש לציין כי לשטוף T1 הראשוני ואת equilibrations T5 הסופי יכולים להתבצע 30 מ"מ צלחות פטרי צלחת 4 היטב המשמשת צעדים 2-5 לעיל, מעורבים כשכבת נפט.
   5. להפשיר רק העובר של מטופל אחד (ים) בכל פעם.
      1. בדוק את טופס הפנייה 'הרופאים ולאשר שהמחזור מחמם את המספר הצביע (כלומר, 1 או 2 blastocysts); להעריך כדאיות הישרדות / צפויות על ידי התבוננות שינויים האוסמוטי (כלומר, SHRinkage ו התייבשות) ו קרומים שלמים, ואם בספק, לפנות לרופא ו / או המטופל לפני התחממות הבלסטוציסט אחר.
   6. אשר זיהוי מטופל / דגימה עם חבר לעבודה (כלומר, עדי מקור משני).
   7. מניח את מקל החולה בבקבוק דיואר מלא LN ₂ ולבודד לזהות את הקש כדי להתחמם.
   8. תביאו את צלחת דילול 6-היטב למרכז הבמה סטראו. הצבת צלחת 60 מ"מ פטרי בצד אחד (כלומר, תלוי-יד השמאל או ההעדפה הימנית של הטכנאי), מוסיפה את סוכרוז המחומם (1.0 M) ופתרונות H-HTF ליצור התחממות סוכרוז 0.5 M אמבטיה (חשף).
      הערה: טיפים VTF הם חיממו רק 0.5 M פתרונות סוכרוז בתור הגנה QC, כדי להבטיח את השמירה על הכדאיות העובר במקרה נדיר כי העובר הוא גורש על ההתחממות המהירה ^22.
   9. החזק את חותם הקש העליון מעל פני נוזלכדי לוודא את זהותו, ולאחר מכן אחוז ולאבטח את הקש מתחת התקע הפנימי באמצעות מספרי מאיו (קצה VTF עדיין צריך להיות שקוע LN _2).
      1. בתוקף להקיש את המספריים על בקבוק דיואר (כמה פעמים) כדי להסיר את קצה VTF מן דפנות קש הפנימיות כאמצעי זהירות QC; אם קצה VTF הוא חסיד, נחלשו התיפוף מבטיח כי בסיס טיפ טיפות עד הסוף האטום מול סוף שכותרתו, ובכך לספק חלל אוויר ליד קצה המחבר.
   10. הרם את הקש עם המספריים לתוך אוויר הסביבה במצב אופקי (ליד או מתחת לפני שטח סטריאוסקופ) לתפוס את הקצה שאינו שכותרתו (תווית לצד ימין). חותך את הקש בבית התקע הפנימי או לאטום ולהרים אותו מעל צלחת אמבטית ההתחממות. יוצקים את קצה VTF לאמבטיה סוכרוז חם בזווית 60 מעלות עד הנמתח לחלוטין כבר התחמם במהירות (> 6,000 ° C / min); בבסיס flexipette ינוח מעל דפנות הצלחת.
       1. אפשר ti VTFp כדי נפילה חופשית לתוך האמבט. לטפוח בעדינות את משטח הקש העליון אם הקצה אינו מייד להתגלות. אם זה מופיע רק בחלק מן הדרך, לסייע שחול ידי אחיזה פיר של flexipette עם מספריים או מלקחיים בסדר.
   11. אחרי 5 - 10 שניות, לתפוס את בסיס פיפטה ולהכניס לתוך מכשיר pipetting פנוי; חור הנורה פועלת לשחרר את הלחץ על הכניסה. מכסים את החור הנורה עם האצבע בעדינות לסחוט את הנורה כדי לשחרר את הבלסטוציסט מזוגגת לתוך לשטוף T1 (# 1) תוך כדי צפייה על ידי stereomicroscopy. לאחר אשר, נקה את V3 שיורית (VS) הפתרון ובועות על ידי הפעלת לחץ חיובי, פינוי התכול למרכז, שנזרק בשימוש גם. התחל טיימר 5 דקות.
       הערה: כל שלבי דילול סוכרוז מבוצעים בטמפרטורת חדר (21 ± 2 ºC).
   12. הסר טיפ VTF והנח אותו על פיפטה. המשך על ידי ההעברה העובר לתוך T1 # 2 תחת שמן בפעם הנותרת (כ 3 - 4 דקות).
       1. אם הבלסטוציסט שני דרוש להעברה, מייד לחמם קשית שנייה קצה VTF (חזרה על שלבי 2.4.9 - 2.4.11) מהחולה לפני ביצוע צעד 2.4.12. להזיז את שני blastocysts יחד במשך elution מינימום T1 (1.0 M סוכרוז) של 3 דקות לפחות.
   13. טרום למלא את flexipette לפתרון הבא, ולאחר מכן להעביר לדלל הבלסטוציסט (ים) ב- T2, T3, T4 ו במרווחים 3-דקות. אם המעטפת השקופה טרם לייזר ablated בעבר (קרי, בקעו), עשו זאת T4. מניח את הצלחת לבמה של מיקרוסקופ הפוכה ותמונה העוברת על צג מחשב. יישר את Zona בתוך עיגול אדום המיועד ולהפעיל 2 או 3 דחפים של דיודת לייזר (החל בקצה החלל perivitelline ומרגש החוצה) כדי ליצור פתח ^{2, 19.}
   14. לאזן את blastocysts ב T5 (כלומר, בינוני איזוטוני) במשך 5 דקות על משטח חם (37 מעלות צלזיוס).
   15. להעריך את ההישרדות העוברת הראשונית בוסס על הנוכחות הדומיננטית של קרום תא שלם עם אף, שקוף cytoplasms נטול מחשיך pyknotic. מניחים את העובר (ים) לתוך התרבות 2 - 6 שעות לפני החזרת העוברים, בו בזמן, את / הישרדות פיתוח העובר צריך להיות הערכה מחדש ותיעד.
       הערה: אם יותר מ -1 הבלסטוציסט קיימא קיים במועד ההעברה ואת המטופל בוחר להמשיך רק 1 הבלסטוציסט, הבלסטוציסט משלים אז יכול להיות מחדש מזוגגת בהצלחה (rVTF) על ידי חזרה על שלבים 2.3.3 - 2.3.11. יש לנו כמה אשרה לידה חייה בעקבות אירועים יחידים rVTF.
       הערה: rVTF שבוצע עד ניסיוני 5 פעמים ללא השפעה משמעותית על ההישרדות / הכדאיות של blastocysts אדם aneuploidy המזוגג בתמיסת metastable מבוסס גליצרול.

תוצאות

1,341 blastocysts מזוגגת היו מחוממים בין השנים 2012 עד יוני 2014, ו 1,341 עוברים התאושש (100%) בעוד 1,316 שרדו (98.1%). blastocysts ביופסיה חווה במהלך הישרדות 99.5%. עם העברת יחיד, גנטי נבדק בעיקר, euploid, עובר מזוגג, הצלחנו להשיג חלק משיעורי ההשתלה הגבוה ביותר ושיעורי לידת חי בארצות הברית, ללא קשר לגיל (איור 3) ^20, על פי סטטיסטיקה לאומית האחרונה דווחה על ידי המרכז לבקרת מחלות וחברת טכנולוגיות רביית Assisted (לוחות 1 ו -2). הערכת אוכלוסייה חולה פרוגנוזה טובה (פחות מ 35 שנים) לאופני cryopreserved לבד (טבלת 1), במעבדה שלנו ביצועים טובים יותר מהממוצע הארצי הוא שיעורי ההשרשה (כלומר, את היעילות של עובר להקים הריון) ובסופו של דבר לחיות שיעורי ילודה על ידי למעלה מ -30%. בנוסף, אימות / אימות ראשו של קשיות האחסון השונות שלנו באמצע -2014 באמצעות 70 blastocysts מחקר הסכים, מחדש מזוגגים aneuploid הביאה התאוששות של 100% ו -100% הישרדות.

איור 1. הגדרת MicroSecure VTF. מנת VTF (א) מורכבת עם 3 שורות נפרדות של פתרונות vitrification, אשר מנצלות 3 טיפות לשטוף לפני השמה בטיפות החזקה ברורות, ממוספרות. בנוסף, טפטפות פרט עם טיפי VTF מקוצרים (כלומר, 300 מיקרומטר מזהה flexipettes) מובטחות ומאורגנות מתל צינור קלקר (B), אשר ניתן לסובב לשימוש מסודר. שימו לב הרכבת pipetting micropipette נורה פנויה נציג נחה על מדף הקלקר. arget = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. השתנה הבלסטוציסט דירוג המערכת. המערכת לדירוג הבלסטוציסט גרדנר שלנו שונה מהווה פריצת המושרה של תאי TE כדי להקל ביופסיה הבלסטוציסט. שינוי רואה הבקיעה המוקדמת של blastocysts המלא (A: כיתה 3 = פחות מ בקיע 10%) ו blastocysts המורחב (B: כיתה 4 = עד 50% בקיעים), בעוד הבלסטוציסט בקיע (C) יש יותר מ -50% בקיעים ^16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

54871fig3.jpg "/>
איור 3. תוצאות הריון השוואתיות. במהלך מרווח 1.5 שנתי מצטבר, נתונים ההריון הושוו להעריך את ההשפעות של העברת blastocysts euploid מזוגגת חימם (n = 172 מחזורים / 144 העברות) לעומת מחזורי שאינו PGS (n = 160 מחזורים / 153 העברות) מעורבים בעיקר טרי מעביר ^18. לצורך הניסוי שלנו, נתונים אלה עולה בבירור כי blastocysts ביופסיה מזוגגת ידי הליך מיקרו-שניות-VTF לשמור על כדאיות שלהם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מקור מידע	מחזורים #	Mean # של עוברי העבירה	מחירי השרשה (%)	מחירי לידת חי (%)
מעבדת NB *	144	1.2	74.00%	74.50%
לאומי ממוצע	20,423	1.7	39.60%	44.10%
* נתונים היו בממוצע מבוסס על ביצועי 2014 פוריות אורנג 'קאונטי, מרכז פוריות דרום קליפורניה והמרכז דרום קליפורניה עבור מרפאות לרפואת פוריות באמצעות המעבדה לפוריות Ovation הנוכחי (Lab NB) אשר ייסד את ההליך vitrification microSecure בשנת 2008.

לוח 1. 2014 CDC Assisted Reproductive לסטטיסטיקה. נתוני הריון העובר העברה קפוא של נשים מתחת לגיל 35 שנים משלוש דיווח מרפאות רופא בעזרת מעבדת NB שלנו בהשוואה לממוצע הלאומי של ארה"ב 2013 של מעל 450 מרפאות דיווח.

הממוצע הארצי סארט
מרפאת - מדינה	נשים	נשים	נשים	נשים
	<35 yrs	35-37 yrs	38-40 yrs	41-42 yrs
SCCRM-CA *	63.1%	58.3%	40.6%	32.3%
CCRM-CO *	64.7%	61.5%	40.4%	32.2%
RMA-NJ *	63.2%	59.7%	34.6%	18.7%
לאומי ממוצע	48.6%	38.3%	24.3%	12.3%
SCCRM-דרום קליפורניה המרכז לרפואת פוריות; CCRM-קולורדו המרכז לרפואת פוריות; ו RMA-ReprodAssociates לרפואה uctive
* מרפאות מובילות אלה יש את כל בעיקר מיושמים מחזורי חזרת עוברת מזוגגים, בשיתוף עם בדיקות גנטיות preimplantation, לפועל שלהם רמת הטיפול המטופל כדי לייעל הצלחת לידה חייה לכל עובר המושתל.

טבלת 2. 2014 שיעורי לידה חי מצטברים, כפי שדווח על ידי אגודת טכנולוגיות רביית Assisted (סארט), עבור 'מרפאת SCCRM בעזרת מעבדת פוריות Ovation שלנו בניופורט ביץ', קליפורניה, בניגוד מספר תוכניות מכובדות אחרות, כמו גם עם סארט ממוצע ארצי.

Discussion

היום, קיימת ציפייה גבוהה של השגת הישרדות הבלסטוציסט מלאה (> 95%) והשיג הצלחת השתלה דומה לזה של עוברים טריים. קבוצות אחדות הציעו כי שיעורי לידת חי מחזורי חזרת עוברת מזוגגים הם אולי אפילו גבוהים יותר מאשר blastocysts הטרי כאשר העובר cryopreserved שלמים המושתל לתוך רחם בריא, שאינו הורמונלי מגורה. הנתונים שלנו מצביעים בבירור כי vitrification ביעילות ובאמינות שומרת את הכדאיות של העובר הטרי. יתר על כן, הוכחנו כי ספטית שלנו, שיטה סגורה, שנקרא vitrification MicroSecure (מיקרו-שניות-VTF), יכול להשיג תוצאה אופטימלית דומה או גדול יותר סטנדרטים מסחריים (כלומר, מערכות המכשיר פתוח) המשמש בתעשיית IVF.

וריאציה קשורה דירות טכניות ואמינות בין אנשים באמצעות שפע של מכשירי vitrification / שיטות. לעומת זאת, זה הביא inconsistencies בין תוכניות החלת vitrification. לכן, אין זה מפתיע כי היכרות מכשיר הוא גורם חשוב לגבי בקיאות מעבדה ותוצאות מוצלחות. זהו זה רעיון של "חתימה טכנית" ¹¹ זה מסביר למה דירות בין התוכניות עשויות להיות בעייתיות. לא רק יש את הפיתוח של יותר מתריסר מכשירים מסחריים מסובך תופעה זו, זה יצר בעיות בקרת איכות. למרבה המזל, סגור מערכות vitrification, כמו מיקרו-שניות-VTF, ראפיד-לי, וכאילו VitriSafe, נמצאים כעת להוכיח להיות יעיל באותה מידה לפתוח מערכות המכשיר ^{12, 13, 14.}

MicroSecure VTF היא טכניקת vitrification רומן, מזוהם פתחה בקלות טכנית, אמינות, אבטחת קריו בראש. על ידי שילוב של השימוש בשני-שאושרו בעבר, התקני ה- FDA תואמים, מדוברת במערכת vitrification לא מסחרי wה- i היתרון המובהק של בעל עלות נמוכה הוקמה, בניגוד התקנים מיוחדים. בנוסף, tamperproof הייחודי מערכת תיוג הכפולה בצבע הפנימה, כמו גם יתרונות בקרת איכות רבות אחרים, הפכו מיקרו-שניות-VTF ¹¹ אפשרות העולמית אטרקטיבית. בתור מכשיר VTF שאינו מסחרי, עם זאת, יישום התעשייה הענף שלה מתפתח לאט. רק דרך המשך פרסום של בטיחות, ביטחון, ואת היעילות הקלינית תרוויח מיקרו-שניות-VTF גדל ניצול.

בחודש אוגוסט 2014, כאשר הוא מתמודד עם חוסר היכולת לרכוש את קש העובר 0.3 מ"ל המקורי מיוצרים עם תקע הידרופובי הפנימי, הלא הפתילה, הצלחנו לשנות את השיטה מיקרו-שניות-VTF באופן מהימן. בקיצור, קשיות 0.3 מ"ל זרע / העובר החדש עם אטמי כותנה-PVP שלהם הותאמו ביעילות. זו הושגה פשוט על ידי יצירת חותם פנימי לפני תקע הכותנה, ובכך למנוע מגע נוזל הפתילה עםפתוח קצה VTF (כלומר, flexipette המכיל את העובר או ביצים). יתר על כן, אם מוטות מזהים 40 מ"מימ אינן נגישות, נושא הציפה הקשורים מוטה 30 המ"מ הבהיר ניתן counterweighted באמצעות שני מיסבים.

צעדים נוספים אלה הפכו את הטכניקה מעט פחות פשוטה, אבל עדיין יעיל מאוד. היום, כלכלה ויעילות הופכות דאגות חשובות יותר ויותר, כמו blastocysts ביופסיה בדרך כלל מזוגגות בנפרד, עד מצב euploidy שלהם הוא אשר על דו"ח גנטיקה. Blastocysts עם מעמד aneuploidy לא-ישים אשר בדרך כלל נמחק, בהסכמת מטופל, תוך מספר שבועות. כך, רוב (> 50%) של התקני VTF מבוטלים לאחר אחסון לטווח קצר, גרימת בעלות שנתית הסלמה כאשר משתמשים במכשירים מסחריים. בסך הכל, מיקרו-שניות-VTF היא הליך מאוד יעיל, אמין, הדיר עבור cryopreservation של blastocysts האדם. Securel עיצוב בקרת איכות מעולהתוויות y ובבטחה המאחסן עובר / ביציות תוך ביטול כישלון התאוששות ואופטימיזציה הישרדות כדאיות מחממים פוסט, אשר מצדיקה את השימוש של המערכה כגישה אוניברסלית vitrification העובר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cane	IVM	XC055
Ball bearings, 3/32"	VXB.com	KIT15977	stainless steel
CBS semen/embryo straw, 0.3ml	CryoBioSystems	25292	individual sterile
Color, ID rods, 30 mm	CryoBioSystems	019021-26	weighted
Culture tubes, 15ml	Falcon	352099	Conical
Culture tubes, 10ml	Falcon	352057	Snap-cap
Cryosleeves	Nalgene	5016-001
Filter, 250ml	Fisher Sci.	09-740-2A	0.22 μm
Flasks, Tissue Culture 50ml	Falcon	353014
Flexipettes, 300μm ID	Cook Med.	K-FPIP-1300-10BS-5	Sterile, 20/pack
Forcep, Large	Miltex	6-30TC
Forcep,Splinter - fine	Miltex	17-305
Goblet	IVM	PA003
Heat Sealer, SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110V or 220V with adapter
Hepes-buffered media	Life Global or	LGGH-100; 100ml,  or	stored at 2-8ºC
	Irvine Scientific	H-HTF; 90126; 100ml	with non-essential AA's
Labels, Cryo	GA International	CL-23T1	Various colors
Liquid Nitrogen Tank, 40L	MVE or Taylor Warton	various	liquid storage
LN2 Dewar flask, 0.5L	Hampton Research	HR4-695	Stainless steel
6-well Custer Dishes	Biogenics	015/020	plasticware by case
Pipette Bulb, Micro Cap	Drummond	Fisher#13681451	Hole on bulb apex
Petri Dishes, 35mm	Falcon	351006
Petri Dishes, 58mm	Nunc	150288
Petri Dishes, 100mm	Falcon	351029
Pipette Tips, ART long	Fisher Sci.	02-707-80	10-100μl
Pipet Aid	Drummond or Falcon	various	rechargeable
Pipetting Device, Stripper	Cooper Surgical	MXL3-STR
Pipettes, Serological 1ml	Falcon	357521
Pipettes, Serological 2ml	Falcon	357507
Pipettes, Serological 5ml	Falcon	357543
Pipettes, Serological 10ml	Falcon	357551
Scissors, Surgical Mayo	Miltex	5-SC-16
Stereomicroscope	Nikon, Olympus, Leica	various
Sterile Gauze pads, 4"x4"	Kendall Healthcare	6939
Synthetic serum	Life Global or	LGPS-20 ; 20ml,  or	stored at 2-8ºC
	Irvine Scientific	SS-99193; 12 x 10ml	purchase low endotoxin lot
Sucrose	Sigma Chemical Co.	#S9378	Aliquot into 50ml flasks,  1year
			17.1g/flask +Medium to 50ml
			makes a 1M solution
			Filter with 0.22µm unit
Timer	Nalgene	5016-001
Thawing  Solution	Innovative	BL-TS	T1, T2, T3, T4
	Cryo Enterprises	(≤1.0M Sucrose)	stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening
Vitrification  Solution*,**	Innovative	BL-VS	V1, V2, V3
	Cryo Enterprises	(≥7.9M [Glycerol/EG])	stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening
			* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate
			** other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8M),  but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2M).  Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution.  Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property.