Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos

Resumen

Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de poblaciones neuronales selectivas, etiquetadas después de la infección retrógrada con un virus de la rabia modificado expresan marcadores fluorescentes, y analiza, racimo imparcial independiente que permiten la caracterización completa de las métricas morfológicas entre subclases neuronales distintas.

Resumen

Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de las neuronas en combinación con el uso de la agrupación independiente e imparcial análisis para crear un estudio exhaustivo de las características morfológicas observadas entre una población neuronal selectiva. La combinación de estas técnicas constituye un enfoque novedoso para la recogida y análisis de datos neuroanatómicos. En conjunto, estas técnicas permiten a gran escala, y por lo tanto más amplio, el muestreo de poblaciones neuronales selectivos y establecer métodos cuantitativos para describir imparciales clases neuronales morfológicamente únicos dentro de una población.

El protocolo se describe el uso de virus de la rabia modificado para etiquetar selectivamente las neuronas. G-elimina actos virus de la rabia como un trazador retrógrado tras la inyección estereotáxica en una estructura cerebral diana de interés y sirve como un vehículo para el suministro y la expresión de EGFP en las neuronas. Un gran número de neuronas están infectadas usando estetécnica y expresar GFP a través de sus dendritas, la producción de rellenos "Golgi" completos de las neuronas individuales. Por consiguiente, el método de rastreo retrógrado mediada por virus mejora sobre las técnicas tradicionales de rastreo retrógrado con base de tinte mediante la producción de rellenos intracelulares completas.

Individuales neuronas bien aisladas que abarcan todas las regiones de la zona del cerebro en estudio se seleccionan para la reconstrucción con el fin de obtener una muestra representativa de las neuronas. El protocolo describe los procedimientos para reconstruir los cuerpos celulares y completar los patrones de arborización dendrítica de neuronas marcadas que abarcan múltiples cortes de tejido. Los datos morfológicos, incluyendo posiciones de cada neurona dentro de la estructura del cerebro, se extraen para su posterior análisis. funciones de programación estándares se utilizaron para llevar a cabo agrupación independiente de análisis y evaluaciones de racimo basados ​​en métricas morfológicas. Para comprobar la utilidad de estos análisis, la evaluación estadística de un análisis de conglomerados performado en 160 neuronas reconstruidas en el núcleo reticular del tálamo del tálamo (TRN) del macaco fue hecho. Tanto el análisis de conglomerados original y las evaluaciones estadísticas realizadas aquí indican que las neuronas TRN se dividen en tres subpoblaciones, cada una con características morfológicas únicas.

Introducción

Neuroanatomía es uno de los fundamentos de la neurociencia ¹ y el interés reciente en "conectómica" ha renovado el entusiasmo para la comprensión de la diversidad morfológica de poblaciones neuronales y las conexiones entre las neuronas específicas ^2. Los métodos para el etiquetado y la reconstrucción de las neuronas han mejorado en gran medida con las innovaciones recientes, incluyendo el trazado de circuito y genética mediada por virus enfoques ^{3, 4,} lo que permite estudios morfológicos más amplios de poblaciones neuronales ^5. Además de....

Protocolo

Nota: El tejido examinado en este estudio se preparó como una parte de un estudio separado ^5. Por lo tanto, todos los métodos experimentales sobre la utilización de los animales se han descrito en detalle en la sección Métodos Experimentales de Briggs et al. (2016). Todos los procedimientos con animales llevados a cabo como parte del estudio previo fueron aprobados por los Comités de Cuidado de Animales y el uso institucional. Los pasos para la inyección de virus en el dLGN y el procesamiento histológico de tejido cerebral se describen brevemente a continuación en las secciones 1 - 2.

1. inyección estereotáx....

Resultados

Hemos demostrado previamente que las reconstrucciones de gran escala de las neuronas dentro de una población selectiva es factible la inyección siguiente de virus de la rabia modificado en el dLGN ^5. Recientemente, se utilizó el mismo tejido para reconstruir 160 neuronas en el sector visual de la TRN (Bragg et al, en opinión;. Figura 2A-B) siguiendo los pasos metodológicos detallados descritos anteriormente. En el estudio TRN, tres grupo.......

Discusión

Los estudios neuroanatómicos han seguido siendo un pilar de la neurociencia y la reciente interés en conectómica y relaciones estructura-función ha renovado entusiasmo por la caracterización morfológica detallada de las poblaciones neuronales selectivas. Tradicionalmente, los estudios neuroanatómicos han basado en las clasificaciones cualitativas de las neuronas en clases morfológicamente distintos de neuronas definidas por neuroanatomistas expertos. Con los avances en las técnicas para la reconstrucción de la.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SADΔG-EGFP	E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute		Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten	FHC	UEPSGGSE1N2M	Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II	Drummod Scientific	3-000-204, 110V	Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome	Thermo Scientific
DAB	Sigma Aldrich	D5905-50TAB	3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C	Sigma Aldrich	C2037-100MG
Catalase	Sigma-Aldich	C9322-5G
Rabbit anti-GFP	Life Technologies/Thermo Fisher	#A-11122	Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit	Vector Laboratories	#BA-1000	Secondary antibody
Neurolucida System	MicroBrightField		Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer	MicroBrightField		Data export software
Microfire Camera	Optronics		2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope	Nikon Instruments Inc.		Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab	The MathWorks Inc.		Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel	Microsoft		Spreadsheet program