Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten

Zusammenfassung

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Zusammenfassung

Die Xenopus Oozyten als heterologe Expressionssystem für Proteine, wurde zuerst von Gurdon et al. ¹ und wurde seit seiner Entdeckung weit verbreitet (Referenzen 2 - 3 und Referenzen darin). Ein Merkmal, das die Eizelle attraktiv für ausländische -Kanalexpression macht , ist die schlechte Fülle von endogenen Ionenkanäle ^4. Dieses Expressionssystem hat sich als nützlich für die Charakterisierung vieler Proteine ​​erwiesen, darunter Liganden-gesteuerte Ionenkanäle.

Die Expression von GABA - _A - Rezeptoren in Xenopus - Oozyten und ihre funktionelle Charakterisierung wird hier beschrieben, einschließlich der Isolierung von Oozyten, Mikroinjektionen mit cRNA, die Entfernung von follikulären Zellschichten und eine schnelle Lösung Veränderungen in elektrophysiologischen Experimenten. Die Verfahren wurden in diesem Labor ^5,6 optimiert und weichen von den routinemäßig verwendeten ^7-9 diejenigen. Traditionell werden entblößte Eizellen vorbereitetmit einer verlängerten Kollagenase Behandlung von Ovar Keulen bei RT und diese entblößte Oozyten werden mit mRNA mikroinjiziert. Verwendung der optimierten Methoden, diverse Membranproteine wurden mit diesem System exprimiert und untersucht, wie rekombinante GABA _A -Rezeptoren ^10-12, humanem rekombinantem Chloridkanäle ^13, Trypanosom Kaliumkanäle ¹⁴ und eine myo - Inositol - Transporter ^{15, 16.}

Die Methoden , die hier beschrieben werden , können zur Expression jedes Proteins der Wahl in Xenopus Oozyten angewendet werden, und die schnelle Lösung Änderung verwendet werden kann andere Liganden-gesteuerte Ionenkanäle zu untersuchen.

Einleitung

Xenopus Oozyten werden als Expressionssystem (- 3 und den darin References 2) weit verbreitet. Sie sind in der Lage, richtig montieren und funktionell aktiven Multiunter Proteine ​​in ihre Plasmamembranen integrieren. Mit diesem System ist es möglich, Membranproteine ​​allein oder in Kombination mit anderen Proteinen funktionell zu untersuchen, um die Eigenschaften von mutierten, chimäre oder verketteten Proteine ​​zu studieren, und potentielle Arzneimittel zu screenen.

Vorteile von Oozyten über andere heterologe Expressionssysteme umfassen die einfache Handhabung der Riesenzellen, die hohen Anteil an Zellen, die fremde genetische Information, die einfache Steuerung der Umgebung der Oocyte durch Bad-Perfusion, und die Kontrolle des Membranpotentials mit Hilfe .

Der Nachteil dieses Expressionssystem ist die saisonalen Schwankungen in vielen Laboratorien , ^17-20. Der Grund für diese Variationbei weitem nicht klar ist. Zusätzlich wird die Qualität der Oozyten oft stark zu variieren beobachtet. Traditionelle Methoden ^7-9 haben die Isolierung von Ovar Keulen, die Exposition von Ovar Keulen zu Kollagenase für einige Stunden, um die Auswahl von entblößte Eizellen und die Eizelle Mikroinjektions enthalten. Hier wird eine Reihe von alternativen, schnellen Verfahren berichtet, dass erlaubt haben, uns mit diesem Expressionssystem arbeiten, um für mehr als 30 Jahren ohne saisonale Schwankungen und eine geringe Variation in Oozytenqualität.

Die modifizierten und verbesserten Methoden , die hier für die Isolierung von Oozyten beschrieben, die Mikroinjektion mit cRNA und Entfernung von follikulären Zellschichten können für die Expression von jedem Protein der Wahl in der Xenopus Oozyten verwendet werden. Die sehr einfache Methode für die schnelle Lösung Änderungen des Mediums, um die Eizelle kann auf die Untersuchung von jeder ligandengesteuerten Ionenkanal und von Trägern aufgetragen werden.

Protokoll

Tierversuche wurden vom lokalen Komitee des Kantons Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15) zugelassen.

1. Herstellung von Xenopus - Oozyten

1. Pflegen Frösche (Xenopus laevis) auf einem 12 h / 12 h Hell / Dunkel - Zyklus in Wasser , das streng bei 20 ° C gehalten wird.
2. Entfernen Sie die Lappen der Ovarien von weiblichen Frösche ^9.
   HINWEIS: Die Entfernung der Lappen ist ein Anreiz für die Regeneration und häufig die Qualität der Oozyten verbessert sich mit der Operation. Die Eizelle wird durch eine Dotterschicht, eine Schicht von Follikelzellen und Bindegewebe enthalten , die Blutgefäße ²¹ abgedeckt. Die gesamte Struktur ist die "Follikel" bezeichnet.
3. Legen Sie die Lappen der Ovarien , die dicht gepackt sind mit den Follikeln die Eizellen in sterilen Barth Saline ⁷ (MBS) , ergänzt mit Penicillin und Streptomycin (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mMNaHCO _3, 0,82 mM MgSO _4, 0,41 mM CaCl _2, 0,33 mM Ca (NO _{3) 2,} 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 ug / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin).
4. Einzel-out Stufe V-VI ²¹ Follikel. Halten Sie die Ovar Lappen mit einer Pinzette. Senken Sie die Platin - Schleife (Abbildung 1) über die Follikel und sanft die Schleife zurückziehen das Bindegewebe mit dem Follikel aus dem Eierstockgewebe zu zerstören.
   HINWEIS: Stufe V-VI ²¹ Follikel durch ihre Größe gekennzeichnet sind (1,0 bis 1,2 mm Durchmesser) und durch den guten Kontrast zwischen dem dunklen pigmentierten Tier Hemisphäre und der gelblichen pflanzlichen Hemisphäre.
5. Übertragen Sie nur gesund aussehende Follikel (dh perfekt sphärisch und mit intakten Pigmentierung) zu einem Durchmesser von 35 mm Petrischale mit Hilfe einer Plastik Pasteur - Pipette (schneiden Sie die zurück zu einem Öffnungsdurchmesser von 1,5 mm).

2. Mikroinjektion von mRNA in das Zytoplasma

Anmerkung: Die hier beschriebenen Mikroinjektionssystem von der durch Kressmann und Birnstiel ²² berichtet abgeleitet ist.

1. Bereiten cRNAs von den entsprechenden cDNAs kodierend für die Untereinheiten der α ₄ β ₂ δ GABA _A Rezeptor durch in vitro Transkription, die Zugabe eines Poly (A ⁺⁾ -Schwanz und RNA Quantifizierung durch Gelelektrophorese ^23.
2. Bereiten Sie die Mikroinjektion Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren (1,0 mm Außendurchmesser (OD), 0,58 mm Innendurchmesser (ID), 100 mm Länge) mit einer Mikropipette Puller. Brechen Sie die Spitzen der Glaskapillaren unter einem Mikroskop mit einem Mikromanipulator und microfilament mit einem Spitzendurchmesser von 12 zu schaffen - 15 & mgr; m mit einer abgeschrägten Spitze.
3. Verfüllen die Mikroinjektionspipette mit Paraffinöl mit einem 10-ml-Spritze und dann montieren Sie die Mikroinjektionspipette auf ein selbstgebautes microinjection Vorrichtung (Abbildung 2).
   HINWEIS: Die Selbstbau ölhydraulische Injektionsgerät besteht aus einem Grill Motor durch einen Fußschalter gesteuert. Ein zusätzlicher Schalter verändert den Drehbetrieb des Motors. Dieser Motor treibt eine Mikrometerschraube (0,5 mm / Umdrehung), die vor- oder zurückzieht, um den Kolben einer 10 & mgr; l-Glasspritze. Die Injektion mit einer Geschwindigkeit von etwa 3 Upm und eine 0,5 wiederum entspricht einer 50 nL Injektion in einen Follikel. Die Spitze der Spritze verbunden ist dickwandig Polytetrafluorethylen Schlauch, der sich an der Injektionsnadel durch ein sehr kurzes Stück Tygon-Schlauch verbunden ist. Die Injektions Kapillare wird durch ein Bohrfutter gehalten, die von einem Mikromanipulator gesteuert wird. Das gesamte System wird mit Paraffinöl gefüllt. Luftblasen sollten vermieden werden, da sie das Injektionssystem beeinträchtigt. Die Einrichtung ist mit einer Kaltlichtquelle beleuchtet. Ein Stereomikroskop ist für die optische Kontrolle erforderlich. Follikeln unter kaltem Licht mit einer stereomicr sichtbar gemachtOscope (40-facher Vergrößerung). Leistung der Einspritzaufbau wird durch die Injektion von radioaktiven Tracers in Xenopus Oozyten getestet. Ein Volumen von 45 - 55 nL sollte pro Injektion geliefert werden.
4. Mit einer Pipette mit einem sterilen Kunststoffspitze, testen Sie die Konfiguration durch einen Tropfen steriles Wasser auf die saubere innerhalb eines feuchtigkeitsbeständigen thermoplastischen Platzierung (2 x 2 cm). Tauchen Sie die Spitze der Injektionspipette in diesem Tröpfchen, und dann den Motor drehen Sie den Kolben (Unterdruck im Inneren der Injektionspipette) zurückzuziehen.
   HINWEIS: Das Wasser sollte die Pipette eingeben und eine sichtbare Schnittstelle mit dem Öl bilden.
5. Ziehen Sie die Spitze der Pipette aus dem Tröpfchen und gelten Überdruck auf der Innenseite der Injektionspipette. Ein Wassertröpfchen sollte an der Spitze der Injektionspipette bilden.
6. Vorbereitung für das Einspritzen der Follikel, indem sie sich mit den pflanzlichen Pole nach oben zeigend in den Zwischenräumen ein Nylonnetz (G: 0,8 mm) geklebt Futter auf den Boden eines Petri Schale (60 mm) mit MBS abgedeckt.
7. Dispense 2 & mgr; l der mRNA eine Pipette mit einer sterilen Plastikspitze auf die saubere innerhalb eines thermoplastischen verwenden. Nehmen Sie die mRNA nach oben in die Injektionspipette durch Unterdruck auf der Innenseite der Injektionspipette aufgebracht wird.
8. Positionieren Sie die Injektionspipette über einen einzelnen Follikel mit dem Mikromanipulator.
9. Legen Sie die Injektionsnadel in der Mitte des vegetativen Pol und injizieren 50 nL der mRNA bei einer Flussrate von 0,6 & mgr; l / min durch Überdruck auf der Innenseite der Pipette angelegt wird. Warten von 5 bis 10 s vor der Injektion Pipettenspitze aus dem Follikel zu entfernen mRNA Flucht zu verhindern.
   HINWEIS: Die mRNA sollte in das pflanzliche (gelblich) Pol injiziert werden, die Injektion in den Nucleus zu vermeiden, die in der Tier Hemisphäre befindet.
10. Übertragen Sie die injizierten Follikel auf eine neue Petrischale (35 mm), gefüllt mit 2 ml MBS. Die Schale in einen Weinkühler auf 18 ° C eingestellt. Inkubieren der injizierten Follikel für 1 -7 d vor der Aufnahme in Abhängigkeit von der Identität des neu exprimierten Proteins.

3. Abisolieren der Follikel (Figur 3)

HINWEIS: Wie oben erwähnt, ist die Eizelle von einem vitelline Schicht Follikelzellen bedeckt und Bindegewebe, die die Blutgefäße ²⁴ enthält, ist bekannt als "Follikel." Alle Schichten mit Ausnahme der Dotterschicht, die ohne verhindert den Zugang von Lösungen an die Zelloberfläche mechanische Stabilität bietet, muss vor elektrophysiologischen Experimenten entfernt werden. Der Follikel ohne die umgebenden Zellschichten hat zuvor eine "entblößten" Eizelle ²⁵ bezeichnet worden. Dieser Schritt wird in der Regel am selben Tag wie die elektrophysiologischen Experimenten durchgeführt.

1. Transfer zehn injiziert Follikel mit einem Rohr Borosilicatglas 0,5 ml MBS, 1 mg / ml Kollagenase und 0,1 mg / ml Trypsin-Inhibitor enthält. Eintauchen des Rohres in ein Wasserbad bei 36 ° C gehalten. inkubieren derFollikel für 20 Minuten und schütteln gelegentlich die Rohre.
2. Spülen Sie die Follikel, indem sie in ein zweites Röhrchen, das 1 ml MBS bei RT übertragen. Lassen Sie sie für etwa 10 s in die Röhre.
3. Übertragung der Follikel mit einem dritten Rohr mit 0,5 ml doppelt konzentrierter MBS , enthaltend 4 mM Ethylenglycol-bis (2-aminoethylether) - N, N, N ', N'- tetraessigsäure (EGTA), und inkubiere sie für 4 min bei RT. Das Röhrchen wird gelegentlich.
   HINWEIS: Die hypertonischen Lösung (doppelt konzentriert MBS) wird verwendet, innerhalb Follikel Zellschichten Schrumpfung der Eizellen zu induzieren, wodurch follikulären Zellschichten von der Eizelle löst; EGTA zugegeben Kollagenase-Aktivität zu hemmen.
4. Spülen Sie die Follikel, indem sie in ein zweites Röhrchen, das 1 ml MBS bei RT übertragen. Lassen Sie sie für etwa 10 s in die Röhre.
5. Übertragen Sie die Eizellen in eine Petrischale (35 mm Durchmesser), die 2 ml MBS. Unter einem Stereomikroskop, trennen Sie die äußeren Hüllen aus den Follikeln voneinfaches Drücken die nackte Eizelle entfernt die Platin-Schleife.
   HINWEIS: Die äußeren Einhüllenden der Oozyten fest an der Kulturschale haften und leicht aus den Oozyten getrennt werden können. Einige Eizellen spontan ihre äußeren Hüllen verlieren und als entblößte Eizellen gewonnen werden. Dieses Verfahren führt zu einer relativ stabilen Präparation, die die kugelförmige Erscheinung der Oozyten hält.

4. Schnelle Lösung Ändern Sie rund um die Oozyten

1. Führen Sie eine Spannungsklemm Experiment, wie ^9,26 beschrieben.
2. Ändern, um die Lösung der Schwerkraft gespeisten Perfusionssystem durch die Perfusion Schalter drehen, wie durch den Versuch benötigt.
   1. Gelten die Perfusionslösung bei 6 ml / min durch eine Glaskapillare mit einem Innendurchmesser von 1,35 mm, die Mündung davon platziert ist etwa 0,4 mm von der Oberfläche der Oozyte, schnelle Veränderungen der Agonistenkonzentration zu erlauben um die Eizelle.
      HINWEIS: Die Änderungsrate war vorher Schätzungd als 70% in weniger als 0,5 s ^27.

Ergebnisse

Xenopus - Oozyten wurden mit einer Platinöse mechanisch herausgehoben (Figur 1). 0,5: 2,5 fmol / Oocyte (Abbildung 2) Die Oozyten wurden mit mRNA kodierend für den GABA _A -Rezeptor - Untereinheiten & agr; ₄ & bgr; _2, δ, 0,5 mikroinjiziert. Nach 4 d wurden follicular Zellschichten entfernt werden (Abbildung 3). Oocyten wurden Spannung bei -80 mV eingespannt und ausgesetzt steigenden Kon...

Diskussion

Die Methoden , die in diesem Artikel beschriebenen abweichen von denen traditionell ^7-9 verwendet. Es ist Standard , um die Lappen der Ovarien auf eine 1 bis 2 h Kollagenasebehandlung ⁸ zu exponieren; isolieren unbeschädigte, entblößte Eizellen; und injizieren sie mit mRNA kommerzielle Injektionsgeräte verwenden. Dieses klassische Verfahren hat die folgenden Nachteile: 1) Die Oozyten werden wahrscheinlich durch die lange Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von Kollagenase beschädigt we...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	71380
KCl	Sigma	P-9541
NaHCO3	Sigma	S6014
MgSO4	Sigma	M-1880
CaCl2	Sigma	223560
Ca(NO3)2	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H3375
Penicilin/streptomycin	Gibco	15140-148	100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL
Platinum wire loop	home-made
Micropipette puller	Zeitz-Instruments GmBH	DMZ
Hamilton syringe	Hamilton	80300	10 μL, Type 701N
Thick walled polytetrafluoroethylene tubing	Labmarket GmBH		1.0 mm OD
Paraffin oil	Sigma	18512
Nylon net, G: 0.8 mm	ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG
Borosilicate glass tube	Corning	99445-12	PYREX
Collagenase NB Standard Grade	SERVA	17454
Trypsin inhibitor type I-S	Sigma	T-9003
EGTA	Sigma	E3389
Glass capillary	Jencons (Scientific ) LTD.	H15/10	1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus Limited	30-0019	1.0 OD x  0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection)
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus Limited	30-0044	1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp)
γ-Aminobutyric acid (GABA)	Sigma	A2129
3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC)	Sigma	P2016
grill motor	Faulhaber		DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2
micrometer screw	Kiener-Wittlin	10400	TESA, AR 02.11201
Sterile plastic transfer pipettes	Saint-Amand  Mfg.	222-20S