Modificato vetrificazione MicroSecure: Un altamente Procedura Crioconservazione sicuro ed efficace, semplice e per blastocisti umane

Riepilogo

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

Abstract

Clinical embrione vetrificazione si è evoluto con lo sviluppo di dispositivi di vitrificazione unici nel 21 ^° secolo e con l'idea sbagliata che ultra-rapido raffreddamento in un sistema "aperto" (cioè, diretta LN ₂ contatto) era una necessità per ottimizzare il successo vetrificazione. Il dogma che circonda l'importanza della velocità di raffreddamento ha portato a pratiche pericolose soggette a variazioni tecniche e alla creazione di dispositivi vitrificazione che disattese importanti fattori di controllo della qualità (ad esempio, la facilità d'uso, la ripetibilità, l'affidabilità, la sicurezza di etichettatura, e la sicurezza di stoccaggio). La comprensione dei difetti di controllo di qualità di altri dispositivi consentiti per lo sviluppo di un metodo di mS-VTF protetto, sicuro, ripetibile e affidabile l'obiettivo di ridurre al minimo variazioni nelle e tra-tecnico. Altrettanto importante, ha unito la disponibilità di due dispositivi FDA conformi esistenti: 1) un 0,3 mL ionomerica paglia resina embrione con interiorizzato, a due colori, manomissione-petichettatura tetto con ripetibile potenziale sigillo di saldatura; e 2) abbreviato, comunemente usato, ID 300 micron flexipettes sterili per caricare direttamente l'embrione (s) al fine di creare un dispositivo vetrificazione globale altamente efficace. Come altri asettica, chiusi sistemi vetrificazione (ad esempio, alta sicurezza vitrificazione (HSV), Rapid-i, e VitriSafe) efficacemente utilizzato in medicina riproduttiva, microSecure vitrificazione (mS-VTF) ha dimostrato di poter conseguire un livello elevato di sopravvivenza post-riscaldamento e gravidanza risultati con la sua attenzione alla semplicità, e ha ridotto la variazione tecnica. Anche se la paglia dell'embrione 0.3 mL contenente una spina idrofobico interno è stato sostituito in commercio con una cannuccia sperma normale possedere cotone-polivinilpirrolidone (PVP) spine, ha mantenuto la sua composizione di resina ionomerica per garantire la tenuta della saldatura. Tuttavia, i tappi di cotone possono stoppino il contenuto liquido-embrione del flexipettes al contatto. Metodo mS-VTF modificato è stato adattato per includere una saldatura interna aggiuntivasigillare prima la spina sul lato dispositivo di caricamento. Il passo tecnico aggiunto alla procedura di mS-VTF non ha colpito la sua applicazione di successo, i tassi di sopravvivenza più in alto (> 95%) e tassi di gravidanza continuano oggi.

Introduzione

La vitrificazione è la tecnologia assistita più incisivo unico riproduttiva nel settore fecondazione in vitro (IVF) in quanto lo sviluppo di iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo. Oggi, blastocisti sono crioconservati senza la perdita di vitalità degli embrioni precedentemente associati ai tradizionali metodi lento congelamento ^1. Con affidabile di post-riscaldamento embrione di sopravvivenza, l'industria infertilità sta trasformando in uso preferenziale dei cicli di trasferimento di embrioni crioconservati, che danno esiti della gravidanza simili o superiori rispetto trasferimento tradizionale embrioni freschi. In collaborazione con blastocisti biopsia e screening genetico preimpianto (PGS), vetrificazione è diventato uno strumento di vitale importanza clinica per ottimizzare sani nascita risultati in tempo reale tramite euploid singolo trasferimento di embrioni ^{2, 3.}

Murino vetrificazione degli embrioni è stato sviluppato a metà degli anni 1980 ^{4, 5} e adattato agricoltura animale entro il 1990 ^6. Sulla base della premessa che le soluzioni di vetrificazione formano uno stato glasseous metastabile, senza danneggiare la formazione di cristalli di ghiaccio, si è dimostrato di preservare più efficacemente l'integrità cellulare completa di embrioni. È interessante notare che l'accettazione promettente di vetrificazione in embriologia umana non ha cominciato a realizzarsi fino al 21 ^° secolo. I primi pubblicazioni che promuovono l'uso di vetrificazione coinciso con lo sviluppo di dispositivi di sistema "aperto" unici ^{7, 8, 9.} Tuttavia, l'adozione di vetrificazione nella pratica clinica era lento, come è venuto in un momento miglioramenti congelamento lento blastocisti avvennero anche. Successful convenzionale lenta velocità di congelamento, oltre alla vetrificazione, sono state allineate con i miglioramenti nei sistemi di coltura dell'embrione, nonché con la Incorporationi di approcci blastocele-collasso, che ha migliorato sia la sopravvivenza globale di trophectoderm e, successivamente, l'impianto ^10.

Negli ultimi dieci anni, la tecnologia si è rapidamente soppiantato vetrificazione pratiche di congelamento convenzionali. In larga misura, ciò è dovuto allo sviluppo di dispositivi vitrificazione specializzati. Alcuni di questi dispositivi hanno ostacolato la sicurezza generale, l'efficienza e l'efficacia della vetrificazione clinica con l'introduzione di difetti di progettazione inerenti ai dispositivi utilizzati nell'industria FIV ^11. Infatti, le sfumature di diversi dispositivi introducono significativa variazione tecnica tra programmi, comunemente indicato come "firme tecniche" ^12. Così, riviste scientifiche, come il Journal of Experiments visualizzate (JoVE), può servire come una risorsa preziosa per dimostrare i dettagli tecnici, che contribuirà a ridurre le variazioni risultato. Un altro problema in corso è che some embriologi continuano ad essere male informato, ancora oggi, sulla base delle domande che il "ultra-rapido raffreddamento di embrioni o ovociti in un 'sistema di vetrificazione aperto' (vale a dire, il contatto embrione diretto con azoto liquido (LN ₂₎₎ è un prerequisito per l'ottimizzazione i tassi di successo. " Chiaramente, questa credenza è imprecisa, basato sul comprovato successo dei asettica sistemi ^{13, 14, 15} chiuse.

Sulla base dei principi cryobiological di vetrificazione, l'efficacia di vetrificazione è più altamente dipendente tassi di riscaldamento che su tassi ^{16, 17, 18} di raffreddamento. In generale, indipendente dal dispositivo vetrificazione utilizzato, il tasso di riscaldamento deve superare la velocità di raffreddamento per assicurare alti tassi di sopravvivenza. Alti tassi di riscaldamento riducono al minimo la possibilità di una crescita del ghiaccio (vale a dire, il Recrystallization di impurità nucleate in crio-soluzioni) durante la fase di devetrificazione del riscaldamento. Certo, la stabilità della soluzione vetrificazione (cioè, il tipo e la concentrazione di agenti crioprotettivi usati) può avere un effetto di confusione, ma questo viene indirizzato in una pubblicazione separata ^11. Considerando i problemi di velocità di raffreddamento-riscaldamento, MicroSecure di vetrificazione (mS-VTF) è stato sviluppato nel 2008 come un metodo poco costoso, non commerciale FDA-compliant che ottimizzato gli aspetti di controllo di qualità di vetrificazione. Era unico in quanto ha offerto a prova di manomissione, interiorizzato, etichettatura dual-color. Inoltre, per il carico e memorizzare gli embrioni direttamente nella flexipette sterile utilizzato per pipettare (cioè senza pipettaggio ad una superficie periferica secondaria) e utilizzando cannucce ionomerica-resina che sigillano completamente saldato utilizzando un sigillante automatizzato, variante tecnica è stata eliminata in modo efficace.

Nel valutare la completeness di dispositivi vitrificazione per l'uso potenziale, ci sono diversi fattori di controllo della qualità che dovrebbero essere presi in considerazione, tra cui: 1) Etichettatura potenziali etichette -Può essere rispettate in modo sicuro? Sono a prova di manomissione? Offrono due colori potenziale di identificazione? C'è bisogno di un'etichetta secondaria, e può l'etichetta essere facilmente rimosso per scopi di registrazione (ad esempio, il paziente verifica) post-riscaldamento? 2) facilità tecnica embrioni -Può essere facilmente caricati nel / sul dispositivo in modo tempestivo e semplicemente identificati e monitorati post-riscaldamento? 3) procedurale semplicità / ripetibilità -La il metodo di vetrificazione offerta semplicità e affidabilità che permette facilmente per la ripetibilità, che riduce al minimo la variazione tra tecnici (interni) e programmi (esterni)? 4) capacità di stoccaggio LN ₂ -Può i dispositivi essere facilmente gestito e sicuro e identificato? È il loro storabbia spazio potenziale efficiente? Fa il dispositivo di sicurezza offerta e la sicurezza da danni fisici o possibili contaminanti come un sistema chiuso asettico? 5) il potenziale di recupero / resilienza -È il disegno dispositivo soggetto a potenziali problemi nel recupero garantito di embrioni, e faranno in modo affidabile vetrificare e mantenere completa integrità cellulare post-riscaldamento? Quest'ultima preoccupazione specifica qualità, il tasso di recupero, è stato effettivamente sorprendentemente ridotto al minimo in rapporti pubblicati; questo viene fatto generalmente nascondendo la esito sfavorevole (cioè, embrione perso o uovo) nel tasso di sopravvivenza in genere-buoni. Qualsiasi dispositivo inclini a recupero incoerente (<99%) è gravemente lacunosa e costituisce una passività procedurale.

Il nostro asettica, chiuso metodo mS-VTF è stato sviluppato in modo strategico per tenere conto di ogni misura di controllo della qualità. Tuttavia, dopo 5 anni di successo clinico superiore e validazione ^14, la procedura ha avuto to essere modificato. L'originale cannucce embrione 0,3 mL (in possesso di una spina idrofobico) sono stati rimossi dal settore FIV e sostituiti con una cannuccia sperma 0.3 mL in possesso di un tampone di cotone / PVP standard (ad esempio, rietichettato come sperma / embrione di paglia). Questo documento procedurale vengono descritte le procedure specifiche e le strategie necessarie per attuare in modo sicuro, semplice ed efficace mS-VTF. Inoltre, si segnalano la modifica (s) necessario per tenere conto in modo affidabile per limitazioni di approvvigionamento, fino al momento in cui un contenitore di paglia ideale alternativa viene reintrodotto nel laboratorio clinico.

Protocollo

Lo sviluppo della procedura mS-VTF è stato condotto come parte di uno studio approvato Institutional Review Board (IRB) nel periodo 2008-2009 (Aspire IRB, Santee, CA) in ovociti umani e crioconservazione degli embrioni. Il procedimento è stato poi regolarmente applicata al trattamento clinico dei pazienti infertilità che hanno firmato moduli di consenso informato.

1. Considerazioni di controllo della qualità

1. Utilizzare colori diversi (ad esempio, penne, etichette, o identificazione (ID) aste o tappi) per distinguere i pazienti se cryopreserving più di un gruppo di embrioni in un giorno.
2. Usare piatti e pipette diverse per ogni paziente. Minimizzare il volume del mezzo trasferito quando si spostano le blastocisti da una soluzione all'altra.
3. Cryopreserve una blastocisti per paglia o dispositivo. Mantenere una tecnica asettica / sterile e aderire a tutte le precauzioni di sicurezza.
4. Confermare modulo di proposta di Physicians 'e firmato il consenso del paziente prima initiating procedure. Controllare la disposizione degli embrioni dei pazienti (s) in inventario.
5. Utilizzare una "rinuncia a responsabilità e consenso per il trasporto", se le blastocisti devono essere trasferiti in un'altra struttura. Assicurarsi che tutte le firme sono testimoniati in loco o autenticata.
6. Confermare misure adeguate di controllo della qualità per il supporto e gli integratori di proteine, a seconda dei casi, tra cui saggi biologici, determinazioni endotossine, e scadenza / lot verifica il numero di inseguimento.
7. Stabilire limiti critici (ad esempio, i bassi livelli di preoccupazione) per il monitoraggio clinico crioconservazione esito e valutazione, come ad esempio i tassi di recupero: <95%, i tassi di sopravvivenza: <80%, e tassi di gravidanza clinica, utilizzando una blastocisti singolo-euploid: <50%.

2. Procedura Crioconservazione

1. Preparazione
   1. Completare il lavoro di ufficio del caso, compresi i dati entrando nel fogli di lavoro e database di crioconservazione e di registro inventario(S).
   2. Preparare soluzioni di crioconservazione fresche o utilizzare una fonte commerciale (rispettando le condizioni di conservazione e shelf-life consigliate dal produttore).
   3. preparazione Straw.
      1. Aprire il lato di etichettatura dei pacchetti sterili individualizzati. Staccare l'ugello di riempimento trovato sul tradizionale embrione paglia 0,3 mL afferrandolo contro la confezione e parzialmente sollevamento e tirando la cannuccia; questo esporrà l'estremità dell'etichetta alle condizioni ambientali, mentre la paglia riposa asetticamente all'interno della confezione di plastica.
         1. (Modifica) per 0,3 mL di sperma / embrione cannucce, spingere il tappo verso il basso di 0,5 cm. Applicare una guarnizione interna di fronte alla spina cotone PVP attraverso l'uso di una base sigillante tavolo impulso.
         2. Impostare la paglia sulla superficie Teflon dell'elettrodo, proprio di fronte alla spina. Premere la maniglia per attivare il calore. Rilasciare la maniglia quando appare la luce rossa. Per garantire la tenuta della saldatura completa, il calore ad una temperatura sufficientemente flattens le superfici contrapposte, quindi capovolgerla di 180 ° e richiudere la superficie opposta ^19, se necessario.
   4. Utilizzando un cryomarker, etichettare ogni paglia / dispositivo e cryogoblet con il nome del paziente, un numero ID univoco (ad esempio, SSN, DOB, o il numero ID del paziente), e la data di congelamento. Anche un numero univoco ciascun paglia / dispositivo (ad esempio, 1, 2, 3, ecc).
      1. Fissare l'etichetta (preferibilmente di colore) su un asta ID colore ponderata da inserire e sigillato in un embrione di paglia 0.3 mL. Riportare la paglia per la sua confezione sterile individuale fino al momento dell'uso.
         Nota: Se solo aste ID colore ponderati 30 mm sono disponibili, allora non è necessario l'inserimento supplementare di due cuscinetti a sfere, adiacente a ciascun lato della barra ID.
   5. Identificare ogni canna con un numero unico ID inscritto. Identificare un LN ₂ bagagli Numero serbatoio e un numero contenitore in cui esemplari (s) di ogni paziente può essere stORed a lungo termine.
   6. Preparare piatti crio freschi (100 mm), mediante l'etichettatura la superficie inferiore con il nome del paziente, ID soluzione, ed embrione / holding gocciolina ID (Figura 1A). In particolare, impostare 4 file di goccioline: medio isotoniche HEPES-buffered (in alto), V1 (soluzione di equilibrio (ES)), V2 (soluzione intermedia (IS)), V3 (soluzione vetrificazione (VS), in basso). Scrivere l'ID dell'embrione nella parte in alto a destra con colonne etichettate.
      Nota: Una serie di 25- a 50-microlitri lavaggio gocce (n = 3) viene utilizzato per garantire che ogni individuo finale 10 ai 15 microlitri tenendo gocciolina / tipo di soluzione (cioè, V1, V2, V3 o) è puro e non diluito. Usando questo approccio, fino a cinque singoli embrioni può venire vetrificata utilizzando un unico piatto. Mantenere ogni piatto coperto quando non in uso per evitare qualsiasi temperatura di evaporazione / disidratazione di goccioline.
   7. Preparare flexipettes sterili tagliando 3 cm da loro fine base (denominati "punte VTF"). Inserirli su singolopipette (fissato al 3 mL) e impostare le punte per pipette-VTF in posizione verticale in un rack tubo di polistirolo (Figura 1B).
2. la selezione degli embrioni
   1. Confermare paziente / identificazione del campione.
   2. Utilizzando un microscopio invertito (200 - 400X), grado e classificare le blastocisti secondo il sistema di classificazione Gardner ^20, utilizzando una classificazione numerica da 1 a 6 per presto per blastocisti tratteggiati, rispettivamente, e un A, B o C grade assegnato alla massa interna delle cellule (ICM) e trophectoderm (TE).
      Nota: In preparazione per blastocisti biopsia e analisi euploidy, la zona pellucida è pre-ordito da ablazione laser al Day 3 per promuovere l'ernia precoce della TE e richiede una classificazione ² classificazione modificata in tal modo. In breve, di grado 3 pieno blastocisti mostra fino al 10% TE ernia, di grado 4 ampliato blastocisti sono 10 - 50% covato e grado 5 blastocisti cova avere> 50% TE extrusion (Figura 2A-C).
      Nota: La nostra preferenza è quella di crioconservazione di grado 3 o superiore blastocisti di qualità ≥BB il giorno 5 o 6. Tuttavia, blastocisti vetrificati di qualità inferiore (C) ed embrioni post-compattazione in fasi precedenti (tra cui ritardo morula al Grado 1 o 2 blastocisti ) può certamente sopravvivere riscaldamento completamente intatta e produrre embrioni vitali in grado di raggiungere nati vivi.
   3. Comprimere la blastocele di ogni blastocisti prima dell'inizio del processo cryodilution da micropuncturing una giunzione trophectoderm oppure eseguendo una ablazione impulso laser di una cella trophectodermal ²¹ se si usano soluzioni di vetrificazione bassa molarità (<6,5 M o 40% v / v).
      Nota: La necessità di comprimere le blastocisti non dipende dal dispositivo. Nel nostro sviluppo precoce di mS-VTF (2008), abbiamo inizialmente utilizzato glicole etilenico (EG) / soluzioni DMSO con successo con ovociti (1 su 1 gravidanza a termine), ma un sub-ottimale (<80%)la sopravvivenza / sviluppo di blastocisti di topo ¹⁶ è stato sperimentato da altri ^21. Dal momento che alti soluzioni di glicerolo-based molari (superiore a 7,9 M) sono utilizzati nel nostro sistema VTF corrente (dal 2009), il collasso blastocele fisica è necessaria. Tuttavia, il tratteggio selettiva di blastocisti tratteggiate è consigliabile in generale.
3. Cryodilution e blastocisti Caricamento
   1. Rimuovere il piatto della cultura del paziente dal termostato e confermare l'identificazione del paziente / campione con un'altra persona (ad esempio, testimoniato da una fonte secondaria) prima di rimuovere l'embrione (s) per essere vetrificate.
   2. Confermare lo sviluppo di blastocisti per passo 2.2.2, aggiornare la scheda tecnica crio, e, sotto stereomicroscopia, pipetta blastocisti (s) dal piatto di cultura in una holding gocciolina isotonica del piatto crio.
   3. Spostare ogni blastocisti in singole gocce di tenuta utilizzando il flexipette vetrificazione (vale a dire, la punta VTF).
   4. spostare ogniblastocisti nella soluzione V1 (ES).
      1. Precompilare il flexipette con la soluzione V1 (3 ml) e posizionare metà del contenuto sul dell'embrione.
      2. Aspirare l'embrione e passare alla prima delle tre V1 gocce di lavaggio (di cui al punto 2.1.6), Pipetta l'embrione 2 - 3 volte intorno al perimetro, e cancellare il contenuto della pipetta a goccia (evitando la formazione di bolle) o sulla di superficie piatto.
   5. Riempire la punta VTF con la prossima goccia lavaggio V1 e ripetere l'aspirazione dell'embrione (s). Ripetere una terza volta e spostare la blastocisti (s) a un individuo goccia V1 azienda. I passaggi di diluizione / lavaggio devono assumere da 30 a 45 s. Precarico ogni punta VTF con la soluzione successiva (ad esempio, V2), inserire la pipetta in un rack, e utilizzare la pipetta successivo (secondo l'impostazione al punto 2.1.7) (Figura 1B).
      Nota: Dal momento che il tempo totale di esposizione in solfossido non-dimetil (DMSO) contenente soluzioni V1 e V2 è 5 minuti ciascuna, la dispensazione di individoppio blastocisti dovrebbero essere equamente scaglionati all'interno di tale intervallo, se si considera che il passo V3 finale richiederà almeno 1 min per blastocisti da eseguire. Per esempio, se ci sono 4 blastocisti in un gruppo vetrificazione, blastocisti pipette # 1-2-3-4 a intervalli di 75-s.
      Nota: l'innovativo protocollo di diluizione Cryo Enterprises (ICE) sopra descritto è nettamente diverso rispetto alla maggior parte delle procedure di vitrificazione commerciale, che coinvolgono generalmente soluzioni DMSO contenenti. Quei protocolli raggiungere gli stessi diluizioni graduali attraverso un graduale, ma meno controllati, la fusione di soluzione di lavaggio (vale a dire, mezzo isotonico), ES, e VS.
   6. Ripetere i punti 2.3.4 e 2.3.5 utilizzando V2 (IS) soluzioni.
   7. Ripetere i passaggi soluzioni (VS) 2.3.4 e 2.3.5 utilizzando V3.
   8. Su mettendo ogni blastocisti nella V3 tenendo gocciolina, deselezionare la soluzione residua e bolle dalla punta VTF (al di fuori della goccia), e poi riempire completamente la punta con V3 pulita intorno all'embrione. Expel circa un terzo del volume (1 ml) e pipetta la blastocisti (s) e rimanendo V3 completamente nella punta VTF.
   9. Rimuovere la punta VTF dalla pipetta, pulire la punta secca V3 residua sulla superficie esterna utilizzando un tampone di garza sterile e inserire la punta fine primo nell'estremità aperta della paglia pre-etichettato. A "punta secca" è fondamentale per prevenire la possibile adesione paglia interiore.
   10. Invertire la paglia (etichetta fine verso il basso), osservare la punta al tappo interno o sigillo, e sigillare in modo sicuro l'estremità aperta con 1 cm di spazio aereo. Preferibilmente, utilizzare un dispositivo di chiusura automatica (per esempio, Syms I) per eliminare la variazione tecnica.
       Nota: Il vantaggio di usare cannucce che sono composte di una resina plastica ionomerica (ad esempio, HSV o mS-VTF) è che utilizzando il calore correttamente azionamento dispositivo di tenuta crea una tenuta affidabile "saldare", come indicato nel passaggio 2.1.3.1.
   11. Una volta sigillato, immergere la paglia chiuso direttamente in LN ₂ in un stainless acciaio vaso Dewar e inserire la cannuccia (s) nel calice aperto attaccato alla canna del paziente per la conservazione.
       Nota: Poiché cannucce mS-VTF usano 40 mm barre ID ponderati per compensare la galleggiabilità della paglia piena d'aria, l'uso di calici invertiti o cryovials vuote per coprire il campione (s) non è necessaria a meno che non sia coinvolto il trasporto.
4. Riscaldamento e Cryo-soluzione di eluizione / diluizione
   1. Confermare Modulo Physicians 'Referral per quanto riguarda vetrificato data di trasferimento degli embrioni, tempo previsto, e dettagli embrioni (numero di scongelare / trasferimento, numero specifico embrione se PGS testata, etc.).
   2. Preparare soluzioni di riscaldamento freschi (1,0 M saccarosio soluzione madre) e / o utilizzare una fonte commerciale (consigliato 1 settimana-1 mese di durata, una volta in uso, 4 ° stoccaggio C).
      1. Aliquota 17,1 g di saccarosio in 50 mL flaconi sterili al momento dell'apertura iniziale (ad esempio, fonte di approvvigionamento settimanale) a causa dei rischi di accumulo endotossine in saccarosio granules su esposizione ambientale ripetuta.
      2. Mescolare saccarosio granulare pre-pesato in soluzione (1,0 M magazzino = 3.42 g / 10 ml di HEPES-buffered fluido tubarico umano [H-HTF]) e riscaldare la soluzione a 37 ° C per aumentare la solubilità dei granuli. Ripetutamente invertire il contenitore per contribuire ad accelerare e completare il missaggio finale.
         Nota: filtrazione (filtro a 0,22 micron) effettuata utilizzando unità di filtrazione a pressione positiva è consigliato per soluzioni viscose (> 0.5 M saccarosio) o volumi elevati. pompe a pressione a mano sono sufficienti e poco costoso, mentre una pompa elettrica è rumorosa, provoca vibrazioni, ed è semplicemente non richiesto.
   3. Warm tubo (37 ° C) un 10-mL ciascuno di 1,0 M soluzione di saccarosio e medie H-HTF per paziente per mS-VTF uso bagno di riscaldamento.
   4. Preparare piatti scongelamento freschi (6-pozzetti) etichettando la superficie di copertura con il nome del paziente e gli ID di soluzione.
      Nota: In questo caso, abbiamo utilizzato: (1) lavaggio T1 (200 μ; L senza copertura di olio, (2) T1 (100 mL) con 1 ml di olio, (3) T2 (100 mL) con olio, (4) T3 (100 mL) con olio, (5) T4 (100 mL) con olio, e (6) medium T5 / 200 microlitri isotoniche HEPES tamponata con 10% di albumina sierica umana (HSA) o il 20% di siero sostituto senza copertura di olio. Applicare una di saccarosio universale soluzione step-down protocollo-T1 = 1.0 M, T2 = 0,5 M, T3 = 0,25 M, e T4 = 0,125 M-se il ghiaccio o un'altra fonte commerciale non è disponibile, come proposto per gli embrioni slow-congelati ²² . Inoltre, si noti che il lavaggio T1 iniziale e le equilibrations T5 finali possono essere eseguite in 30-mm piastre di Petri e il piatto 4 ben utilizzati per passaggi 2-5 di cui sopra, che coinvolge una sovrapposizione di petrolio.
   5. Scongelare embrioni (s) un solo paziente alla volta.
      1. Controllare Modulo Referral Physicians 'e confermare il ciclo prima di scaldare il numero indicato (ad esempio, 1 o 2 blastocisti); valutare la sopravvivenza / probabile vitalità osservando cambiamenti osmotici (vale a dire, SHRinkage e reidratazione) e delle membrane intatte, e, se discutibile, contattare il medico e / o il paziente prima della fase di riscaldamento un'altra blastocisti.
   6. Confermare l'identificazione del paziente / campione con un collega di lavoro (ad esempio, testimoniato da una fonte secondaria).
   7. Posizionare la canna paziente in un pallone Dewar riempito con LN ₂ e isolare identificare la paglia da riscaldare.
   8. Portare il piatto di diluizione 6 pozzetti al centro della scena stereomicroscopio. Posizionando un piatto da 60 mm Petri su un lato (cioè, a seconda del sinistro o preferenza destro del tecnico), aggiungere il saccarosio riscaldato (1,0 M) e soluzioni H-HTF per creare un riscaldamento 0,5 M saccarosio bagno (scoperto).
      Nota: punte VTF sono riscaldate solo in 0,5 M soluzioni di saccarosio come una salvaguardia QC, per assicurare il mantenimento della vitalità degli embrioni nel raro caso in cui un embrione viene espulso sul rapido riscaldamento ^22.
   9. Tenere il sigillo paglia superiore al di sopra del livello del liquidoper confermare l'identità, e poi cogliere e fissare la paglia sotto il tappo interno con le forbici Mayo (la punta VTF dovrebbe ancora essere sommerso in LN _2).
      1. Saldamente toccare le forbici sul vaso Dewar (un paio di volte) per rimuovere la punta VTF dalla parete laterale interna paglia come precauzione QC; se la punta VTF è aderente, il tapping assicura che la base della punta scende all'estremità opposta sigillato l'estremità, fornendo così uno spazio d'aria vicino alla spina.
   10. Sollevare la paglia con le forbici in aria ambiente in una posizione orizzontale (accanto o sotto la superficie stereoscopio) e afferrare l'estremità non marcato (etichetta sul lato destro). Tagliare la paglia al tappo interno o sigillare e sollevarlo sopra il piatto vasca riscaldamento. Versare la punta VTF nel bagno caldo di saccarosio ad un angolo di 60 ° fino a quando non è completamente estruso ed è stato rapidamente riscaldato (> 6.000 ° C / min); la base del flexipette poggerà sopra la parete laterale piatto.
       1. Consentire la TI VTFp per caduta libera nel bagno. Battere delicatamente la superficie paglia superiore se la punta non emerge immediatamente. Se appare solo parzialmente, assiste nell'estrusione afferrando l'albero del flexipette con le forbici o pinza sottile.
   11. Dopo 5 - 10 s, afferrare la base pipetta e inserire in un dispositivo di pipettamento usa e getta; un foro nel bulbo agisce per rilasciare la pressione dopo l'inserimento. Coprire il buco lampadina con un dito indice e delicatamente spremere il bulbo di rilasciare la blastocisti vetrificata nel lavaggio T1 (# 1) durante la visualizzazione da stereomicroscopia. Una volta confermata, deselezionare la soluzione e bolle residua V3 (VS) di pressione positiva, evacuare il contenuto al centro, scarti inutilizzati bene. Avviare un timer di 5 min.
       Nota: Tutti i passaggi di diluizione di saccarosio vengono eseguiti a temperatura ambiente (21 ± 2 ° C).
   12. Rimuovere VTF punta e posizionarlo su una pipetta. Procedere spostando l'embrione in T1 # 2 sott'olio per il tempo rimanente (circa 3-4 minuti).
       1. Se è necessario un secondo blastocisti per il trasferimento, scaldare subito un secondo paglia e VTF punta (ripetendo i punti 2.4.9 - 2.4.11) dal paziente prima di iniziare la fase 2.4.12. Spostare entrambi blastocisti insieme per un eluizione minimo T1 (1,0 M saccarosio) di almeno 3 min.
   13. Pre-riempire il flexipette con la soluzione successiva, e quindi spostare e diluire la blastocisti (s) in T2, T3, T4 e ad intervalli di 3 min. Se la zona pellucida non è stato precedentemente laser ablazione (cioè, tratteggiata), farlo in T4. Porre la capsula sul palco di un microscopio invertito e immagine l'embrione su un monitor di un computer. Allineare la zona all'interno di un cerchio rosso designato e attivare 2 o 3 impulsi di un laser a diodi (iniziando dai margini dello spazio perivitellino e muove verso l'esterno) per creare un'apertura ^{2, 19.}
   14. Equilibrare la blastocisti a T5 (cioè mezzo isotonico) per 5 minuti su una superficie calda (37 ° C).
   15. Valutare la sopravvivenza dell'embrione iniziale, in base alla presenza predominante delle membrane delle cellule intatte con cytoplasms anche, traslucido privi di oscuramento picnotici. Posizionare l'embrione (s) in coltura per 2 - 6 ore prima di trasferimento di embrioni, momento in cui, l'embrione di sviluppo / sopravvivenza deve essere nuovamente valutato e documentato.
       Nota: Se più di 1 blastocisti valida esistente al momento del trasferimento e il paziente sceglie di procedere con solo 1 blastocisti, la blastocisti supplementare può essere con successo ri-vetrificato (rVTF) ripetendo i punti 2.3.3 - 2.3.11. Abbiamo diversi nati vivi confermati seguenti eventi singoli rVTF.
       Nota: rVTF stato sperimentalmente eseguito fino a 5 volte senza un effetto significativo sulla sopravvivenza / vitalità delle blastocisti umane aneuploidia vetrificate in una soluzione di glicerolo basata metastabile.

Risultati

1.341 blastocisti vetrificati sono stati riscaldati tra il 2012 al giugno 2014, e 1.341 embrioni recuperati (100%), mentre 1.316 sono sopravvissuti (98,1%). blastocisti biopsia sperimentato oltre il 99,5% di sopravvivenza. Al momento il trasferimento prevalentemente singolo, geneticamente testato, euploid, embrioni vetrificati, siamo stati in grado di raggiungere alcuni tra i tassi di impianto più alti e tassi di natalità dal vivo negli Stati Uniti, indipendentemente dall'età (figura 3) ^20, secondo recenti statistiche nazionali riportati dal Centro per il controllo delle Malattie e la Società per tecniche di riproduzione assistita (tabelle 1 e 2). Valutare una popolazione di pazienti buona prognosi (meno di 35 anni) per i soli cicli crioconservati (Tabella 1), il nostro laboratorio ha superato la media nazionale sia per i tassi di impianto (ad esempio, l'efficienza di un embrione per stabilire una gravidanza) e, infine, vivere tassi di natalità di oltre il 30%. Inoltre, l'iniziale di validazione / verifica delle nostre cannucce di stoccaggio modificati in metà del 2014 con 70 di ricerca titolari di autorizzazione, blastocisti aneuploidi ri-vetrificate portato a 100% di recupero e il 100% di sopravvivenza.

Figura 1. Installazione MicroSecure VTF. Il piatto VTF (A) è assemblato con 3 file distinte di soluzioni di vetrificazione, che utilizzano 3 gocce di lavaggio prima del posizionamento nei distinti, goccioline di holding numerate. Inoltre, le singole pipette con punte VTF accorciati (cioè, flexipettes 300 micron ID) sono protetti e organizzati in un rack tubo di polistirolo (B), che può essere ruotata per un uso ordinato. Si noti che un gruppo di pipettaggio lampadina micropipetta monouso rappresentante è appoggiato sul rack di polistirolo. Arget = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Modificato blastocisti Grading System. Conti Il nostro sistema di classificazione blastocisti Gardner modificato per l'ernia indotta delle cellule TE per facilitare blastocisti biopsia. La modifica considera la schiusa prematura di blastocisti completi (A: Grado 3 = meno del 10% ernia) e blastocisti espanse (B: grado 4 = fino al 50% ernia), mentre una blastocisti cova (C) ha superiore al 50% ernia ^16. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. gravidanza risultati comparativi. Nel corso di un intervallo di cumulativo di 1,5 anni, i dati di gravidanza sono stati confrontati per valutare gli effetti del trasferimento di blastocisti euploidi vetrificati-riscaldato (n = 172 cicli / 144 trasferimenti) rispetto ai cicli non PGS (n = 160 cicli / 153 trasferimenti) che coinvolgono prevalentemente fresco trasferisce ^18. Per i nostri scopi sperimentali, questo dato rivela chiaramente che la blastocisti biopsia vetrificati dalla procedura mS-VTF mantengono la loro vitalità. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Fonte di dati	# cicli	Medio di embrioni trasferiti #	Impianto Tariffe (%)	I tassi di natalità in diretta (%)
NB Lab *	144	1.2	74.00%	74.50%
Media nazionale	20.423	1.7	39.60%	44.10%
* I dati sono stati mediati sulla base del 2014 prestazioni di Orange County fertilità, Southern California Fertility Center e il sud della California Center for Reproductive Medicine cliniche utilizzando l'Ovation corrente fertilità laboratorio (NB Lab), che ha fondato la procedura microSecure vetrificazione nel 2008.

Tabella 1. 2014 CDC Assisted Reproductive statistiche. Congelati i dati trasferimento di embrioni di gravidanza delle donne sotto i 35 anni da tre segnalazione cliniche medico utilizzando il nostro laboratorio NB rispetto alla media nazionale degli Stati Uniti il ​​2013 di oltre 450 cliniche di segnalazione.

Medie nazionali SART
Clinica - Stato	Donne	Donne	Donne	Donne
	<35 anni	35-37 anni	38-40 anni	41-42 anni
SCCRM-CA *	63,1%	58,3%	40,6%	32,3%
CCRM-CO *	64,7%	61,5%	40,4%	32,2%
RMA-NJ *	63,2%	59,7%	34,6%	18,7%
Media nazionale	48,6%	38,3%	24,3%	12,3%
SCCRM-Southern California Center for Reproductive Medicine; CCRM-Colorado Center for for Reproductive Medicine; e RMA-Reproductive Medicine Associates
* Queste cliniche principali sono tutti prevalentemente realizzato cicli di trasferimento di embrioni vetrificati, in associazione con test genetici preimpianto, nella loro pratica standard di cura del paziente per ottimizzare il successo nati vivi per ogni embrione trapiantato.

Tabella 2. 2014 i tassi cumulativi di natalità dal vivo, come riportato dalla Società per tecniche di riproduzione assistita (SART), per la Clinica SCCRM utilizzando il nostro Ovation fertilità Lab di Newport Beach, CA, in contrasto con molti altri programmi rispettati, così come con il SART medie nazionali.

Discussione

Oggi, vi è un'alta aspettativa di raggiungere sopravvivenza blastocisti completa (> 95%) e raggiungere il successo impianto simile a quello di embrioni freschi. Alcuni gruppi hanno suggerito che i tassi di natalità live di cicli di trasferimento di embrioni vetrificati sono forse addirittura superiore blastocisti fresche quando l'embrione crioconservato intatto viene trapiantato in un sano utero, non ormonale-stimolata. I nostri dati indicano chiaramente che la vetrificazione in modo efficace e affidabile mantiene la vitalità dell'embrione fresco. Inoltre, abbiamo dimostrato che il nostro asettica, metodo chiuso, chiamato MicroSecure vitrificazione (mS-VTF), può raggiungere un risultato ottimale paragonabile o superiore alle norme commerciali (ad esempio, sistemi di dispositivi aperti) utilizzati nell'industria FIV.

Variazione è associato con ripetibilità tecnica e affidabilità tra individui che utilizzano una moltitudine di vitrificazione dispositivi / metodi. A sua volta, questo ha portato a inconsistencies tra i programmi che applicano vetrificazione. Pertanto, non è sorprendente che il dispositivo di familiarità è un fattore importante per quanto riguarda competenza del laboratorio e risultati di successo. E 'questo concetto di "firma tecnica" ¹¹ che spiega il motivo per cui la ripetibilità tra i programmi può essere problematico. Non solo ha lo sviluppo di più di una dozzina di dispositivi commerciali complicato questo fenomeno, ha creato problemi di controllo della qualità. Fortunatamente, chiuso sistemi di vetrificazione, come mS-VTF, Rapid-I, e VitriSafe, sono ora dimostrando di essere ugualmente efficace per aprire i sistemi di dispositivo ^{12, 13, 14.}

MicroSecure VTF è un romanzo, tecnica di vitrificazione asettica sviluppata con facilità tecnica, affidabilità e crio-sicurezza in mente. Combinando l'uso di due dispositivi, conformi FDA precedentemente approvati, è un sistema di vetrificazione non commerciale with il vantaggio di avere un basso costo stabilita, in contrasto con dispositivi specializzati. Inoltre, la sua prova di manomissione unico e sistema di etichettatura a due colori interiorizzato, oltre a numerosi altri vantaggi di controllo della qualità, hanno fatto mS-VTF un'opzione globale attraente ^11. Come dispositivo VTF non commerciale, tuttavia, la sua applicazione industriale diffusa si sta evolvendo lentamente. Solo attraverso la continua pubblicazione della sua sicurezza, la sicurezza e l'efficacia clinica guadagnerà mS-VTF crescente utilizzo.

Nel mese di agosto 2014, di fronte alla impossibilità di acquisire l'originale embrione paglia 0,3 mL fabbricato con una, non traspirante spina idrofobico interno, siamo stati in grado di modificare in modo affidabile il metodo mS-VTF. In breve, i nuovi sperma 0,3 mL / cannucce embrione con le loro spine cotone-PVP sono stati efficacemente adattati. Ciò è stato semplicemente ottiene creando una tenuta interna prima che la spina cotone, impedendo così il contatto e il fluido traspirante con lapunta VTF a tempo indeterminato (cioè, il flexipette contenente l'embrione o le uova). Inoltre, se aste ID 40 mm non sono accessibili, il problema galleggiamento associato con le aste più leggeri di 30 mm può essere contrappesi mediante due cuscinetti a sfere.

Questi passaggi aggiuntivi hanno reso la tecnica leggermente meno semplice, ma altamente efficace. Oggi, l'economia e l'efficacia stanno diventando sempre più importanti preoccupazioni, come blastocisti biopsia sono tipicamente vetrificati individualmente fino a quando il suo stato euploidy è confermato in un report genetica. Blastocisti con uno stato aneuploidia non vitali confermato in genere vengono scartate, con il consenso del paziente, in poche settimane. Così, la maggior parte (> 50%) di dispositivi VTF vengono scartati dopo conservazione a breve termine, causando un costo annuo crescente quando si utilizzano dispositivi commerciali. Nel complesso, mS-VTF è una procedura altamente efficace, affidabile e ripetibile per la crioconservazione delle blastocisti umane. Il controllo di qualità di progettazione securel superioreetichette Y e sicuro memorizza embrioni / ovociti eliminando mancato recupero e l'ottimizzazione della sopravvivenza post-riscaldamento e la redditività, che giustifica l'uso del sistema come un approccio universale alla embrione vetrificazione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cane	IVM	XC055
Ball bearings, 3/32"	VXB.com	KIT15977	stainless steel
CBS semen/embryo straw, 0.3ml	CryoBioSystems	25292	individual sterile
Color, ID rods, 30 mm	CryoBioSystems	019021-26	weighted
Culture tubes, 15ml	Falcon	352099	Conical
Culture tubes, 10ml	Falcon	352057	Snap-cap
Cryosleeves	Nalgene	5016-001
Filter, 250ml	Fisher Sci.	09-740-2A	0.22 μm
Flasks, Tissue Culture 50ml	Falcon	353014
Flexipettes, 300μm ID	Cook Med.	K-FPIP-1300-10BS-5	Sterile, 20/pack
Forcep, Large	Miltex	6-30TC
Forcep,Splinter - fine	Miltex	17-305
Goblet	IVM	PA003
Heat Sealer, SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110V or 220V with adapter
Hepes-buffered media	Life Global or	LGGH-100; 100ml,  or	stored at 2-8ºC
	Irvine Scientific	H-HTF; 90126; 100ml	with non-essential AA's
Labels, Cryo	GA International	CL-23T1	Various colors
Liquid Nitrogen Tank, 40L	MVE or Taylor Warton	various	liquid storage
LN2 Dewar flask, 0.5L	Hampton Research	HR4-695	Stainless steel
6-well Custer Dishes	Biogenics	015/020	plasticware by case
Pipette Bulb, Micro Cap	Drummond	Fisher#13681451	Hole on bulb apex
Petri Dishes, 35mm	Falcon	351006
Petri Dishes, 58mm	Nunc	150288
Petri Dishes, 100mm	Falcon	351029
Pipette Tips, ART long	Fisher Sci.	02-707-80	10-100μl
Pipet Aid	Drummond or Falcon	various	rechargeable
Pipetting Device, Stripper	Cooper Surgical	MXL3-STR
Pipettes, Serological 1ml	Falcon	357521
Pipettes, Serological 2ml	Falcon	357507
Pipettes, Serological 5ml	Falcon	357543
Pipettes, Serological 10ml	Falcon	357551
Scissors, Surgical Mayo	Miltex	5-SC-16
Stereomicroscope	Nikon, Olympus, Leica	various
Sterile Gauze pads, 4"x4"	Kendall Healthcare	6939
Synthetic serum	Life Global or	LGPS-20 ; 20ml,  or	stored at 2-8ºC
	Irvine Scientific	SS-99193; 12 x 10ml	purchase low endotoxin lot
Sucrose	Sigma Chemical Co.	#S9378	Aliquot into 50ml flasks,  1year
			17.1g/flask +Medium to 50ml
			makes a 1M solution
			Filter with 0.22µm unit
Timer	Nalgene	5016-001
Thawing  Solution	Innovative	BL-TS	T1, T2, T3, T4
	Cryo Enterprises	(≤1.0M Sucrose)	stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening
Vitrification  Solution*,**	Innovative	BL-VS	V1, V2, V3
	Cryo Enterprises	(≥7.9M [Glycerol/EG])	stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening
			* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate
			** other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8M),  but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2M).  Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution.  Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property.