Xenopus ооциты: Оптимизированные методы микроинъекции, Удаление тироцит слоев и быстрые изменения в Решение электрофизиологических экспериментов

Резюме

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Аннотация

Xenopus ооцитов в качестве гетерологичной системе экспрессии белков, впервые был описан Гэрдон соавт. ¹ и широко используются с момента его открытия ( Список литературы 2 - 3, и ссылки в ней). Характерным , что делает ооцитов привлекательным для экспрессии чужеродных канала является низкое обилие эндогенных ионных каналов ^4. Эта система экспрессии, оказалась полезной для характеристики многих белков, среди которых лиганд-ионные каналы.

Экспрессия рецепторов ГАМК _А в Xenopus ооцитах , и их функциональных характеристик описана здесь, в том числе выделения ооцитов, микроинъекций кРНК, удаление фолликулярной клеточных слоев и быстрых изменений решений в электрофизиологических экспериментах. Процедуры были оптимизированы в этой лаборатории ^5,6 и отклоняются от тех , которые обычно используются ^7-9. Традиционно обнаженные ооциты получаютс длительной обработки коллагеназой яичника долей при комнатной температуре, и эти оголенных ооцитов микроинъекции мРНК. Используя оптимизированные методы, различные мембранные белки были выражены и изучены с помощью этой системы, такие как рекомбинантные рецепторы ГАМК _А ^10-12, рекомбинантный человеческий хлорид каналов ^13, трипаносом калиевые каналы ¹⁴ и мио -inositol транспортером ^{15, 16.}

Методы , подробно описанные здесь , могут быть применены к экспрессии любого белка выбора в Xenopus ооцитах, а также быстрое изменение раствор может быть использован для изучения других ионных каналов лигандами.

Введение

Xenopus ооциты широко используются в качестве системы экспрессии (Ссылки 2 - 3 и ссылки в ней). Они способны правильно собрать и включить функционально активные белки мультисубъединичный в их плазматических мембран. С помощью этой системы можно функционально исследовать мембранные белки, по отдельности или в сочетании с другими белками, с целью изучения свойств мутировавших, химерные или сцепленных белков, а также для скрининга потенциальных лекарственных средств.

Преимущества использования ооцитов по сравнению с другими гетерологичных системах экспрессии включают простую обработку гигантских клеток, высокую долю клеток, экспрессирующих иностранную генетическую информацию, простое управление окружающей средой ооцита с помощью ванны перфузией, а также контроль мембранного потенциала ,

Недостатком этой системы экспрессии является сезонное изменение наблюдается во многих лабораториях ^17-20. Причиной этого изменениядалеко не ясно. Кроме того, качество ооцитов часто наблюдается в сильно различаться. Традиционные методы ^7-9 включили изоляцию яичник долей, подверженность яичник долей к коллагеназы в течение некоторого ч, выбор оголенных ооцитов, и ооцитов микроинъекции. Здесь целый ряд альтернативных, быстрых процедур сообщили, что позволили нам работать с этим выражением системы в течение более 30 лет без сезонных колебаний и небольшим изменением качества ооцитов.

Модифицированные и усовершенствованные способы , описанные здесь , для выделения ооцитов, микроинъекции с кРНК, и удаления фолликулярной клеточных слоев могут быть использованы для экспрессии любого белка выбора в ооцитах Xenopus. Самый простой способ для быстрого изменения растворе среды вокруг ооцита могут быть применены к изучению любого лиганда ионными канала и носителей.

протокол

Эксперименты на животных были одобрены местным комитетом кантона Берн Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Берн (BE85 / 15).

1. Приготовление Xenopus ооцитов

1. Поддержание лягушки (Xenopus Laevis) на 12 ч / 12 ч цикл свет / темнота в воде, строго выдерживают при температуре 20 ° С.
2. Удалить мочки яичников из женских лягушек ^9.
   Примечание: Удаление лепестков является стимулом для регенерации, и часто качество ооцитов улучшается с хирургическим вмешательством. Ооцит покрыта желточного слой, слой фолликулярных клеток и соединительной ткани , содержащей кровеносные сосуды ^21. Вся структура называется "фолликул."
3. Поместите мочки яичников , которые плотно упакованы с фолликулами , содержащих ооциты в стерильных Барта Saline ⁷ (MBS) с добавлением пенициллина и стрептомицина (88 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 2,4 мМРаствором NaHCO _3, 0,82 мМ MgSO _4, 0,41 мМ CaCl _2, 0,33 мМ Са (NO _{3) 2,} 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота; HEPES (рН 7,5, NaOH), 100 мкг / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина).
4. Single-аут этап V-VI ²¹ фолликулы. Удерживая яичник лопасть с пинцетом. Опустите платиновую петлю (рисунок 1) над фолликулах и осторожно снять петлю , чтобы сорвать соединительную ткань , содержащую фолликула из яичника ткани.
   Примечание: Этап V-VI ²¹ фолликулы характеризуются своим размером (1,0 - 1,2 мм в диаметре) и в хороший контраст между темной пигментированной животного полусферы и желтоватым вегетативного полушария.
5. Передача только здоровый вид фолликулы (т.е. идеально сферической формы и с неповрежденной пигментации) до диаметра чашки Петри 35 мм с помощью пластиковой пипетки Пастера (отрезать заднюю часть к диаметром отверстия 1,5 мм).

2. Микроинъекция мРНК в цитоплазму

Примечание: Система микроинъекции , описанная здесь, получена от сообщает Kressmann и Birnstiel ^22.

1. Готовят CRNAs из соответствующих кДНК , кодирующих субъединицы & alpha ; ₄ β ₂ б ГАМК - рецептора с помощью транскрипции в пробирке, добавление поли (A ⁺⁾ хвост и количественного определения РНК с помощью гель - электрофореза ^23.
2. Подготовка микроинъекции пипетки из боросиликатного стекла капилляров (1,0 мм наружный диаметр (OD), 0,58 мм внутренний диаметр (ID), длина 100 мм) с использованием микропипетки съемник. Оторвать кончики стеклянных капилляров под микроскопом с помощью микроманипулятора и микрофиламентов, чтобы создать диаметр наконечника 12 - 15 мкм со скошенным кончиком.
3. Засыпка микроинъекции пипетки с парафиновым маслом, используя шприц объемом 10 мл, а затем смонтировать микроинъекции пипетки на MICR в самодельныхoinjection устройство (рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гидравлическое устройство впрыска самодельный масло состоит из гриля двигателя, управляемого с помощью переключателя ножной педали. Дополнительный переключатель изменяет режим поворотом двигателя. Этот двигатель приводит в действие микрометрический винт (0,5 мм / оборот), который продвигает или втягивает поршень стеклянный шприц 10 мкл. Инъекции со скоростью около 3 оборотов в минуту и ​​0,5 поворот соответствует 50 нл инъекции в фолликул. Наконечник шприца соединяется с толстостенного политетрафторэтилена трубки, которая сама по себе, соединенного с инъекционной иглой очень коротким куском Tygon трубки. Инъекция капиллярная удерживается сверлильный патрон, который контролируется микроманипулятор. Вся система заполнена парафиновым маслом. Пузырьки воздуха, следует избегать, так как они будут ухудшать системы впрыска. Установка горит с холодным источником света. Высококласнный стереоскопический требуется для оптического контроля. Фолликулы визуализируются под холодным светом с stereomicroscope (40X увеличение). Производительность установки впрыска проверяется путем инъекции радиоактивного трассера в Xenopus ооцитах. Объем 45 - 55 нл должен быть доставлен на одну инъекцию.
4. С помощью пипетки со стерильным пластмассовым наконечником, проверить настройку путем размещения каплю стерильной воды на чистую внутри влагонепроницаемой термопластиком (2 х 2 см). Погрузить кончик инъекционной пипетки в эту капельку, а затем включите двигатель для втягивания поршня (отрицательное давление внутри инъекционной пипетки).
   Примечание: Вода должна войти в пипетку и образуют видимый интерфейс с маслом.
5. Отвод кончик пипетки от капли и применять положительное давление на внутренней стороне инъекционной пипетки. Каплю воды образуется на кончике инъекционной пипеткой.
6. Подготовка к инъекции фолликулов, выравнивая их с вегетативного полюса, направленная вверх в зазорах нейлоновой сеткой (G: 0,8 мм), приклеенных к нижней части Peтри тарелки (60 мм) покрыты MBS.
7. Разливают 2 мкл мРНК с помощью пипетки со стерильным пластиковым наконечником на чистую внутри термопластиком. Возьмем мРНК вверх в инъекционной пипеткой с помощью отрицательного давления на внутренней части инъекционной пипеткой.
8. Поместите инъекции пипетки над индивидуальной фолликула с помощью микроманипулятора.
9. Вставьте инъекционную иглу в центр вегетативного полюса и вводят 50 нл мРНК при скорости потока 0,6 мкл / мин с применением положительного давления на внутренней стороне пипеткой. Подождите 5 - 10 сек перед удалением кончика пипетки инъекции из фолликула, чтобы избежать побега мРНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: мРНК следует вводить в вегетативном (желтоватым) полюса, чтобы избежать инъекции в ядро, которое находится в животном полушарии.
10. Перенесите инъекционные фолликулы на новую чашку Петри (35 мм), заполненную 2 мл MBS. Поместите блюдо в винный холодильник установлен на уровне 18 ° C. Инкубируют инжектированных фолликулы в течение 1 -7 d перед записью, в зависимости от идентичности вновь экспрессированного белка.

3. Вскрытие фолликулы (Рисунок 3)

Примечание: Как упоминалось выше, ооцит покрыта слоем желточной, фолликулостимулирующий клеток и соединительной ткани, которая содержит кровеносные сосуды ^24, известен как "фолликула." Все слои для желточной слоя, который обеспечивает механическую стабильность, не препятствуя доступу решений к клеточной поверхности, за исключением, должны быть удалены до электрофизиологических экспериментов. Фолликул без окружающих слоев клеток ранее называют "оголенный" ооцит ^25. Этот этап, как правило, выполняется в тот же день, что и электрофизиологических экспериментов.

1. Передача десять впрыскивается в фолликул боросиликатного стеклянную пробирку, содержащую 0,5 мл MBS, 1 мг / мл коллагеназы и 0,1 мг / мл ингибитора трипсина. Погрузить трубку в водяной бане при 36 ° C. Выдержитефолликулы в течение 20 мин и встряхнуть пробирки иногда.
2. Промыть фолликулы путем переноса их на вторую пробирку, содержащую 1 мл МБС при комнатной температуре. Оставьте их в трубе в течение примерно 10 секунд.
3. Передача фолликулы в третью пробирку , содержащую 0,5 мл двукратно концентрированного МБС , содержащем 4 ммоль этиленгликоль-бис (2-аминоэтиловый эфир) - N, N, N ', N' - этилендиаминтетрауксусной кислоты (EGTA), и инкубировать их в течение 4 мин при RT. Встряхнуть пробирку иногда.
   Примечание: гипертонический раствор (дважды концентрированные МБС) используется, чтобы вызвать усадку ооцитов внутри фолликула клеточных слоев, таким образом, отсоединение фолликулярных клеточные слои от ооцита; EGTA добавляется ингибировать активность коллагеназы.
4. Промыть фолликулы путем переноса их на вторую пробирку, содержащую 1 мл МБС при комнатной температуре. Оставьте их в трубе в течение примерно 10 секунд.
5. Перенесите ооциты в чашку Петри (диаметр 35 мм), содержащих 2 мл MBS. Под стереомикроскопа, отделить внешние конверты из фолликулов с помощьюпросто нажав на голую яйцеклетку прочь используя платиновую петлю.
   Примечание: Внешние конверты ооцитов твердо придерживаться к культуре блюдо и может быть легко отделена от ооцитов. Некоторые ооциты самопроизвольно теряют свои внешние конверты и будут восстановлены, как оголенных ооцитов. Эта процедура приводит к относительно стабильной подготовки, которая держит сферический внешний вид ооцитов.

4. Быстрое решение Изменение вокруг ооцита

1. Выполните зажим эксперимент напряжения, как описано ^9,26.
2. Измените решение самотечных перфузионной системы путем поворота перфузионных переключатели в соответствии с требованиями эксперимента.
   1. Применяют перфузионный раствор в 6 мл / мин с помощью стеклянного капилляра с внутренним диаметром 1,35 мм, устье которой находится около 0,4 мм от поверхности ооцита, чтобы обеспечить быстрое изменение концентрации агониста вокруг ооцита.
      Примечание: Скорость изменения была ранее оценкаd 70% менее чем за 0,5 с ^27.

Результаты

Xenopus ооциты механически выделены с использованием платиновой петлей (Рисунок 1). Яйцеклетки были микроинъекции с мРНК , кодирующей GABA _A субъединицы рецептора альфа _4, агонист _2, б, 0,5: 0,5: 2,5 фмоль / ооцитов (рисунок 2). После 4 дней, фол?...

Обсуждение

Методы , описанные в этой статье , отклоняются от тех , которые используются традиционно ^7-9. Общепринято подвергать мочки яичника 1 до 2 ч лечения ⁸ коллагеназы; изолировать неповрежденные, денудированные ооцитов; и вводят их с мРНК с использованием коммерческих устройств для ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	71380
KCl	Sigma	P-9541
NaHCO3	Sigma	S6014
MgSO4	Sigma	M-1880
CaCl2	Sigma	223560
Ca(NO3)2	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H3375
Penicilin/streptomycin	Gibco	15140-148	100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL
Platinum wire loop	home-made
Micropipette puller	Zeitz-Instruments GmBH	DMZ
Hamilton syringe	Hamilton	80300	10 μL, Type 701N
Thick walled polytetrafluoroethylene tubing	Labmarket GmBH		1.0 mm OD
Paraffin oil	Sigma	18512
Nylon net, G: 0.8 mm	ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG
Borosilicate glass tube	Corning	99445-12	PYREX
Collagenase NB Standard Grade	SERVA	17454
Trypsin inhibitor type I-S	Sigma	T-9003
EGTA	Sigma	E3389
Glass capillary	Jencons (Scientific ) LTD.	H15/10	1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus Limited	30-0019	1.0 OD x  0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection)
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus Limited	30-0044	1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp)
γ-Aminobutyric acid (GABA)	Sigma	A2129
3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC)	Sigma	P2016
grill motor	Faulhaber		DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2
micrometer screw	Kiener-Wittlin	10400	TESA, AR 02.11201
Sterile plastic transfer pipettes	Saint-Amand  Mfg.	222-20S