إعادة بناء واسعة النطاق والمستقل، تجميع غير متحيز واستنادا المورفولوجية المقاييس لتصنيف الخلايا العصبية في الانتقائي السكان

Summary

يصف هذا البروتوكول إعادة البناء على نطاق واسع من السكان العصبية انتقائية، وصفت بعد الإصابة الوراء مع فيروس داء الكلب المعدلة ويعبرون عن علامات الفلورسنت، ومستقلة، مجموعة مشاركات التحليلات التي تمكن توصيف شامل من المقاييس المورفولوجية بين الفئات الفرعية العصبية متميزة.

Abstract

ويحدد هذا البروتوكول إعادة البناء على نطاق واسع من الخلايا العصبية جنبا إلى جنب مع استخدام التجميع مستقلة وغير منحازة التحليلات لإنشاء مسح شامل لالخصائص المورفولوجية لوحظ بين السكان العصبية انتقائية. الجمع بين هذه التقنيات يشكل نهجا رواية لجمع وتحليل البيانات تشريحي عصبي. معا، وتمكن هذه التقنيات على نطاق واسع، وبالتالي أكثر شمولا، وأخذ عينات من السكان العصبية انتقائية وتحدد الأساليب الكمية مشاركات لوصف الطبقات العصبية فريدة شكليا ضمن مجموعة من السكان.

يحدد البروتوكول استخدام فيروس داء الكلب المعدلة لتسمية انتقائي الخلايا العصبية. G-حذف أفعال فيروس داء الكلب مثل التتبع الوراء بعد الحقن التجسيمي في بنية الدماغ الهدف من الفائدة وبمثابة وسيلة لإيصال والتعبير عن EGFP في الخلايا العصبية. يصاب عدد كبير من الخلايا العصبية باستخدام هذاتقنية والتعبير عن GFP طوال التشعبات، وإنتاج يملأ كاملة من الخلايا العصبية الفردية "جولجي مثل". وفقا لذلك، ويحسن طريقة تتبع الوراء بوساطة فيروس على تقنيات تتبع الوراء التقليدية قائم على الأصباغ التي تنتج يملأ داخل الخلايا كاملة.

ويتم اختيار الفردية الخلايا العصبية معزولة جيدا تغطي جميع مناطق منطقة الدماغ تحت الدراسة لإعادة الإعمار من أجل الحصول على عينة تمثيلية من الخلايا العصبية. يحدد البروتوكول إجراءات لإعادة بناء أجسام الخلايا وإكمال أنماط تشجر شجيري من الخلايا العصبية المسماة تمتد أقسام الأنسجة المتعددة. يتم استخراج البيانات الشكلية، بما في ذلك مواقف كل الخلايا العصبية داخل بنية الدماغ، لمزيد من التحليل. واستخدمت وظائف البرمجة القياسية لأداء مجموعة مستقلة التحليلات والتقييمات العنقودية على أساس المقاييس المورفولوجية. للتحقق من جدوى هذه التحليلات والتقييم الإحصائي لPERFO التحليل العنقوديrmed على 160 الخلايا العصبية بناؤها في النواة الشبكية المهادية من المهاد (TRN) من قرد المكاك كان. كل من التحليل العنقودي الأصلي والتقييمات الإحصائية يؤديها هنا تشير إلى أن يتم فصل الخلايا العصبية TRN إلى ثلاث مجموعات سكانية فرعية، لكل منها خصائصها المورفولوجية فريدة من نوعها.

Introduction

التشريح هي واحدة من أسس علم الأعصاب ¹ والفائدة الأخيرة في "connectomics" جددت الحماس لفهم التنوع الصرفي من السكان العصبية والروابط بين الخلايا العصبية الخاصة ^2. طرق لوضع العلامات والخلايا العصبية إعمار قد تحسنت بشكل كبير مع الابتكارات الحديثة، بما في ذلك وراثي وبوساطة فيروس تتبع الدائرة النهج ^{3، 4،} تمكين استطلاعات المورفولوجية أشمل من السكان العصبية ^5. وبالإضافة إلى التحسينات في وصفها الخلايا العصبية الفردية، وظهرت تقنيات تحليل البيانات الكمية أيضا أن تتيح تصنيف مستقل وغير متحيز من الخلايا العصبية في مجموعات سكانية فرعية مختلفة تعتمد على البيانات المورفولوجية ^{5، 6.} هذه التقنيات مشاركات هي تحسنا على أكثر التقليديهل أساليب تصنيف النوعية التي كانت المعايير في هذا المجال لأكثر من قرن. الهدف من هذه الدراسة هو تحديد، خطوة بخطوة، ومزيج من العلامات بوساطة الفيروس من الخلايا العصبية داخل الكتلة السكانية انتقائية، إعادة البناء على نطاق واسع لعينة شاملة من هذه الخلايا العصبية، وتحليل البيانات الكمية على أساس تجميع مستقل مع التقييم الإحصائي. من خلال الجمع بين هذه الأساليب، ونحن الخطوط العريضة لنهج جديد تجاه جمع وتحليل البيانات تشريحي عصبي لتسهيل أخذ العينات شاملة وتصنيف غير متحيز من أنواع الخلايا العصبية فريدة شكليا ضمن مجموعة من السكان العصبية انتقائية.

وكمثال على هذه الأساليب، وصفنا تحليلنا لعدد كبير من الخلايا العصبية في قطاع واحد من النواة الشبكية المهادية (TRN) من قرد المكاك. وهذه البيانات هي من دراسة مسبقة ^7. طرق لوصفها بشكل انتقائي الخلايا العصبية TRN إسقاط لlatera الظهريةل الركبي نواة المهاد (dLGN) باستخدام حقن الجراحي لفيروس داء الكلب تعديل ترميز EGFP ^{4، 8} (انظر الجدول مواد معينة / المعدات، الصف 2) تم تفصيلها. هذا فيروس داء الكلب المعدلة ويفتقر إلى الجينات ترميز بروتين معطف أساسي، والقضاء على الحركة عبر متشابك من الفيروس. وبمجرد أن يدخل الفيروس محطات محوار في موقع الحقن، أنه يتصرف مثل التتبع الوراء التقليدي مع فائدة هامة من القيادة التعبير EGFP في جميع أنحاء تشجر شجيري كامل من الخلايا العصبية المصابة ^{5، 9، 10.} وفقا لذلك، وهذا فيروس داء الكلب-حذف G يمكن استخدامها لتصيب بشكل انتقائي وتسمية أية مجموعة من السكان الخلايا العصبية بعد الحقن ونقل إلى الوراء.

من أجل إجراء تحليل شامل للسكان العصبية محددة، من المهم أخذ عينات منتوزيع واسعة من الخلايا العصبية في أوساط السكان. لأن تقنية وضع العلامات بوساطة فيروس تنتج داخل الخلايا كاملة "، جولجي مثل" تملأ العديد من الخلايا العصبية مع المحاور في موقع الحقن الفيروس، فمن الممكن لإعادة عينة كبيرة جدا من الخلايا العصبية في المدى الكامل للبنية الدماغ. بالإضافة إلى ذلك، لأن فيروس داء الكلب المعدلة وفعال جدا في إصابة وصفها أعداد كبيرة من الخلايا العصبية، فمن الممكن لإعادة بناء مئات من الخلايا العصبية في الحيوانات. وترد إجراءات أخذ العينات 160 الخلايا العصبية في جميع أنحاء قطاع المرئي للسندات ذات عائد مستهدف ¹¹ من أجل توليد عينة شاملة من dLGN-إسقاط الخلايا العصبية TRN. وصفت عملية إعادة بناء الخلايا العصبية الفردية باستخدام نظام إعادة الإعمار الخلايا العصبية بما في ذلك المجهر، وكاميرا، وبرنامج إعادة الإعمار. كما وصفت هي الطرق لتحديد مواقع الخلايا العصبية الفردية داخل بنية الدماغ (في هذه الحالة داخل TRN) والتحقق من فيروس حقن الاعتصامحجم البريد والمكان ضمن هيكل (في هذه الحالة داخل dLGN) باستخدام عمليات إعادة البناء كفاف الحجمي. الخطوات لتصدير البيانات المورفولوجية وتنفيذ مجموعة مستقلة التحليلات على أساس ترد المقاييس المورفولوجية قياس لكل الخلايا العصبية. هناك قيود على طرق التجميع وهناك أيضا مجموعة متنوعة من خوارزميات التجميع المختلفة المتاحة. وفقا لذلك، يتم وصف هذه الخيارات وفوائد بعض خوارزميات أكثر شيوعا. والتحليل العنقودي لا توفر التحقق الإحصائي للتفرد مجموعات. لذلك، تم تفصيلها خطوات إضافية للتحقق من تجميع الأمثل فضلا عن العلاقات بين البيانات الشكلية داخل وعبر مجموعات. يتم تجميع الأساليب الإحصائية لتقييم مجموعات لمجموعة البيانات ذات العائد المستهدف للتأكد من أن الخلايا العصبية TRN إلى ثلاث مجموعات فريدة من نوعها تقوم على موصوفة 10 المقاييس المورفولوجية مستقلة.

وبالتالي، من خلال تحديد الخطوات لوضع العلامات بشكل انتقائي، وإعادة بناء وتحليل البيانات المورفولوجية من السكان العصبية محددة، ونحن تصف أساليب لقياس الاختلافات الشكلية بين الخلايا العصبية داخل الكتلة السكانية. وأكدت نتائج مسبقة من أنواع الخلايا العصبية واضحة في القطاع البصري للTRN قرد المكاك مع أساليب تقييم إحصائية منفصلة. معا، ونحن نأمل أن تكون هذه التقنيات تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعات البيانات تشريحي عصبي وتساعد على إنشاء تصنيف الكمي للتنوع السكان العصبية من خلال الدماغ.

Protocol

ملاحظة: تم إعداد الأنسجة فحصه في هذه الدراسة كجزء من دراسة منفصلة ^5. لذلك، كل من الطرق التجريبية التي تنطوي على استخدام الحيوانات تم وصفها بالتفصيل في القسم طرق التجريبية من بريغز وآخرون. (2016). وقد وافق جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات التي أجريت كجزء من دراسة سابقة من قبل لجان رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية. ويصف الخطوات لحقن الفيروس في dLGN ومعالجة النسيجي للأنسجة المخ أدناه لفترة وجيزة في أقسام 1-2.

1. التجسيمي الحقن

1. أداء جميع العمليات الجراحية في بيئة معقمة باستخدام تقنيات العقيم. البخار تعقيم جميع الأدوات المعدنية الجراحية والشاش والمواد ثنى في الأوتوكلاف. تعقيم جميع المواد التي يمكن أن تتضرر من جراء البخار باستخدام التعقيم الكيميائي (مثل أكسيد الإثيلين).
2. حمل والحفاظ على التخدير وفقا لالحيواني وصمتطلبات rotocol محددة.
   1. للحقن الفيروس في القرود، لحث التخدير مع الكيتامين (10 ملغ / كلغ) والحفاظ على الحيوانات تحت التخدير الجراحي الكامل مع isoflurane (1-3٪ استنشاق الأوكسجين) الرصد انتهت CO _2، رسم القلب، معدل التنفس، ودرجة الحرارة التحقق بشكل مستمر ودوري لهجة الفك للتأكد من عمق التخدير المناسب.
3. وضع الحيوان في إطار التجسيمي لتحقيق الاستقرار في موقف رئيس وللسماح باستخدام الإحداثيات التجسيمي لتحديد هيكل حقن الفائدة (على سبيل المثال dLGN). إذا قياس ردود المرئية، قطرات مكان العين (قطرات الأتروبين 1٪ العين إذا كان المطلوب اتساع حدقة العين، وإلا قطرات العين المالحة) ثم العدسات اللاصقة في كلتا العينين لمنع جفاف. إن لم يكن قياس ردود المرئية، ووضع مرهم للعين في العينين.
4. جعل شق خط الوسط فروة الرأس وسحب الجلد والعضلات.
5. وفقا لالتجسيمي إحداثيات هيكل الفائدة (dLGN) في hemisph واحديحرث، وجعل حج القحف صغيرة.
6. خفض تدريجيا القطب تسجيل (على سبيل المثال التنغستن أو القطب البلاتين / الايريديوم (انظر الجدول مواد معينة / المعدات، الصف 3) فرضت على micromanipulator أن يتم وضع يدويا) خلال حج القحف في الدماغ. يمكن استخدام أقل مقاومة (<1 MΩ) وأكثر سمكا قليلا (~ 250 ميكرون قطر) أقطاب لاختراق الجافية، إذا رغبت في ذلك.
7. تسجيل موقف تتلاعب على سطح القشرية وعند نقطة حيث يتم قياس ردود المرئية. ردود المرئية والمسموعة، والاستجابات العصبية للضوء غير الساحلية الوقت تومض في عيني مع منظار العين أو LED صغير / مصباح يدوي.
8. تحديد موقع وسمك dLGN بالإشارة إلى المناصب تتلاعب في بداية ووسط ونهاية ردود المرئية وطرح موقف السطح القشري من هذه القيم. تسجيل أعماق لكل موقع الحقن تصميم داخل dLGN.
   ملاحظة: procedu مماثلةاحتياط يمكن استخدامها لتحديد الهياكل غير المرئية باستخدام المحفزات الحسية المناسبة. بالإضافة إلى ذلك، نظم جانب تسجيل / الحقن ويمكن أيضا أن تستخدم لاستهداف البنى الدماغية الصغيرة.
9. مرة واحدة لاحظت مواقع حقن المثلى، وإزالة القطب تسجيل ووضع ماصة حقن (ماصة الزجاج أو حقن حقنة) في نفس الموقف التجسيمي وانخفاض في عمق المناسب لكل الحقن، بدءا من أعمق موقع الحقن والشروع في ضحالة، انتظار 1 دقيقة على الأقل بعد حقن قبل تغيير موقف القطب. الماصات الزجاج مع القطر الخارجي لل~ 50 ميكرون قد يقلل من ارتجاع الفيروس مقارنة مع نصائح حقنة (~ 200 ميكرون قطر).
10. باستخدام نظام حقن (انظر الجدول مواد معينة / اجهزة ر، الصف 4)، picospritzer، أو ضخ حقنة، وضخ كميات صغيرة (1-5 ميكرولتر، الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة لإجراءات الحقن) من فيروس داء الكلب تعديل على (متعددة 3 - 10) أعماقبمعدل ~ 100 NL / دقيقة داخل بنية الهدف (dLGN). ملاحظة: يمكن أن يتم الاختراقات حقن منفصلة في هياكل الهدف الأكبر (مثل قرد dLGN). ضبط إجمالي حجم الحقن وفقا لحجم هيكل الهدف.
11. وقفة 5 دقائق على الأقل قبل التراجع ماصة الحقن. عند إزالة ماصة حقن، وملء حج القحف مع المواد الواقية (الغراء قطعة عظم في مكان، وتطبيق الشمع العظام أو جلفوم)، ثم خياطة العضلات والجلد معا مرة أخرى.
12. إدارة المسكنات (مثل كيتوبروفين) والمضادات الحيوية قبل نهاية الجراحة ومراقبة الحيوانات باستمرار حتى الحيوان المتنقلة.
13. لمدة 3 أيام على الأقل وتصل إلى 10 أيام بعد الجراحة، ومراقبة الحيوانات يوميا لضمان الغرز نظيفة وجافة، وسليمة ويظهر الحيوان أي علامات الألم أو عدم الراحة. إدارة المسكنات والمضادات الحيوية اليومية كما هو مطلوب. يبدأ السكن الاجتماعي من الحيوانات بعد الجراحة بعد تعافى الحيوان تماما من عملية جراحية.

2. الأنسجة الحصاد، باجتزاء، وتلطيخ

1. اسمحوا 7-14 أيام للنقل إلى الوراء من الفيروسات، ثم الموت ببطء الحيوان بواسطة جرعة زائدة من حل القتل الرحيم (على سبيل المثال Euthasol) ويروي الحيوان transcardially مع 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة، و 4٪ لامتصاص العرق، ثم 4٪ امتصاص العرق مع 10٪ سكروز.
2. إزالة الدماغ (انظر ¹² لخطوات مماثلة في نموذج القوارض) ووضعه في 20 - 30٪ سكروز مع بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات في الثلاجة لمدة 1-2 أيام.
3. عندما غرقت الدماغ إلى قاع الإناء، إزالته وقطع الأنسجة إلى كتل تحتوي على منطقة في الدماغ مع الخلايا العصبية المسماة retrogradely (مثل القشرة البصرية) وهيكل حقن الهدف (على سبيل المثال dLGN). قطع نفس كتل من الأنسجة من نصف الكرة غير المحقونة - هذه ستكون بمثابة أقسام السيطرة. للحصول على أفضل النتائج، وتبدأ إجراءات النسيجية فوراy على الأنسجة مقطوع حديثا.
4. قسم الأنسجة coronally في سمك 50 ميكرون في القسم باستخدام مشراح تجميد (انظر الجدول مواد معينة / المعدات، الصف 5).
5. وصمة عار جميع أقسام للنشاط السيتوكروم أوكسيديز (انظر الجدول مواد معينة / المعدات، الصفوف 5-8) لتصور الطبقات القشرية وتحت القشرية الهياكل ^13. ملاحظة: أقسام ويمكن تخزين بين عشية وضحاها في الثلاجة في شطف النهائي بعد صمة عار السيتوكروم أوكسيديز.
6. تسمية كل الأقسام مع الأجسام المضادة الأولية ضد GFP (1: 1000 تخفيف، ~ 12 ساعة الحضانة، وانظر جدول المواد الخاصة / معدات، الصف 9) تليها الضد الثانوية مطابقة المضيف الأساسي والموسومة مع البيوتين ⁵ (1: 500 التخفيف 2 - 4 ساعات الحضانة؛ انظر الجدول مواد معينة / المعدات، الصف 10). فمن المستحسن لاحتضان المقاطع في ليلة وضحاها الضد الثانوية.
7. أقسام التسمية مع مجمع أفيدين / البيوتين ثم تتفاعل مع DAB وبيروكسيد وصمة عار جميع الخلايا العصبية المسماة ⁵ بشكل دائم.
8. جبل أقسام على الشرائح الزجاجية subbed وترك بين عشية وضحاها الجافة.
9. أقسام يزيل الدهن باستخدام سلسلة من الكحول والزيلين يشطف ثم تغطي الانزلاق ^14.

3. إعادة الإعمار العصبية

ملاحظة: لقد تم بذل جميع عمليات إعادة البناء للتجارب الأصلية باستخدام نظام الخلايا العصبية إعادة الإعمار تتكون من المجهر (انظر الجدول مواد معينة / المعدات، الصف 14)، كاميرا مثبتة (انظر الجدول مواد معينة / المعدات، الصف 13)، وبرامج إعادة الإعمار الحزمة (انظر الجدول مواد معينة / المعدات، الصفوف 11-12). إعادة بناء الخلايا العصبية بمساعدة البرنامج يتيح تصور الشرائح الأنسجة مضافين مع الرسومات التي تعتمد على الكمبيوتر من العمليات العصبية. وجدير بالذكر أن برنامج التحويل الرقمي reconstruc الصرفيبيانات نشوئها في ثلاثة أبعاد، مما يتيح استخراج المعلومات الصرفية موقف معين. برنامج استخراج البيانات المرتبطة بها (انظر الجدول مواد معينة / المعدات، صف 12) تمكن من استخراج مجموعة غنية من البيانات الشكلية من كل الاعمار المحفوظة.

1. وضع شريحة في حامل الشرائح المجهر والتركيز على جزء واحد من الاهتمام باستخدام الهدف-تضخم منخفضة (على سبيل المثال 2X أو 10X). تأكد من أن صورة الكاميرا مرئيا في عرض برنامج عن طريق وضع مصراع الكاميرا بشكل صحيح.
2. اختيار الخلايا العصبية المسماة داخل بنية الدماغ من الفائدة (على سبيل المثال TRN) التي يتم عزلها بشكل معقول وذلك لإعادة بناء لا لبس فيه أكبر قدر من تشجر شجيري وقت ممكن. تفضيلي اختيار الخلايا العصبية إذا خلايا الجسم بشكل كامل في مقطع واحد من أجل الاستيلاء على أكبر قدر من كل خلايا الجسم ودقة تقدير مساحتها والاستدارة. استخدام الهدف المجهر 10X لتحديد الخلية بODY في قسم المنزل.
3. مرة واحدة يتم تحديد الملون جيدا، والخلايا العصبية معزولة جيدا، إضافة المقطع "الوطن" التي تحتوي على خلايا الجسم إلى مدير القسم عن طريق النقر على زر "قسم جديد". أدخل عدد من الأبواب لتشمل (التوصية 2-3 أقسام لبدء). تعيين سمك الباب 50 ميكرون عند المطالبة (انظر الخطوة 2.3).
4. تتبع ملامح من هياكل الدماغ ذات الصلة في قسم المنزل الذي يحتوي على خلايا الجسم. استخدام 2X الهدف / التكبير لتتبع كفاف.
   1. أولا، حدد "كونتور" من القائمة المنسدلة في شريط الأدوات العلوي ثم حدد نوع كفاف من القائمة المنسدلة (على سبيل المثال "LGN" أو "سندات ذات عائد مستهدف").
   2. تتبع الخطوط العريضة للهيكل الهدف (على سبيل المثال TRN) فضلا عن الهياكل المجاورة، إذا رغبت في ذلك، عن طريق النقر على نقطة على طول كفاف باستخدام الفأرة كأداة التعادل.
   3. حدد "كونتور انهيار" بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس واختيار هذا الخيارمن القائمة لاستكمال ووضع كل كفاف تتبعها.
5. ضع علامة في وسط الهيكل المستهدف من خلال النقر على رمز علامة المطلوب على شريط الأدوات الأيمن ثم النقر على الموقع المطلوب في إعادة إعمار لوضع علامة على هذا الموقع. استخدام نفس النوع من علامة للاحتفال وسط هيكل الهدف في جميع عمليات إعادة البناء.
6. وبمجرد أن ملامح كاملة، وتتبع الخطوط العريضة للجسم الخلية باستخدام 40 - 60X الأهداف / التكبير. للقيام بذلك، حدد أولا "العصبية" من القائمة المنسدلة في شريط الأدوات العلوي ثم حدد هيكل الخلايا العصبية لتتبع، في هذه الحالة "خلية الجسم". التالي تتبع خلايا الجسم كما هو الحال في 3.4.
7. ضع علامة نمط مختلف في وسط جسم الخلية، باتباع الخطوات الموضحة في 3.5.
8. تتبع كل التشعبات التي تبدأ في خلايا الجسم.
   1. أولا، حدد "التغصنات" من القائمة المنسدلة. ثم تتبع كل التغصنات بدءا من خلية بودذ واستخدام الماوس كأداة التعادل. تأكد من ضبط ض متعمقة في جميع أنحاء تتبع لالتقاط بدقة زاوية واتجاه التغصنات.
   2. وضع العقدة في كل نقطة تفرع على طول التغصنات بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس واختيار "Bifurcating عقدة" أو "Trifurcating عقدة" من القائمة المنسدلة. استخدام 40 - 60X الهدف / التكبير لجميع عمليات إعادة البناء تغصناته.
   3. في نهاية كل التغصنات، بزر الماوس الأيمن فوق الماوس واختر "إنهاء" من القائمة المنسدلة.
9. تحديد نهايات الجذعية التي من المرجح أن يستمر في القسم المجاور وتقديمهم إلى التركيز على المناسب ض متعمقة في صورة المجهر. وتشمل المعالم الرئيسية في مكان قريب مثل الأوعية الدموية أو بسهولة أنماط تغصناته معترف بها أو حزم في صورة المجهر.
   1. تقليل التكبير إلى 20X أو 10X على المجهر (اختيار التكبير التي تسمح أعظم التصور التاريخي)، واتخاذصورة من الصورة المجهر باستخدام كاميرا رقمية (مثل الهاتف الخليوي، قرص) باليد إلى شاشة الكمبيوتر.
10. الانتقال إلى القسم المجاور على الشريحة ويصطف معالم القسم تتبع سابقا مع حدود dLGN وTRN في الجزء الجديد.
11. العودة مجال الرؤية إلى المنطقة العامة للجسم الخلية (على أساس ملامح ومعالم رئيسية) وجعل التكبير ما يصل الى 10 - 20X.
12. استخدام الصورة من النهايات تغصناته من قسم تتبع سابقا للمساعدة في محاذاة النهايات مع بدايات التشعبات في الجزء الجديد.
    1. لتدوير تتبع ونقله إلى محاذاة التشعبات، استخدم أداة الأسهم لتحديد إعادة الإعمار، انقر بزر الماوس الأيمن واختر "نقل" من القائمة المنسدلة.
    2. بدلا من ذلك، استخدم "مباراة" أداة لتتناسب مع نهايات الجذعية إلى البدايات. حدد أداة المباراة من شريط الأدوات العلوي وعند المطالبة، انقر فوق إنهاءفي إعادة الإعمار ونقطة استمرار المناظرة في الصورة. كرر لمدة 3 أو أكثر النهايات.
13. مرة واحدة واصطف تعقب من المقطع السابق مع التشعبات في الجزء الجديد، تأكد من تحديد القسم الجديد المقابلة في قسم إدارة بالضغط على القسم الحالي. أو، إضافة قسم جديد لمدير الفرع، كما هو موضح أعلاه في 3.3، وتعديل ض متعمقة وموقف كل قسم جديد بالنسبة لقسم المنزل وفقا لذلك، ووضع كل قسم سماكة 50 ملم (انظر الخطوة 2.3).
14. زيادة التكبير إلى 40 - 60X وتتبع استمرارا تغصناته بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس على نهاية التغصنات من إعادة الإعمار واختيار "إضافة إلى إنهاء" من القائمة المنسدلة، ثم تتبع التغصنات باستخدام الماوس بوصفه رسم أداة. اتبع موجه لتحديد ما إذا استمرار في القسم الجديد.
15. اتبع التشعبات من خلال على الأقل 3 أقسام المجاورة (واحدة على كل جانب منقسم المنزل) بعد خطوات 3،8-3،15. إضافة إلى إعادة الإعمار حتى يتم تتبعها على الأقل 3 مجموع المقاطع لعصبون أو حتى التشعبات لم تعد قادرة على أن يتبع أو وجد. تتبع معالم في أقسام المجاورة اتباع الخطوات المذكورة أعلاه، إذا رغبت في ذلك.

4. تجميع المستقلة

ملاحظة: الكتلة المستقلة تحليلات تمكين التحليلات مشاركات من كبيرة، مجموعات البيانات متعددة الأبعاد التي قد تكون على خلاف ذلك من الصعب تصور، والأهم، تقديم تقييم كمي للتنوع الصرفي. منصة البرمجة القائمة على مصفوفة مفيدة جدا لتحليل مجموعات البيانات متعددة الأبعاد وتمكن التلاعب بيانات متطورة والتحليلات الإحصائية. وظائف مدرجة في الخطوات 4 - يتم تعريفها 6 في منصة البرمجة المدرجة في جدول المواد الخاصة / معدات، الصف 15.

1. استخراج البيانات المورفولوجية من كل الاعمار الخلايا العصبية الفردية باستخدام تحويلةبرنامج raction المرتبطة بنظام الخلايا العصبية إعادة الإعمار (انظر الجدول مواد معينة / المعدات، الصفوف 11-12).
   1. أولا، بإختيار البيانات الشكلية المطلوبة لكل الاعمار بما في ذلك: معلومات كفاف والمعلومات علامة والبيانات المورفولوجية للخلايا الجسم وتشجر شجيري، وما إلى ذلك.
   2. من القائمة المنسدلة تحرير في شريط الأدوات العلوي، اختر "تحديد كافة الكائنات". ثم حدد "تحليل هيكل متفرع" من القائمة المنسدلة تحليل في شريط الأدوات العلوي وانقر على كل علامة تبويب وتحديد الخيارات التحليل المطلوب في كل علامة تبويب.
   3. استخراج كافة البيانات المطلوبة عن طريق النقر على زر "موافق" في إطار تحليل وحفظ في تنسيق جدول بالنقر بزر الماوس الأيمن على النوافذ الانتاج واختيار "تصدير إلى Excel".
2. تجميع البيانات الرئيسية (انظر الجدول مواد معينة / المعدات، صف 16) فيه كل متغير الصرفي / ليويمثل TRIC من قبل المراقبة العددية واحدة في الخلايا العصبية. في هذا جدول ماستر، والحفاظ على سجل معرف صف لكل الخلايا العصبية.
3. تحقق من أن كافة المتغيرات المدرجة في التحليل العنقودي (على سبيل المثال المقاييس المورفولوجية) هي مستقلة عن بعضها البعض. على سبيل المثال، فإن عدد العقد ربط مع عدد من الفروع في تشجر شجيري أو محور عصبي. وفقا لذلك، واحد فقط من هذين المتغيرين ينبغي أن تدرج في التحليل العنقودي.
4. تأكد من كل قياس يحتوي على الملاحظة لكل متغير، أي كل عصبون (قياس)، يجب أن يكون نقطة البيانات (مراقبة) المقابلة لكل قياس الصرفي (متغير). إذا الملاحظات لمتغير معين (على سبيل المثال، طول محور عصبي) تفتقر لمجموعة فرعية من الخلايا العصبية، وهذا متغير (طول محور عصبي) لا يمكن إدراجها في التحليل العنقودي.
5. تنظيم البيانات على جدول ماستر في مصفوفة واحدة يعيش فيها كل صف يمثل الخلايا العصبية ومجموعة شرق افريقيايحتوي العمود ح البيانات العددية لكل قياس الصرفي (الشكل 1). على سبيل المثال، مجموعة بيانات بما في ذلك 100 الخلايا العصبية التي توجد ملاحظات لمدة 5 المتغيرات المستقلة ستكون ممثلة مصفوفة 100 × 5 (صف على حدة العمود). وليس من الضروري أن تتضمن أي تحديد لكل الخلايا العصبية داخل المصفوفة - فإن مؤشر التوالي بمثابة معرف فريد لكل العصبون. وينبغي أيضا أن يكون هناك أي ثغرات أو الصورة "نان" في المصفوفة. حفظ المصفوفة كما متغير واحد (على سبيل المثال بيانات = [100 × 5 مصفوفة]، وانظر الرمز التكميلي ملف لنموذج التعليمات البرمجية).
6. اختيار خوارزمية لحساب المسافات بين النقاط التي تمثل الخلايا العصبية الفردية في مساحة ن الأبعاد حيث يتم تعريف ن من قبل عدد من المتغيرات. وظيفة "pdist" تتيح المرونة في حساب المسافات بين الخلايا العصبية. حساب المسافة الافتراضية هي المسافة الإقليدية، واستخدمت في السابق لتحليلات مماثلة من morphologica العصبيةبيانات ل ^{5 و 6.}
7. مع بين الخلايا العصبية مسافات إخراج وظيفة "pdist"، استخدم وظيفة "الربط" لتشكيل مجموعات. مرة أخرى، تتوفر خيارات التجميع متعددة. طريقة وارد وبعد النقطه الوسطى قد أسفرت عن نتائج مماثلة في تحليل مجموعات البيانات المورفولوجية ^{5، 6.}
8. إذا رغبت في ذلك، استخدام وظيفة "kmeans" كنهج تجميع بديلة إلى "pdist" وظائف "الربط". "kmeans" توظف تربيع المسافة الإقليدية لحساب المسافات بين الخلايا العصبية ثم بعد النقطه الوسطى لتعيين مجموعات.
9. لتصور شجرة مجموعة الهرمية، واستخدام وظيفة "dendrogram" على إخراج عملية "الربط". هذه وظيفة لديها الإعداد الافتراضي الذي يحد من التصور إلى 30 القياسات، ولكن يمكن التغلب عليه من تحديد عدد من القياسات (<م> مثل الخلايا العصبية) المعروضة. يوضح dendrogram المسافات الربط على المحور الصادي لكل من الخلايا العصبية، التي حددها مؤشر خلافهما على محور س.
   ملاحظة: مخرجات "الربط" و "dendrogram" لا يحدد العدد الأمثل للمجموعات. إخراج "kmeans" لا تعيين القياسات إلى مجموعات، لكنه لا اختبار ما إذا كانت هذه المجموعات هي الأمثل. المقارنات الإحصائية منفصلة والتحقق من تجميع الأمثل يمكن أن يؤديها (انظر أدناه).

5. التأكيد من تجميع

ملاحظة: كما هو مذكور أعلاه، فإن التحليل العنقودي نفسها لا تقدم مباشرة تتضمن تقديرات إحصائية عما إذا كانت مجموعات موضح في dendrogram العنقودية هي فريدة من نوعها وذات صفة تمثيلية من العينة. وقد تم اقتراح طرق للتحقق من مجموعات من dendrogram ^15، ولكن هذه لا توفر التحقق الإحصائي لتجميع الأمثل. هناك متعددةوسائل التنوير القائل للتحقق من تجميع الأمثل.

1. الأسلوب 1: تقييم المجموعات:
   1. استخدام وظيفة "evalclusters" تحديد الطريقة المستخدمة لحساب مجموعات، مثل "kmeans" أو "الربط". ويمكن أيضا إنتاج نموذج خليط جاوس يتم تقييم (انظر الخطوة 5.2 أدناه، وانظر الرمز التكميلي ملف لنموذج التعليمات البرمجية).
   2. تحديد معيار تقييم عدد من الخيارات (على سبيل المثال 'CalinskiHarabasz "- عن أوصاف الخيارات المعيار، الرجوع إلى القائمة تعليمات، البحث عن" evalclusters ").
   3. تحديد نطاق من أرقام الكتلة الأمثل لاختبار (على سبيل المثال [1: 6] لاختبار ما إذا كان 1، 2، 3، 4، 5، أو 6 مجموعات هي الأمثل).
      ملاحظة: إخراج "evalclusters" هو العدد الأمثل من مجموعات نظرا لخوارزمية التجميع ومعيار محدد.
2. الطريقة 2: جاوس نموذج خليط التكتل:
   ملاحظة: خليط جاوس نموذج تجميع algorithms (GMMs) تفترض أن الملاحظات لكل متغير تأتي من خليط من توزيعات جاوس تحديد كل مجموعة المفترضة، كل بمتوسط ​​الخاصة بهم والتغاير. ثم يستخدم GMM لتعظيم الخوارزمية توقع تعيين الاحتمالات الخلفي لكل قياس، مما يدل على احتمال بالانتماء إلى مجموعة محددة ^16.
   1. تنفيذ GMM باستخدام وظيفة "fitgmdist" عن طريق إدخال رقم المفترض الكتل الملحوظة في البيانات. بدلا من ذلك، لتجنب احالة مسبق من عدد الكتل، استخدم تحليل المكونات الرئيسية (PCA) مع سلسلة من الأرقام العنقودية المثلى مختلفة باستخدام الخطوات الموضحة هنا (انظر الرمز التكميلي ملف لنموذج التعليمات البرمجية).
   2. استخدام وظيفة "PCA" على مصفوفة البيانات الأصلية وحفظ عشرات المكون الرئيسي كمخرج.
   3. في حلقة ابتداء من الساعة 1 ويمر بعض عدد من مجموعات المثلى المفترضة، استخدام اله وظيفة "fitgmdist" على عشرات المكون الرئيسي وتوليد GMMs لكل عدد من المجموعات المثلى المفترضة.
   4. تقييم كل GMM عن طريق فحص احتمال سلبي السجل، معيار المعلومات Akaike، ومعيار المعلومات بايز. على خرائط Google للجوال مع أدنى المعايير هو الأمثل.
   5. إذا رغبت في ذلك، واختبار ما إذا كانت القيم المتوسطة لكل مجموعة تختلف اختلافا كبيرا عندما يكون عدد من العناقيد هو الأمثل (يتم تخزين الوسائل من كل مجموعة في إخراج "مو" من كل GMM).

6. التحليلات الإحصائية للبيانات مجمعة

1. مرة واحدة يتم تحديد العدد الأمثل للمجموعات باستخدام المجموعات الهرمية وتقييمها، والعودة إلى البيانات الأصلية، الخلايا العصبية منفصلة في مجموعات، وتحديد تساهم المقاييس المورفولوجية لتجميع الخلايا العصبية إلى طبقات فريدة من نوعها.
2. فرز البيانات متري المورفولوجية الأصلية مثل أن الخلايا العصبية يتم تجميعها وفقا لتكليف الكتلة.
3. لدراسة العلاقات بين البيانات الصرفية عبر الخلايا العصبية (لجميع الخلايا العصبية أو العصبونات فصل في مجموعات)، نفذ الانحدار الخطي يناسب ل2- و 3 في اتجاه ومقارنات من الملاحظات متري المورفولوجية. ويمكن تقدير هذه النوبات باستخدام وظيفة "صالح" وتقييمها باستخدام وظيفة "fitlm" الذي الخير من مخرجات تناسب تشمل R ² و ص القيم لنوبات الانحدار.
4. لفحص العلاقات الإحصائية بين الخلايا العصبية في كل مجموعة، استخدام غير حدودي عينة اثنين (اختبار Wilcoxon رتبة محصلتها) أو متعددة عينة مقارنات اختبارات (أنوفا)، اعتمادا على عدد من المجموعات. الأهم من ذلك، استخدام متعددة عينة ANOVAs يضمن أن يتم تصحيح القيم ص للمقارنات متعددة.

النتائج

لقد أظهرنا سابقا أن إعادة البناء على نطاق واسع من الخلايا العصبية داخل الكتلة السكانية الانتقائي هي حقن يلي ممكن من فيروس داء الكلب المعدلة في dLGN ^5. مؤخرا، تم استخدام نفس النسيج لإعادة بناء 160 خلية عصبية في قطاع المرئي للTRN (براج وآخرون، في ...

Discussion

ظلت الدراسات تشريحي عصبي أحد أعمدة علم الأعصاب والفائدة الأخيرة في connectomics والعلاقات هيكل الوظائف وجدد الحماس لالتوصيف المورفولوجي مفصل من السكان العصبية انتقائية. تقليديا، وقد اعتمدت الدراسات تشريحي عصبي في التصنيفات النوعية من الخلايا العصبية إلى طبقات متميزة ش?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SADΔG-EGFP	E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute		Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten	FHC	UEPSGGSE1N2M	Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II	Drummod Scientific	3-000-204, 110V	Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome	Thermo Scientific
DAB	Sigma Aldrich	D5905-50TAB	3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C	Sigma Aldrich	C2037-100MG
Catalase	Sigma-Aldich	C9322-5G
Rabbit anti-GFP	Life Technologies/Thermo Fisher	#A-11122	Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit	Vector Laboratories	#BA-1000	Secondary antibody
Neurolucida System	MicroBrightField		Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer	MicroBrightField		Data export software
Microfire Camera	Optronics		2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope	Nikon Instruments Inc.		Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab	The MathWorks Inc.		Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel	Microsoft		Spreadsheet program