שחזור בקנה מידה גדול ועצמאי, Clustering משוחדת בהתבסס על מדדי מורפולוגי לסווג נוירונים באוכלוסיות סלקטיבי

Summary

פרוטוקול זה מתאר שחזורים בקנה מידה גדולה של אוכלוסיות נוירונים סלקטיבית, שכותרתו בעקבות זיהום מדרדר עם וירוס כלבת מהונדס להביע סמני ניאון, ואשכול עצמאי, ללא דעות מוקדמות מנתח המאפשר אפיון מקיף של מדדים מורפולוגיים בין subclasses העצבית ברורה.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שחזורים בקנה מידה גדולה של נוירונים בשילוב עם השימוש של אשכולות עצמאיים ואובייקטיביים מנתח ליצור סקר מקיף של מאפייני מורפולוגיים נצפו בקרב אוכלוסייה עצבית סלקטיבית. שילוב של טכניקות אלה מהווה גישה חדשנית לאיסוף וניתוח של נתונים neuroanatomical. יחד, טכניקות אלו מאפשרות בקנה מידה גדולה, ולכן יותר מקיפה, דגימה של אוכלוסיות נוירונים סלקטיבית ולהקים שיטות כמותיות משוחדות לתיאור כיתות עצביות ייחודיות מורפולוגית בתוך אוכלוסייה.

הפרוטוקול מתאר את השימוש וירוס הכלבת מהונדסים לתייג נוירונים באופן סלקטיבי. G-deleted מעשי וירוס כלבת כמו נותב מדרדר לאחר הזרקת stereotaxic לתוך מבנה מוח היעד של ריבית משמש ככלי עבור המשלוח והביטוי של EGFP בנוירונים. מספר רב של נוירונים נגועים באמצעות זהטכניקה ולהביע GFP לאורך הדנדריטים שלהם, בהפקת "Golgi דמוי" ממלא מלאה של נוירונים בודדים. לפיכך, שיטת העקיבה מדרדרת הווירוס בתיווך משפרת עם טכניקות איתור מדרדר מבוסס צבען מסורתי על ידי ייצור ממלא תאיים מלא.

נוירונים בודדים מבודדים היטב פורשים בכל האזורים לאזור המוח נחקר נבחרים לשיקום על מנת לקבל מדגם מייצג של נוירונים. הפרוטוקול מתאר נהלים לשחזר גופי תא ולהשלים דפוסי arborization הדנדריטים של נוירונים שכותרתו פורשים סעיפי רקמות מרובים. נתונים מורפולוגי, כולל משרות של כל נוירון בתוך מבנה המוח, המחולצים לניתוח נוסף. פונקציות תכנות תקן נוצלו כדי לבצע אשכול עצמאי ניתוחים והערכות אשכול המבוססות על מדדים מורפולוגיים. כדי לאמת את השירות של ניתוחים אלו, הערכות סטטיסטיות של perfo ניתוח אשכולותrmed על 160 נוירונים משוחזרים בגרעין רשתי התלמוס של התלמוס (הטורנירים) של קוף מקוק נעשה. הן ניתוח האשכול המקורי ואת ההערכות הסטטיסטיות בצעו כאן עולים כי נוירונים הטורנירים מופרדים לשלוש תת-אוכלוסיות, כל אחד עם מאפייני מורפולוגיים ייחודיים.

Introduction

הנוירואנטומיה הוא אחד היסודות של מדעי המוח ¹ וריבית האחרונה "connectomics" חדש התלהבות להבנת המגוון מורפולוגיים של אוכלוסיות נוירונים ואת הקשרים בין הנוירונים ספציפיים ^2. שיטות תיוג ונוירונים בשחזור השתפרו מאוד עם החידושים האחרונים, כולל מעקב במעגל גנטיים וירוס בתיווך גישות ^{3, 4,} מה שמאפשר סקרים מורפולוגיים מקיפה יותר של אוכלוסיות נוירונים ^5. בנוסף לשיפורי תיוג נוירונים בודדים, טכניקות ניתוח נתונים כמותיים גם התבררו כי יש לאפשר סיווג עצמאי ובלתי משוחד של נוירונים לתוך תת-אוכלוסיות נבדלות זה מזה המבוססים על נתונים מורפולוגיים ^{5, 6.} טכניקות בלתי משוחדות אלה מהוות שיפור על יותר traditional שיטות סיווג איכותיים להיות הסטנדרט בתחום במשך יותר ממאה שנה. מטרת מחקר זה היא לתאר, צעד אחר צעד, את השילוב של תיוג בתיווך וירוס של נוירונים בתוך אוכלוסייה סלקטיבית, שחזורים בקנה מידה גדולה של מדגם מקיף של הנוירונים האלה, וניתוח נתונים כמותיים על בסיס אשכולות עצמאיים עם הערכות סטטיסטיות. על ידי שילוב של שיטות אלה, אנו המתאר גישה חדשנית כלפי לאיסוף והניתוח של נתוני neuroanatomical כדי להקל דגימה מקיפה וסיווג משוחד של סוגי נוירונים ייחודיים מורפולוגית בתוך אוכלוסייה עצבית סלקטיבית.

כדוגמא אחת מהשיטות הללו, אנו מתארים את הניתוח שלנו של אוכלוסייה גדולה של נוירונים בתוך מגזר אחד של גרעין רשתי התלמוס (הטורנירים) של קוף מקוק. נתונים אלו הם ממחקר לפני ^7. שיטות תיוג סלקטיבי נוירונים טורנירים מקרינים על גב lateraגרעין l ברך של התלמוס (dLGN) באמצעות הזרקה כירורגית של וירוס כלבת שונה קידוד ^{4 EGFP, 8} (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי, שורה 2) מפורטים. נגיף הכלבת שונה זה חסר את הגן המקודד חלבון מעיל חיוני, ביטול התנועה טרנס-סינפטיים של הנגיף. לאחר הנגיף נכנס מסוף האקסון באזור הזריקה, הוא מתנהג כמו נותב מסורתי מדרדר עם היתרון החשוב של נהיגת ביטוי EGFP ברחבי arborization הדנדריטים המלא של נוירונים נגועים ^{5, 9, 10.} בהתאם לכך, נגיף כלבת G-deleted זה יכול להיות מנוצל כדי להדביק באופן סלקטיבי לתייג כל אוכלוסייה עצבית לאחר הזרקה ותחבורה מדרדרת.

על מנת לבצע ניתוח מקיף של אוכלוסייה עצבית ספציפית, חשוב לדגוםבעל פיזור גדול של נוירונים בתוך האוכלוסייה. בגלל הטכניקה תיוג בתיווך וירוס מייצרת תאיים שלם, "Golgi דמוי" ממלא של נוירונים רבים עם אקסונים באזור הזריקה וירוס, אפשר לשחזר מדגם גדול מאוד של נוירונים בתוך מלוא היקף מבנה המוח. בנוסף, מאחר וירוס הכלבת השונה כל כך יעיל מדביק ולמתג מספר גדול של נוירונים, אפשר לשחזר מאה נוירונים לכל בעלי חיים. נהלי דגימת 160 נוירונים בכל המגזר החזותי של הטורנירים ¹¹ על מנת לייצר מדגם מקיף של נוירונים טורנירי dLGN-מקרין מתוארים. התהליך של שחזור נוירונים בודדים באמצעות מערכת שיקום נוירון כולל מיקרוסקופ, מצלמה, ותוכנות שחזור מתואר. כמו כן תאר שיטות כדי לקבוע עמדות של נוירונים בודדים בתוך מבנה מוח (במקרה זה בתוך הטורנירים) וכדי לאמת לשבת הזרקת וירוסנפח דואר ומיקום בתוך מבנה (במקרה זה בתוך dLGN) באמצעות שחזורים מתאר נפח. צעדים לייצא נתונים מורפולוגיים ולבצע אשכול עצמאית וניתוחים המבוססים על מדדים מורפולוגיים נמדד עבור כל נוירון מתוארים. ישנן מגבלות על שיטות אשכולות ויש גם מגוון של אלגוריתמים באשכולות שונים זמין. בהתאם לכך, אפשרויות אלה ואת היתרונות של חלק האלגוריתמים יותר נפוצים מתוארות. מניתוח האשכולות אינו מספק אימות סטטיסטית הייחודיות של אשכולות. לכן, צעדים נוספים מתוארים לאמת אשכולות אופטימליים כמו גם את היחסים בין נתונים מורפולוגיים בתוך ועל פני אשכולות. שיטות סטטיסטיות להערכת אשכולות של בסיס נתוני הטורנירים כדי לאשר נוירונים טורנירים מקובצים שלושה אשכולות ייחודיים המבוססים על 10 מדדי מורפולוגיים עצמאיים מתוארות.

לכן, על ידי בהתוויית צעדי תיוג סלקטיביבתהליך שיקום, וניתוח נתונים מורפולוגיים מאוכלוסייה עצבית ספציפית, אנו מתארים שיטות לכימות הבדלים מורפולוגיים בין הנוירונים בתוך אוכלוסייה. ממצאים קודמים של סוגי נוירונים ברורים בתוך המגזר החזותי של טורנירי קוף מקוק הם אשרו עם שיטות הערכה סטטיסטיות נפרדות. ביחד, אנו מקווים הטכניקות הללו תהיינה חל רחב למערכות נתוני neuroanatomical ולעזור להקים סיווג כמותי של מגוון אוכלוסיות נוירונים דרך המוח.

Protocol

הערה: הרקמה שנבדקה במחקר זה הוכנה כחלק במחקר נפרד ^5. לכן, כל שיטות ניסיוניות בתחום השימוש חיות תוארו בפירוט בסעיף שיטות ניסיוניות ואח בריגס. (2016). כל הנהלים הקשורים בבעלי חיים שנערכו כחלק של המחקר קודם אושרו על ידי ועדות הטיפול בבעלי החיים המוסדיות השתמש. השלבים להזרקה של הנגיף לתוך dLGN ועיבוד היסטולוגית של רקמת המוח יתוארו להלן בקצרה בסעיפים 1 - 2.

1. הזרקת Stereotaxic

1. לבצע את כל פעולות כירורגיות בסביבה סטרילית שימוש בטכניקות aseptic. Steam-לעקר את כל מכשירי ניתוח מתכת, גזת וילון המהותי חיטוי. לעקר את כל החומרים שיכולים להינזק על ידי קיטור באמצעות עיקור כימי (אתילן אוקסיד למשל).
2. להשרות ולשמור הרדמה על פי בעלי החיים ו- pדרישות rotocol ספציפי.
   1. עבור זריקה וירוס בקופים, להשרות הרדמה עם קטמין (10 מ"ג / ק"ג) ולתחזק חיות תחת הרדמה כירורגית מלא עם isoflurane (1 - 3% בשאיפה חמצן) ניטור פג CO _2, EKG, קצב הנשימה, טמפרטורת ברציפות ומדי פעם בודק לצליל הלסת כדי להבטיח עומק ההרדמה נכונה.
3. מניחים חיה בתוך מסגרת stereotaxic לייצב מיקום הראש וכדי לאפשר שימוש קואורדינטות stereotaxic לאתר את מבנה הזרקת עניין (למשל dLGN). אם מדידת תגובות חזותיות, עין במקום טיפות (עין אטרופין 1% טיפות אם הרחבת אישון היא רצויה, אחרת עין מלוחה טיפות) ולאחר מכן עדשות מגע בשתי העיניים כדי למנוע יובש. אם לא מדידת תגובות חזותיות, למקם משחת עיניים בעיניים.
4. לעשות חתך בקרקפת קו האמצע ו לחזור העור והשרירים.
5. לדברי stereotaxic קואורדינטות עבור המבנה של עניין (dLGN) באחד hemisphere, לבצע craniotomy קטן.
6. בהדרגה להפחית אלקטרודה הקלטה (למשל טונגסטן או פלטינה / אלקטרודה אירידיום (ראו טבלה של חומרים ספציפיים / ציוד, שורה 3) הידק על micromanipulator כי היא ממוצבת באופן ידני) באמצעות פתיחת הגולגולת למוח. עכבה נמוכה (<1 MΩ) ומעט עבה (~ 250 מיקרומטר קוטר) אלקטרודות עשויים להיות מנוצל כדי לחדור הדורה, אם ירצו בכך.
7. להקליט את המיקום מניפולטור על פני השטח של קליפת המוח ואת בנקודה שבה תגובות חזותיות נמדדות. תגובות חזותיות נשמעות, הזמן נעול תגובות עצביות אור הבזיק בעיני עם אופתלמוסקופ או LED / פנס קטן.
8. קבע את המיקום ועובי dLGN בציינו עמדות מניפולטור בהתחלה, האמצע והסוף של תגובות חזותיות הפחתת סך שטח קליפת מוח מערכים אלו. רשום את המעמקים עבור כל אתר הזרקה מעוצב בתוך dLGN.
   הערה: procedu דומהמיל יכול לשמש לאיתור מבנים שאינם ויזואלי באמצעות גירויים חושיים מתאימים. בנוסף, מערכות הקלטה / הזרקת מצמידים יכולות לשמש גם כדי למקד מבנים מוחיים קטנים.
9. לאחר מיקומי זריקה אופטימליים מצוינים, להסיר את האלקטרודה ההקלטה ולמקם פיפטה הזרקה (פיפטה זכוכית או מזרק הזרקה) באותו המיקום stereotaxic והתחתון לעומק המתאים לכל זריקה, החל הזריקה העמוקה שימשיך הרדוד, חכה דקות לפחות 1 לאחר ההזרקה לפני השינוי בעמדת אלקטרודה. טפטפות זכוכית עם קוטר חיצוני של ~ 50 מיקרומטר עשויות להפחית backflow של וירוס לעומת טיפי מזרק (~ 200 מיקרומטר קוטר).
10. באמצעות מערכת הזרקה (ראה טבלה של חומרים ספציפיים / Equipmen t, שורה 4), Picospritzer, או משאבת מזרק, להזריק כמויות קטנות (1 - 5 μL; עיין בהוראות יצרן עבור הליכי הזרקה) של נגיף כלבת שונה על מספר (3 - 10) לעומקיםבשיעור של ~ 100 NL / min בתוך מבנה היעד (dLGN). הערה: חדירות הזרקה נפרדות יכולות להתבצע במבני יעד גדולים יותר (למשל קוף dLGN). התאם נפח הזרקה הכולל בהתאם לגודל מבנה היעד.
11. השהה לפחות 5 דקות לפני retracting פיפטה ההזרקה. כאשר פיפטה הזרקת מוסר, למלא את craniotomy עם חומר מגן (חתיכת עצם דבק במקום, להחיל עצם שעווה או gelfoam), ואז תפר את השריר והעור שוב ביחד.
12. נהל משככי כאבים (למשל ketoprofen) ואנטיביוטיקה לפני סוף הניתוח ולפקח חיה ברציפות עד שהחיה היא אמבולטורי.
13. לפחות 3 ימים ועד 10 ימים לאחר ניתוח, לעקוב אחר בעלי חיים מדי יום כדי להבטיח תפרים הם נקיים ויבשים, שלמים ובעלי החיים לא מראים סימנים של כאב או אי נוחות. נהל משככי כאבים ואנטיביוטיקה יומיים כנדרש. בגין דיור ציבורי של בעלי חיים לאחר ניתוח לאחר חיה התאוששה לחלוטין מהניתוח.

2. קציר רקמות, חתך, מכתים

1. אפשר 7 - 14 ימים עבור תחבורה מדרדר של וירוס, אז להרדימו על ידי מינון יתר של פתרון המתת חסד (למשל Euthasol) ו perfuse החיה transcardially עם 0.1 מלוחים M פוספט שנאגרו, 4% paraformaldehyde, אז paraformaldehyde 4% עם 10% סוכרוז.
2. הסר את המוח (ראה ¹² לצעדים מקבילים במודל מכרסם) ומניח 20 - סוכרוז 30% עם paraformaldehyde 4% במאגר M 0.1 פוספט ומעבירים למקרר 1 - 2 ימים.
3. כאשר המוח שקע לתחתית המיכל, הסר אותה לחתוך את הרקמה לגושים המכיל את האזור במוח עם נוירונים שכותרתו retrogradely (קליפת הראייה למשל) ואת מבנה היעד ההזרקה (למשל dLGN). חותך אותו גושי רקמה מחץ הכדור הלא מוזרק - אלה ישמשו סעיפים שליטים. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להתחיל immediatel נהלים היסטולוגיתy על רקמת מחולק טרי.
4. רקמות סעיף coronally בעובי של 50 מיקרומטר לכל סעיף באמצעות microtome הקפאה (ראו טבלה של חומרים / ציוד ספציפי, שורה 5).
5. הכתם כל החלקים לפעילות מונואמין ציטוכרום (ראו טבלה של ספציפיות חומרים / ציוד, שורות 5 - 8) כדי לחזות שכבות בקליפת המוח ומבנים קורטיקליים ^13. הערה: סעיפים ניתן לאחסן לילה במקרר ב השטיפה הסופית בעקבות כתם מונואמין ציטוכרום.
6. לייבל כל החלקים עם נוגדן ראשוני נגד GFP (1: 1,000 דילול, ~ 12 הדגירה h; ראו טבלה של חומרים ספציפיים / ציוד, שורה 9) ואחריו נוגדנים משני התאמת המארח העיקרי ו מתויג עם ביוטין ⁵ (1: 500 דילול , 2 - הדגירה ג 4; ראו טבלה של חומרים / ציוד ספציפי, שורה 10). מומלץ דגירת סעיפי לילה הנוגדנים משני.
7. סעיפים תווית עם תסביך avidin / ביוטין אז להגיב עם DAB ואת מי להכתים כל הנוירונים שכותרתו לצמיתות ^5.
8. הר בסעיפים בשקופיות זכוכית לספסל ולתת לילה יבש.
9. סעיפים Defat באמצעות סדרה של אלכוהול קסילן שטיפות לכסות ואז להחליק ^14.

3. שחזור עצבי

הערה: כל השחזורים עבור ניסויים מקוריים נעשו באמצעות מערכת שיקום נוירון המורכב מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי, שורת 14), מצלמה מצורפת (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי, שורת 13), ותוכנות שחזור חבילה (ראה טבלה של חומרים ספציפיים / ציוד, שורות 11 - 12). תוכנה סייעה לשיקום עצבי מאפשר הדמיה של שקופיות רקמות ועליהן ציורים מבוססי מחשב של תהליכים עצביים. חשוב לציין כי התוכנה ודיגיטציה reconstruc מורפולוגייםנתוני tion בשלושה ממדים, חילוץ המאפשר מידע מורפולוגי ספציפי לתפקיד. תכנית חילוץ הנתונים המשויכת (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי, שורת 12) מאפשרת מיצוי של מערך עשיר של נתונים מורפולוגיים מכל שחזור הציל.

1. מקום שקופית בתוך החזיק שקופיות מיקרוסקופ ולהתמקד קטע בודד של עניין באמצעות המטרה נמוכה גדלה (למשל 2X או 10X). ודא שתמונת המצלמה גלויה בתצוגת התוכנה על ידי מיצוב תריס המצלמה כראוי.
2. בחר נוירונים שכותרתו בתוך מבנה המוח של עניין (טורנירים למשל) כי הם מבודדים באופן סביר כדי לשחזר באופן חד משמעי כמה שיותר arborization הדנדריטים ככל האפשר. מעדיף לבחור נוירונים אם גוף התא הוא מלא בתוך קטע בודד כדי ללכוד את ההיקף הגדול ביותר של כל גוף תא ומדויק להעריך אזור העגלגלות שלה. השתמש מטרת מיקרוסקופ 10X לזהות ב תאody בסעיף הביתה.
3. פעם, מוכתם היטב מבודד היטב נוירון מזוהה, להוסיף את הסעיף "הביתה" המכיל את גוף התא אל מנהל המדור ידי לחיצה על הכפתור "סעיף חדש". הזן את מספר סעיפים לכלול (ממליץ 2 - 3 חלקים להתחיל). להקצות עובי סעיף של 50 מיקרומטר כאשר תתבקש לעשות זאת (ראה שלב 2.3).
4. עקוב אחר קווי המתאר של מבנים מוחיים רלוונטיים בקטע הביתה המכיל את גוף התא. השתמש מטרת 2X / הגדלה עבור מעקב קונטור.
   1. ראשית, בחר "קונטור" מהתפריט הנפתח בסרגל הכלים העליון ולאחר מכן לבחור את סוג קונטור מהתפריט הנפתח (למשל "LGN" או "טורנירים").
   2. עקוב אחר קווי מתאר של מבנה היעד (למשל הטורנירים) וכן מבנים סמוכים, אם תרצה בכך, על ידי לחיצה על נקודות לאורך קווי המתאר באמצעות העכבר ככלי תיקו.
   3. בחר "קונטור סגור" על ידי לחיצה ימנית על העכבר ובחירה באפשרות זומהתפריט כדי להשלים ויצורף לה כל קווי מתאר לייחס.
5. מניחים סמן במרכז מבנה היעד על ידי לחיצה על סמל סמן הרצוי בסרגל הכלים הימני ולאחר מכן לחיצה על המיקום הרצוי בשחזור להציב את הסמן במיקום זה. השתמש באותו סוג של סמן לציון מרכז מבנה היעד בכל שחזורים.
6. לאחר קווי המתאר הושלמו, להתחקות אחר קווי המתאר של גוף התא באמצעות 40 - 60X מטרות / גדלה. כדי לעשות זאת, בחר תחילה "Neuron" מהתפריט הנפתח בסרגל הכלים העליון ולאחר מכן לבחור את מבנה הנוירון להתחקות, במקרה זה "גוף התא". בואו לאתר את גוף התא כמו 3.4.
7. מניחים סמן סגנון שונה במרכז גוף התא, ביצוע השלבים המתוארים 3.5.
8. עקוב אחר כל דנדריטים החל גוף התא.
   1. ראשית, בחר "דנדריט" מהתפריט הנפתח. ואז לעקוב אחר כל דנדריט החל מ דירקטוריון התאy ושימוש בעכבר ככלי תיקו. הקפד להתאים את Z- עומק ברחבי העקיבה כדי ללכוד את זווית מדויקת והכיוון של דנדריט.
   2. מניחים הצומת בכל נקודת הסתעפות לאורך דנדריט ידי לחיצה ימנית על העכבר ובחירה באפשרות 'מתפצל צומת "או" Trifurcating הצומת "מהתפריט הנפתח. השתמש 40 - 60X אובייקטיבי / גדלה לכל שחזורים דנדריט.
   3. בסוף כל דנדריט, לחץ לחיצה ימנית על העכבר ובחר "סיום" מהתפריט הנפתח.
9. זיהוי קצוות הדנדריטים כי צפויים להימשך לתוך הקטע הסמוך ולהביא אל מוקד אלה על Z- העומק המתאים תמונת מיקרוסקופ. כלול ציוני דרך מרכזית הסמוכים כגון כלי דם או דפוסים דנדריט קל לזיהוי או צרור בתמונת מיקרוסקופ.
   1. מנמיכים הגדלה 20X או 10X על המיקרוסקופ (לבחור את ההגדלה המאפשר ויזואליזציה ציון הגדול), ולקחתתמונה של תמונת מיקרוסקופ באמצעות מצלמה דיגיטלית (טלפון סלולארי למשל, מחשב לוח) מוחזק ביד למסך המחשב.
10. לעבור לקטע הסמוך בשקופית ולכייל את קווי המתאר של הסעיף לייחס בעבר עם גבולות dLGN ו הטורנירים בקטע החדש.
11. החזר את שדה הראייה לאזור הכללי של גוף התא (מבוסס על קווי מתאר ציונים דרך מרכזית) ולהביא את ההגדלה בחזרה עד 10 - 20X.
12. השתמש צילום של הסופים דנדריט מהמדור לייחס בעבר כדי לסייע יישור הסופים עם ראשיתה של דנדריטים בקטע החדש.
    1. כדי לסובב את העקיבה והעבר אותו ליישר דנדריטים, השתמש בכלי החץ כדי לבחור את השחזור, לחץ לחיצה ימנית ובחר "Move" מהתפריט הנפתח.
    2. לחלופין, השתמש באפשרות "התאמה" כדי להתאים סופים הדנדריטים להתחלות. בחרו בכלי התאמה מסרגל הכלים העליון וכאשר תתבקש לעשות זאת, לחץ על סיוםבשחזור ונקודת המשך המקבילה בתמונה. חזור על הפעולה עבור 3 או יותר סופים.
13. לאחר האיתור בסעיף הקודם הוא יישר קו עם דנדריטים בקטע החדש, לוודא הקטע החדש המתאים נבחר במנהל הקטע על ידי לחיצה על הקטע הנוכחי. לחלופין, להוסיף קטע חדש למנהל סעיף, כמתואר לעיל 3.3, התאמת Z- עומק והמיקום של כל יחסי קטע חדש כדי להרחיב את מדור הבית בהתאם וקביעת כל עובי סעיף 50 מ"מ (ראה שלב 2.3).
14. הגדל את ההגדלה ל -40 - 60X ולאתר את המשכים דנדריט ידי לחיצה ימנית על העכבר על קצה הדנדריט מן השיקום ובחירת "הוסף Ending" מהתפריט הנפתח, ולאחר מכן לאתר את דנדריט באמצעות העכבר כמו לצייר כלי. עקוב פקודה כדי לציין אם ההמשך נמצא הקטע החדש.
15. עקוב דנדריטים באמצעות 3 חלקים סמוכים לפחות (אחד בכל צד שלסעיף הבית) בעקבות צעדים 3.8 - 3.15. הוסף בשחזור עד לפחות 3 סה"כ מדורים המשורטטים על הנוירון או עד דנדריטים כבר לא יכולים להיות מלווים או מוצאים. עקוב אחר קווי מתאר בסעיפים שכנים ביצוע השלבים לעיל, אם תרצה בכך.

4. Clustering העצמאי

הערה: אשכול עצמאי מנתח לאפשר ניתוחים משוחדים של מערכי נתונים גדולים, רבים-ממדיים שעלולה להיות קשה לחזות, חשוב, לספק הערכה כמותית של גיוון מורפולוגיים. פלטפורמת תכנות מבוסס מטריקס היא שימושית למדי עבור הניתוח של מערכי נתונים רבי ממדים ומאפשרת מניפולציות נתונים מתוחכמות ניתוחים סטטיסטיים. התפקידים הרשומים בשלב 4 - 6 מוגדרי פלטפורמת תכנות הנזכר בטבלה של חומרים / ציוד ספציפי, שורת 15.

1. לחלץ נתונים מורפולוגיים מכל שחזור עצבי פרט באמצעות שלוחהתכנית raction הקשורים למערכת שחזור נוירון (ראה טבלה של חומרים ספציפיים / ציוד, שורות 11 - 12).
   1. ראשית, לבחור את הנתונים מורפולוגיים הרצוי עבור כל השיקום כולל: מידע קונטור, מידע סמן, נתונים מורפולוגיים של גוף התא arborization הדנדריטים, וכו.
   2. מתוך התפריט הנפתח ערוך בסרגל הכלים העליון, בחר "בחר את כל הפריטים". לאחר מכן בחר "ניתוח מבנה מסועף" מהתפריט הנפתח הניתוח בסרגל הכלים העליונים לחץ על כל כרטיסיות ובחרו אפשרויות הניתוח הרצויות בכל כרטיסייה.
   3. חלץ את כל הנתונים הרצויים על ידי לחיצה על הכפתור "אישור" בחלון הניתוח ולשמור בפורמט גיליון אלקטרוני על ידי לחיצה ימנית על חלונות הפלט ובחירה באפשרות 'יצא ל- Excel ".
2. לקמפל גיליון אלקטרוני בעל הבית (ראו טבלה של חומרים / ציוד ספציפי, שורה 16) שבה כל משתנה מורפולוגיים / ליtric מיוצגת על ידי תצפית מספרית יחידה לכל נוירון. בגיליון האלקטרוני מאסטר זה, לשמור תיעוד של מזהה שורה עבור כל נוירון.
3. ודא כי כל המשתנים שנכללו בניתוח האשכול (מדדי מורפולוגיים למשל) הם בלתי תלויים זה בזה. לדוגמה, מספר הצמתים יהיה לתאם עם מספר סניפים בתוך arborization הדנדריטים או axonal. לפיכך, רק אחד משני המשתנים האלה צריך להיכלל ניתוח אשכולות.
4. ודא כל מדידה מכילה תצפית עבור כל משתנה, כלומר כל נוירון (מדידה), יש להגדיר נקודה-נתונים (תצפית) המתאימה לכל אחד מערכים מורפולוגיים (משתנה). אם תצפיות עבור משתנה מסוים (למשל, אורך האקסון) חסרים עבור קבוצת משנה של נוירונים, משתנה זה (אורך האקסון) לא יכול להיכלל ניתוח אשכולות.
5. ארגן את הנתונים על הגיליון האלקטרוני Master לתוך מטריצה ​​בודדת שכל שורה מייצגת נוירון EACטור h מכיל נתונים מספריים עבור כל ערך מורפולוגי (איור 1). לדוגמא, בסיס נתונים כולל 100 נוירונים עבורו יש תצפיות במשך 5 משתנים בלתי תלויים יהיה מיוצגות על ידי מטריצת 100 x 5 (שורה-אחר-טור). אין צורך לכלול זיהוי עבור כל נוירון בתוך המטריצה ​​- המדד בשורה ישמש כל המזהה הייחודי של נוירון. שם צריך להיות גם ללא פערים או "NaN" ים במטריצה. שמור את מטריקס כמשתנה יחיד (למשל נתונים = [100 x 5 מטריקס]; ראה קוד משלימה קובץ עבור דוגמת קוד).
6. בחר אלגוריתם לחישוב מרחקים בין נקודות המייצג נוירונים בודדים בחלל n ממדים כאשר n מוגדרת על ידי המספר משתנה. הפונקציה 'pdist' מאפשרת גמישות בחישוב מרחקים בין-נוירון. חישוב מרחק ברירת המחדל הוא המרחק האוקלידית ויש בו נעשה שימוש בעבר עבור ניתוחים דומים של morphologica העצביתנתוני l ^{5, 6.}
7. עם בין-נוירון מרחיק הפלט של הפונקציה 'pdist', השתמש בפונקציה 'הצמדה' כדי ליצור אשכולות. שוב, אפשרויות אשכולות מרובות זמינות. השיטה ומרחק centroid של הוורד הניבו תוצאות דומות בניתוחים של מערכי נתונים מורפולוגיים ^{5, 6.}
8. אם תרצה, להשתמש בפונקציית 'kmeans' כגישת אשכולות חלופית למושג "pdist 'ופונקציות' הצמדה '. 'Kmeans' מעסיקה בריבוע המרחק האוקלידית חישוב מרחקים בין-נוירון ומרחק centroid מכן להקצות אשכולות.
9. כדי להמחיש עץ אשכול היררכי, השתמש בפונקצית 'dendrogram' על הפלט של המבצע 'ההצמדה'. לתכונה זו הגדרת ברירת מחדל שמגבילה להדמיה עד 30 מדידות, אבל היא יכולה להיות מבוטלת על ידי ציון מספר המדידות ( נוירונים למשל) מוצגים. Dendrogram ממחיש את מרחקי הצמדה על ציר y עבור כל אחד הנוירונים, שזוהה על ידי המדד בשורה שלהם על ציר ה- x.
   הערה: היציאות של 'הצמדה' ו 'dendrogram' אינן מגדירות את המספר האופטימלי של אשכולות. תפוקת 'kmeans' אין להקצות מדידות לאשכולות, אבל זה לא לבדוק אם אשכולות אלה הם אופטימליים. השוואות סטטיסטיות נפרדות ואימות של אשכולות אופטימליים יכולים להתבצע (ראה להלן).

5. אימות של Clustering

הערה: כאמור לעיל, ניתוח האשכולות עצמו ישירות אינו מספק הערכה סטטיסטית אם האשכולות המומחשים dendrogram האשכול ייחודיים נציג של המדגם. שיטות לאימות אשכולות מן dendrogram הוצעו ^15, אולם אלה אינם מספקים אימות סטטיסטיות של אשכולות אופטימליים. יש רבשיטות ple לאימות אשכולות אופטימליים.

1. שיטת 1: אשכולות הערכה:
   1. השתמש בפונקציה 'evalclusters' המפרט את שיטת חישוב אשכולות, כגון 'kmeans' או 'הצמדה'. פלט מודל תערובת גאוס ניתן להעריך גם (ראה שלב 5.2 להלן; לראות קוד משלים קובץ עבור דוגמת קוד).
   2. ציין את קריטריון הערכה ממספר אפשרויות (למשל 'CalinskiHarabasz' - לקבלת תיאורים של אפשרויות קריטריון, עיין בתפריט העזרה, מחפש "evalclusters").
   3. ציין טווח של מספרי אשכול אופטימליים לבדוק (למשל [1: 6] כדי לבדוק אם 1, 2, 3, 4, 5, או 6 אשכולות הם אופטימליים).
      הערה: תפוקת 'evalclusters' היא מספר אופטימלי של אשכולות נתון אלגוריתם האשכולות ו הקריטריון שצוין.
2. שיטה 2: אשכולות מודל תערובת גאוס:
   הערה: אלגור אשכולות מודל תערובת גאוסithms (GMMs) להניח תצפיות עבור כל משתנה לבוא מתערובת של הפצות גאוס המגדירות כל אשכול משוער, כל אחד עם התוחלת השונה המשותף משלהם. GMM ואז עושה שימוש באלגוריתם מקסום ציפיית להקצות הסתברויות אחוריות כל מדידה, המצביעות על ההסתברות של השייכים אשכול ספציפי ^16.
   1. ליישם GMM באמצעות הפונקציה 'fitgmdist' על ידי הזנת המספר המשוער של אשכולות נצפים בנתונים. לחלופין, כדי למנוע הקצאה מראש של מספר אשכולות, השתמש ניתוח מרכיבים עיקריים (PCA) עם סדרת מספרים אשכול אופטימלית שונים באמצעות הפעולות המתוארות כאן (ראה קוד משלימה קובץ עבור דוגמת קוד).
   2. השתמש בפונקציה 'PCA' על מטריצת הנתונים המקוריים ולהציל את עשרות מרכיבים ראשיים כפלט.
   3. בלולאה החל מ 1 עובר מספר כמה אשכולות אופטימליים משוערים, השתמש הפונקצית 'fitgmdist' e על עשרות המרכיבים הראשיים וליצור GMMs עבור כל מספר של אשכולות אופטימליים משוערים.
   4. ערך כל GMM ידי בחינת סבירות יומן השלילית, קריטריון מידע Akaike וקריטריון מידע בייס. GMM עם הקריטריונים הנמוכים ביותר הוא אופטימלי.
   5. אם תרצה, לבדוק אם הערכים הממוצעים עבור כל אשכול שונים באופן משמעותי כאשר מספר האשכולות הוא אופטימלי (אמצעי של כל אשכול מאוחסן פלט "mu" של כל GMM).

6. ניתוח סטטיסטי של נתונים באשכולות

1. לאחר המספר האופטימלי של אשכול נקבע באמצעות אשכולות היררכיים ומוערך, לחזור את הנתונים המקוריים, נוירונים נפרדים לאשכולות, ולקבוע אילו מדדים מורפולוגיים לתרום האשכולות של נוירונים למעמדות ייחודיות.
2. מיין את הנתונים מטרי מורפולוגיים המקוריים כך נוירונים מקובצים על פי הקצאת אשכול.
3. בכדי לבחון יחסים בין נתונים מורפולוגיים פני נוירונים (עבור כל הנוירונים או נוירונים מתחלקים אשכולות), לבצע רגרסיה ליניארית מתאימה ל 2 ו 3 כיוונים השוואה של תצפיות מטרי מורפולוגיים. מתאים אלה ניתן להעריך באמצעות הפונקציה 'התאמה' ומוערכת באמצעות הפונקציה 'fitlm' שבו הטוב של פלטי לנכון לכלול ערכים R ² ו- p בהתקפי רגרסיה.
4. כדי לבחון את הקשרים הסטטיסטיים בין הנוירונים בכל אשכול, השתמש הלא פרמטרית דו מדגם (ווילקוקסון דרגה סכום הבדיקה) או בדיקות השוואות מדגם מרובים (ANOVA), תלוי במספר האשכולות. חשוב לציין, השימוש מרובה המדגם ANOVAs מבטיח כי ערכי p מתוקנים להשוואות מרובות.

תוצאות

הראינו בעבר כי שחזורים בקנה מידה גדולה של נוירונים בתוך אוכלוסייה סלקטיבית היא ההזרקה הבאה ריאלית של וירוס כלבת מהונדס לתוך dLGN ^5. לאחרונה, אותה הרקמה נוצלה לשחזר 160 נוירונים במגזר החזותי של הטורנירים (בראג ואחות ', בסקירה;. איור 2 א-ב)

Discussion

מחקרי neuroanatomical נותרו עמוד הנוירולוגיה הריבית האחרונה connectomics ויחסי מבנה-תפקוד חדש התלהבות לאפיון מורפולוגי מפורט של אוכלוסיות נוירונים סלקטיבית. באופן מסורתי, מחקרי neuroanatomical יש לסמוך על סיווגים איכותיים של נוירונים למעמדות ברורות מורפולוגית של נוירונים שהוגדרו על ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SADΔG-EGFP	E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute		Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten	FHC	UEPSGGSE1N2M	Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II	Drummod Scientific	3-000-204, 110V	Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome	Thermo Scientific
DAB	Sigma Aldrich	D5905-50TAB	3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C	Sigma Aldrich	C2037-100MG
Catalase	Sigma-Aldich	C9322-5G
Rabbit anti-GFP	Life Technologies/Thermo Fisher	#A-11122	Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit	Vector Laboratories	#BA-1000	Secondary antibody
Neurolucida System	MicroBrightField		Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer	MicroBrightField		Data export software
Microfire Camera	Optronics		2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope	Nikon Instruments Inc.		Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab	The MathWorks Inc.		Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel	Microsoft		Spreadsheet program