القيطم البويضات: طرق الأمثل ل microinjection، إزالة طبقات الخلية مسامي، والتغييرات الحل السريع في التجارب الكهربية

Summary

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Abstract

البويضة القيطم كنظام تعبير مغايرة للبروتينات، وصفت لأول مرة من قبل Gurdon وآخرون. ^1، واستخدمت على نطاق واسع منذ اكتشافه (المراجع 2-3، والمراجع فيها). وهناك سمة أن يجعل البويضة جاذبية للتعبير قناة الخارجية هي وفرة الفقيرة من القنوات الأيونية الذاتية ^4. وقد أثبت هذا النظام التعبير مفيد لتوصيف العديد من البروتينات، ومن بينها القنوات الأيونية بوابات يجند.

يوصف التعبير عن GABA _{ومستقبلات} في البويضات القيطم وتوصيف وظيفي من هنا، بما في ذلك عزل البويضات، إبر دقيقة جدا مع كرنا، وإزالة طبقات الخلايا الجرابية، والتغيرات حل سريع في التجارب الكهربية. تم تحسين الإجراءات في هذا المختبر ^5،6 وتحيد عن تلك التي تستخدم بشكل روتيني ^7-9. تقليديا، يتم إعداد البويضات الجرداءمع العلاج لفترات طويلة كولاجيناز من فصوص المبيض في RT، وهذه البويضات الجرداء وmicroinjected مع مرنا. باستخدام الطرق الأمثل، وقد أعرب عن بروتينات الغشاء متنوعة ودرس مع هذا النظام، مثل المؤتلف مستقبلات GABA ^_و10-12، وقنوات كلوريد البشرية المؤتلفة ^13، المثقبيات قنوات البوتاسيوم ^14، ونقل ميو -inositol ^{15 و 16.}

يمكن تطبيق طرق مفصلة هنا للتعبير عن أي بروتين الاختيار في البويضات القيطم، والتغيير حل سريع يمكن استخدامها لدراسة قنوات الأيونات الأخرى بوابات يجند.

Introduction

وتستخدم على نطاق واسع البويضات القيطم كنظام للتعبير (المراجع 2-3، والمراجع فيها). وهم قادرون على تجميع ودمج البروتينات multisubunit نشطة وظيفيا في أغشية البلازما الخاصة بهم بشكل صحيح. باستخدام هذا النظام، فمن الممكن للتحقيق وظيفيا بروتينات الغشاء وحدها أو بالاشتراك مع غيرها من البروتينات، لدراسة خصائص، خيالية، أو البروتينات متصلا تحور، ولفحص المخدرات المحتملة.

وتشمل مزايا استخدام البويضات على الأنظمة التعبير مغاير غيرها من معالجة بسيطة من الخلايا العملاقة، ونسبة عالية من الخلايا معربا عن المعلومات الوراثية الأجنبية، وتحكم بسيطة من بيئة البويضة عن طريق نضح حمام، والسيطرة على غشاء المحتملة .

عيب هذا النظام هو التعبير التفاوت الموسمي لوحظ في العديد من المختبرات ^17-20. والسبب في هذا الاختلافأبعد ما يكون عن الوضوح. بالإضافة إلى ذلك، كثيرا ما لوحظ نوعية البويضات تختلف بشدة. وشملت الطرق التقليدية ^7-9 عزلة فصوص المبيض، والتعرض للفصوص المبيض إلى كولاجيناز لبعض ساعة، واختيار من البويضات الجرداء، وحقن مكروي بويضة. هنا، وأفاد عدد من وإجراءات سريعة البديلة التي سمحت لنا للعمل مع هذا النظام التعبير لأكثر من 30 عاما مع عدم وجود التفاوت الموسمي واختلاف بسيط في نوعية البويضة.

طرق تعديل وتحسين وصفها هنا لعزل البويضات، حقن مكروي مع كرنا، وإزالة طبقات الخلايا الجرابية يمكن أن تستخدم للتعبير عن أي بروتين من خيار في البويضة القيطم. ويمكن تطبيق طريقة بسيطة جدا لتغيرات حل سريع للوسط حول البويضة لدراسة أي القناة الايونية بوابات يجند وناقلات.

Protocol

وقد تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المحلية لكانتون برن Kantonstierarzt، Kantonaler Veterinärdienst برن (BE85 / 15).

1. إعداد القيطم البويضات

1. الحفاظ على الضفادع (القيطم المورق) على 12 ساعة / 12 ساعة ضوء / دورة الظلام في المياه التي يتم الاحتفاظ بدقة عند 20 درجة مئوية.
2. إزالة فصوص من المبيض من الضفادع الإناث ^9.
   ملاحظة: إزالة الفصوص هي حافز للتجديد، وغالبا ما تكون نوعية البويضات يحسن مع الجراحة. وتغطي البويضة بواسطة طبقة المحي، وطبقة من خلايا بصيلات، والنسيج الضام التي تحتوي على الأوعية الدموية ^21. ويطلق على هيكل كامل من "جراب".
3. وضع فصوص من المبايض التي تعج المسام التي تحتوي على البويضات في العقيمة بارت المالحة ⁷ (MBS) تستكمل مع البنسلين والستربتومايسين (88 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم بوكل، 2.4 ملم NaHCO _3، 0.82 ملي MgSO _4، 0.41 ملي CaCl _2، 0.33 ملي كا (NO _{3) 2،} 10 ملم 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic. HEPES (7.5 درجة الحموضة، هيدروكسيد الصوديوم)، و 100 ميكروغرام / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين).
4. واحد من مرحلة V-VI ²¹ بصيلات. عقد الفص المبيض مع ملقط. خفض حلقة البلاتين (الشكل 1) على بصيلات وسحب بلطف حلقة لعرقلة النسيج الضام التي تحتوي على بصيلات من أنسجة المبيض.
   ملاحظة: تتميز المرحلة V-VI ²¹ بصيلات عن حجمها (1،0-1،2 مم في القطر) وعلى النقيض جيدة بين نصف الكرة الحيوان مصطبغة داكنة ونصف الكرة نباتية صفراء.
5. نقل فقط بصيلات أبحث صحية (أي كروية تماما ومع تصبغ سليمة) إلى 35 مم طبق بيتري بواسطة ماصة باستير البلاستيك (قطع مرة أخرى إلى قطر افتتاح 1.5 ملم).

"jove_title"> 2. Microinjection من مرنا في السيتوبلازم

ملاحظة: يتم اشتقاق نظام حقن مكروي الموصوفة هنا من ذلك الذي ذكرته Kressmann وBirnstiel ^22.

1. إعداد cRNAs من cDNAs منها الترميز لمفارز α β _{4 2} δ GABA _{ومستقبلات} بواسطة النسخ في المختبر، إضافة بولي (A ⁺⁾ الذيل، وتقدير الحمض النووي الريبي الكهربائي للهلام ^23.
2. إعداد الماصات حقن مكروي من الشعيرات الدموية البورسليكات الزجاج (1.0 ملم القطر الخارجي (OD)، 0.58 مم القطر الداخلي (ID)، و 100 ملم طول) باستخدام مجتذب micropipette. قطع نصائح من الزجاج الشعيرات الدموية تحت المجهر باستخدام micromanipulator وخييط لخلق قطرها غيض من 12-15 ميكرون مع طرف مشطوف.
3. ردم ماصات حقن مكروي مع زيت البارافين باستخدام الحقنة 10 مل، ومن ثم تحميل ماصة حقن مكروي الصعود إلى ميكر homebuiltجهاز oinjection (الشكل 2).
   ملاحظة: يتكون جهاز حقن زيت هيدروليكي homebuilt من محرك شواء التي تسيطر عليها التبديل دواسة القدم. تبديل إضافي يتغير الوضع تحول من المحرك. هذا المحرك يقود المسمار ميكرومتر (0.5 ملم / بدوره) أن تتقدم أو تتراجع المكبس من حقنة زجاجية 10 ميكرولتر. والحقن بسرعة حوالي 3 دورة في الدقيقة و 0.5 بدوره يتوافق مع حقن NL 50 في المسام. يتم توصيل غيض من حقنة لأنابيب تترافلوروإيثيلين سميكة الجدران التي هي في حد ذاتها متصلة إبرة الحقن بواسطة قطعة قصيرة جدا من أنابيب Tygon. يقام الشعرية حقن بواسطة تشاك الحفر التي يسيطر عليها من قبل micromanipulator. شغل في النظام بأكمله مع زيت البارافين. وينبغي تجنب أي فقاعات الهواء، لأنها سوف تنال من نظام الحقن. يضيء الإعداد مع مصدر الضوء البارد. مطلوب مجهر تشريحي للسيطرة البصرية. وتصور بصيلات تحت الضوء البارد مع stereomicroscope (40X التكبير). يتم اختبار أداء الإعداد حقن عن طريق حقن التتبع المشعة في البويضات القيطم. وينبغي تسليم 55 NL في الحقن - وحدة تخزين من 45.
4. باستخدام ماصة مع طرف بلاستيكية معقمة، اختبار الإعداد عن طريق وضع قطرات من الماء المعقم على الداخل نظيفة من بالحرارة مقاومة للرطوبة (2 × 2 سم). تزج غيض من ماصة الحقن في هذه القطيرات، ثم قم بتشغيل المحرك لسحب المكبس (الضغط السلبي داخل ماصة الحقن).
   ملاحظة: يجب أن المياه تدخل ماصة وتشكيل واجهة مرئية مع النفط.
5. التراجع غيض من ماصة من الحبرية وتطبيق الضغط الايجابي إلى داخل ماصة الحقن. ينبغي أن تشكل قطرة ماء في غيض من ماصة الحقن.
6. التحضير للحقن المسام من بطانة لهم حتى مع القطبين النباتية مشيرا صعودا في الفجوات من شبكة من النايلون (G: 0.8 مم) لصقها على الجزء السفلي من بيطبق الثلاثية (60 ملم) مغطاة MBS.
7. الاستغناء 2 ميكرولتر من مرنا باستخدام ماصة مع طرف بلاستيكية معقمة على الداخل نظيفة من بالحرارة. خذ مرنا حتى في ماصة حقن عن طريق الضغط السلبي إلى داخل ماصة الحقن.
8. ضع ماصة حقن أكثر من جراب الفردية باستخدام micromanipulator.
9. إدراج إبرة حقن في مركز القطب النباتي وحقن 50 NL مرنا بمعدل تدفق 0.6 ميكرولتر / دقيقة عن طريق الضغط الإيجابي إلى داخل ماصة. انتظر 5-10 الصورة قبل إزالة معلومات سرية حقن ماصة من جراب لتجنب مرنا الهروب.
   ملاحظة: يجب حقن مرنا في (مصفر) القطب النباتية لتجنب الحقن في النواة، والذي يقع في نصف الكرة الحيوان.
10. نقل بصيلات حقن إلى طبق بيتري جديد (35 ملم) مليئة 2 مل من MBS. وضع الطبق في برودة النبيذ وضعت في 18 درجة مئوية. احتضان بصيلات حقن 1 -7 أيام قبل التسجيل، اعتمادا على هوية البروتين المعبر عنه حديثا.

3. تجريد من المسام (الشكل 3)

ملاحظة: كما هو مذكور أعلاه، البويضة بواسطة طبقة المحي، خلايا بصيلات، والنسيج الضام، والتي تحتوي على الأوعية الدموية ²⁴ تغطيتها، كما هو معروف "جراب". كل الطبقات باستثناء الطبقة المحي، الذي يوفر الاستقرار الميكانيكي دون منع وصول الحلول إلى سطح الخلية، ويجب إزالتها قبل التجارب الكهربية. وقد سبق أن وصفه المسام دون طبقات الخلايا المحيطة "المعري" البويضة ^25. وعادة ما يتم تنفيذ هذه الخطوة على نفس يوم التجارب الكهربية.

1. نقل عشرة حقن بصيلات إلى أنبوب البورسليكات الزجاج التي تحتوي على 0.5 مل من MBS، 1 ملغ / مل كولاجيناز، و 0.1 ملغ / مل مثبط التربسين. تزج الأنبوب في حمام مائي الحفاظ على 36 درجة مئوية. احتضانجراب لمدة 20 دقيقة ويهز الأنابيب في بعض الأحيان.
2. شطف بصيلات بنقلهم إلى أنبوب الثاني يحتوي على 1 مل من MBS في RT. تركها في الأنبوب لمدة حوالي 10 ثانية.
3. نقل بصيلات إلى أنبوب ثالث يحتوي على 0.5 مل من MBS المركزة مضاعفة تحتوي على 4 ملي الإثيلين غليكول مكرر (2-aminoethylether) - N، N، N '، N'- حمض tetraacetic (EGTA)، واحتضان لهم لمدة 4 دقائق في RT. هز أنبوب في بعض الأحيان.
   ملاحظة: حل مفرط التوتر (MBS تتركز بشكل مضاعف) يستخدم للحث على انكماش البويضات داخل طبقات الخلايا المسام، وبالتالي فصل طبقات الخلايا الجرابية من البويضة. وأضاف EGTA لكبح النشاط كولاجيناز.
4. شطف بصيلات بنقلهم إلى أنبوب الثاني يحتوي على 1 مل من MBS في RT. تركها في الأنبوب لمدة حوالي 10 ثانية.
5. نقل البويضات إلى طبق بتري (35 مم) التي تحتوي على 2 مل من MBS. تحت مجهر تشريحي، فصل المظاريف الخارجية من بصيلات بواسطةببساطة دفع البويضة المجردة بعيدا باستخدام حلقة البلاتين.
   ملاحظة: المغلفات الخارجية للالبويضات عصا بحزم إلى الطبق والثقافة، ويمكن فصلها بسهولة من البويضات. وبعض البويضات تفقد عفويا المظاريف الخاصة الخارجية وسيتم استردادها كما البويضات الجرداء. وقد أدى هذا الإجراء في إعداد مستقر نسبيا التي تحافظ على مظهر كروية من البويضات.

4. حل سريع التغيير في جميع أنحاء سيت

1. إجراء المشبك التجربة الجهد، كما هو موضح ^9،26.
2. تغيير في حل نظام الارواء التي تغذيها الجاذبية من خلال تحويل مفاتيح نضح على النحو المطلوب من قبل التجربة.
   1. تطبيق حل نضح في 6 مل / دقيقة من خلال الزجاج الشعرية مع قطرها الداخلي 1.35 مم، والفم والتي يتم وضعها عن 0.4 مم من سطح البويضة، للسماح التغيرات السريعة في تركيز ناهض حول البويضة.
      وكان معدل التغير في السابق تقدير ملاحظة:د الى 70٪ في أقل من 0.5 ق ^27.

النتائج

وقد خص البويضات القيطم ميكانيكيا خارج باستخدام حلقة البلاتين (الشكل 1). تم microinjected البويضات مع مرنا الترميز لGABA _ومفارز مستقبلات ألفا ₄ بيتا _2، δ، 0.5: 0.5: 2.5 fmol / البويضة (الشكل 2). بعد 4 د، وإزالة طبقات الخلايا الجرا?...

Discussion

الطرق الموضحة في هذه المقالة تحيد عن تلك المستخدمة تقليديا ^7-9. ذلك هو المعيار لفضح فصوص من المبيض إلى 1-2 ح العلاج كولاجيناز ^8؛ عزل التالفة، البويضات الجرداء. وضخها مع مرنا باستخدام أجهزة حقن التجارية. هذا الإجراء الكلاسيكي لديه عيوب التالية: 1) من المرجح أن ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	71380
KCl	Sigma	P-9541
NaHCO3	Sigma	S6014
MgSO4	Sigma	M-1880
CaCl2	Sigma	223560
Ca(NO3)2	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H3375
Penicilin/streptomycin	Gibco	15140-148	100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL
Platinum wire loop	home-made
Micropipette puller	Zeitz-Instruments GmBH	DMZ
Hamilton syringe	Hamilton	80300	10 μL, Type 701N
Thick walled polytetrafluoroethylene tubing	Labmarket GmBH		1.0 mm OD
Paraffin oil	Sigma	18512
Nylon net, G: 0.8 mm	ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG
Borosilicate glass tube	Corning	99445-12	PYREX
Collagenase NB Standard Grade	SERVA	17454
Trypsin inhibitor type I-S	Sigma	T-9003
EGTA	Sigma	E3389
Glass capillary	Jencons (Scientific ) LTD.	H15/10	1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus Limited	30-0019	1.0 OD x  0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection)
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus Limited	30-0044	1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp)
γ-Aminobutyric acid (GABA)	Sigma	A2129
3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC)	Sigma	P2016
grill motor	Faulhaber		DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2
micrometer screw	Kiener-Wittlin	10400	TESA, AR 02.11201
Sterile plastic transfer pipettes	Saint-Amand  Mfg.	222-20S