قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

Summary

يمكن الميتوكوندريا الاستفادة من إمكانات الكهروكيميائية عبر الغشاء الداخلي من (Δ _Ψm) لعزل الكالسيوم (الكالسيوم ^2+)، مما يتيح لهم تشكيل الكالسيوم عصاري خلوي ²⁺ يشير داخل الخلية. نحن تصف طريقة لقياس وقت واحد الميتوكوندريا الكالسيوم ²⁺ امتصاص وΔΨ _م في الخلايا الحية باستخدام الأصباغ الفلورية والفحص المجهري متحد البؤر.

Abstract

وبصرف النظر عن دورها الأساسي في توليد اعبي التنس المحترفين، تعمل الميتوكوندريا أيضا الكالسيوم المحلي (كا ²⁺⁾ مخازن لتنظيم بإحكام داخل الخلايا تركيز الكالسيوم ^2+. للقيام بذلك، الميتوكوندريا الاستفادة من الإمكانيات الكهروكيميائية عبر الغشاء الداخلي من (ΔΨ _م) إلى عزل الكالسيوم ^2+. تدفق الكالسيوم ²⁺ في الميتوكوندريا يحفز ثلاثة أنزيم نازع للهيدروجين معدل الحد من دورة حمض الستريك، وزيادة نقل الإلكترون من خلال الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) المجمعات. يحافظ هذا التحفيز ΔΨ _م، التي تبدد مؤقتا على أيونات الكالسيوم إيجابية تعبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا في مصفوفة الميتوكوندريا.

نحن هنا وصف طريقة لقياس وقت واحد الميتوكوندريا الكالسيوم ²⁺ امتصاص وΔΨ _م في الخلايا الحية باستخدام متحد البؤر المجهري. بواسطة permeabilizing الخلايا، والكالسيوم الميتوكوندريا ²⁺ يمكنيتم قياسها باستخدام الكالسيوم الفلورسنت ²⁺ مؤشر فلوو-4، صباحا، مع قياس ΔΨ _م باستخدام tetramethylrhodamine صبغة الفلورسنت، استر الميثيل، فوق كلورات (TMRM). الاستفادة من هذا النظام هو أن هناك القليل جدا من التداخل الطيفي بين الأصباغ الفلورية، مما يتيح القياس الدقيق للالميتوكوندريا الكالسيوم ²⁺ وΔΨ _م في وقت واحد. عن طريق إضافة متتابعة من الكالسيوم ²⁺ قسامات، كاليفورنيا الميتوكوندريا ²⁺ امتصاص يمكن رصدها، والتركيز الذي كا ²⁺ يدفع الميتوكوندريا الانتقال نفاذية الأغشية وفقدان ΔΨ _م تحديدها.

Introduction

الميتوكوندريا تلعب دورا هاما في تنظيم الخلايا تركيز الكالسيوم ²⁺ من خلال العمل كحلقة المحلية الكالسيوم ²⁺ مخازن ^1. كاليفورنيا ²⁺ يدخل الميتوكوندريا عبر uniporter كاليفورنيا ^2+، وهي عملية يقودها التدرج الكهروكيميائية موجود عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا (ΔΨ _م) ^2. مرة واحدة داخل المصفوفة الميتوكوندريا، كاليفورنيا ²⁺ يمكن تنشيط الفسفرة التأكسدية من خلال تحفيز ثلاثة أنزيم نازع للهيدروجين معدل الحد من دورة حمض الستريك ^3. يحافظ هذا التحفيز ΔΨ _م، التي تبدد مؤقتا على أيونات الكالسيوم إيجابية تعبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا في مصفوفة الميتوكوندريا. إذا كا ²⁺ تركيز داخل الميتوكوندريا يصبح عالية جدا، ويمكن البدء في الانتقال نفاذية الميتوكوندريا، مما أدى إلى تبديد ΔΨ _م، وcessatioن من الفسفرة التأكسدية وتحريض موت الخلايا مسارات الإشارات ^4.

الدور الهام الذي تلعبه الميتوكوندريا في التخزين المؤقت المكاني من الكالسيوم الخلوي يجعل رصد دقيق من الكالسيوم الميتوكوندريا حرجة. وقد وضعت أساليب مختلفة لمراقبة الكالسيوم الميتوكوندريا، بما في ذلك استخدام الأصباغ القائمة على رودامين. واحدة من هذه الصبغة، Rhod-2، صباحا، هو فعال جدا في التقسيم إلى الميتوكوندريا لقياس الميتوكوندريا الكالسيوم ²⁺ مستويات ^{5 و 6.} ومع ذلك، يجب توخي الحذر لأن بعض صبغ سوف تتراكم في عضيات أخرى مثل الجسيمات الشحمية، أو البقاء في العصارة الخلوية الخلية. ومع ذلك، تحليلات المصب ويمكن استخدام لتمييز هذه الإشارات من تلك الموجودة في الميتوكوندريا ^7.

أسلوب آخر لمراقبة الكالسيوم الميتوكوندريا تستخدم مراسل فلوري يبني ⁸ تصل>. ويستفيد من هذه المجسات المشفرة وراثيا هي أنها يمكن أن تستهدف على وجه التحديد إلى الميتوكوندريا باستخدام الببتيدات-N محطة الذاتية، على سبيل المثال إشارة استهداف N-الطرفية من البشر كوكس فرعية الثامن. واستخدمت هذا النظام لإنشاء مسبار aequorin استهداف الميتوكوندريا التي أثبتت مفيدة للغاية لتحقيق الكالسيوم الميتوكوندريا مما يشير إلى ^9. العيب الرئيسي لهذه التحقيقات المشفرة وراثيا هو أنها تحتاج إلى إدخالها في الخلايا عن طريق التعبير عابر (وهو ليس ممكنا بالنسبة لأنواع الخلايا معينة، ويمكن أن تؤدي إلى نتائج متغيرة) أو عن طريق إنشاء نظم التعبير مستقرة (والذي هو مضيعة للوقت).

الالتفاف على المشاكل المذكورة أعلاه، قمنا بتطوير بروتوكول جديد لقياس الميتوكوندريا الكالسيوم ²⁺ وΔΨ _م في وقت واحد. ويستند هذا البروتوكول على الطريقة الموصوفة سابقا أن يضيف الكالسيوم دخيلة على الخلايا permeabilizedالصورة = "XREF"> 10. بروتوكول لدينا ثلاثة المزايا الرئيسية مقارنة مع الطرق الأخرى: أولا، ونحن نستخدم فلوو-4، صباحا وTMRM لمراقبة الكالسيوم الميتوكوندريا ²⁺ وΔΨ _م، وهما الأصباغ التي لها خصائص طيفية مميزة جدا. ثانيا، وpermeabilized الخلايا بحيث إشارة فلوو-4 ويكتشف فقط الميتوكوندريا الكالسيوم ²⁺ وليس كا ²⁺ المترجمة إلى العضيات الأخرى أو العصارة الخلوية الخلية؛ وثالثا، استخدام فلوو-4 لكشف الكالسيوم الميتوكوندريا ²⁺ يسمح سريعة وبسيطة تلطيخ الخلية، ويلغي أي قضايا ترنسفكأيشن الخلية أو التحول التي توجد في حالة استخدام تحقيقات المشفرة وراثيا.

Protocol

1. إعداد الخلايا

1. تنمو الخلايا على أطباق زراعة الخلايا 10 سم أو 75 سم ² قوارير في وسائل الإعلام والثقافة [10 مل التعديل النسور Dulbecco والمتوسطة (DMEM) تستكمل مع 5٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS) و1X البنسلين / الستربتومايسين (ص / ق )] في 37 ° C / 5٪ CO _2.
2. حصاد الخلايا، وإزالة وسائل الإعلام التي كتبها الطموح، ثم يغسل مع 5 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني 1X). إزالة برنامج تلفزيوني 1X بواسطة الشفط، ثم يضاف 1.5 مل 0.25٪ (ث / ت) التربسين / 0.25٪ (ث / ت) ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) واحتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO ₂ لمدة 2 دقيقة. الاستفادة من طبق أو قارورة برفق لإزالة الخلايا resuspend ثم في وسائل الإعلام ثقافة 5 مل.
3. عد الخلايا عن طريق إضافة 12 ميكرولتر من الخلايا معلق على عدادة الكريات.
4. لوحة الخلايا في أطباق أو coverslips غرف للتصوير متحد البؤر.
   ملاحظة: هذه لديها من البلاستيك أو الزجاج أسفل مناسبة والتي تم تصميمها للاستخدام مع المجاهر المقلوب.
5. لوحة الخلايا حتى عشرفي ~ يتحقق 80٪ confluency في يوم التصوير. على سبيل المثال، ما يقرب من 2 × 10 ⁴ خلايا عظمية 143B يمكن مطلي في بئر واحدة من 8 جيدا الشرائح الغرفة يوم واحد قبل التصوير.
6. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية / 5٪ CO ₂ للسماح للخلايا لنعلق والتعافي.

2. المخازن لTMRM وفلوو-4 التصوير

1. إعداد الحل سجل (RS) التي تحتوي على 156 ملي مول كلوريد الصوديوم، 3 ملي بوكل، 2 ملي MgSO _4، 1.25 ملي KH ₂ PO _4، 10 ملم مد الجلوكوز، 2 مم CaCl ₂ و 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.35. متجر RS في aliquots في -20 درجة مئوية.
2. إعداد بين الخلايا المتوسطة (IM) التي تحتوي على 6 مم كلوريد الصوديوم، و 130 ملي بوكل، 7.8 ملي MgCl _2، 1 ملم KH ₂ PO _4، 0.4 ملي CaCl _2، 2 مم EGTA، 10 ملي HEDTA، 2 مم مالات، 2 مم الغلوتامات، 2 مم شرطة أبوظبي و 20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.1. 200 الحلول الأسهم ملم من مالات، الغلوتامات وADP يمكن إعداد بشكل منفصل، aliquoted، وتخزينها في -20 درجة مئوية. هذه الحاديويمكن أن يضاف ocks إلى IM فقط قبل الاستخدام.
3. كاليفورنيا مجانا ²⁺ هانك في محلول الملح مخزنة (HBSS) ويمكن الحصول على معدة سلفا من الموردين التجارية. إضافة جلايكول الإثيلين مكرر (β-aminoethyl الأثير) -N، N، N '، حمض N' tetraacetic (EGTA) إلى تركيز النهائي من 500 ميكرومتر.
4. يعد حل الأسهم من 10 ملي tetramethylrhodamine، استر الميثيل، فوق كلورات (TMRM) في الميثانول بنسبة 100٪. من هذا المخزون، وجعل مخزون العمل من 2 ميكرومتر في H المقطر ₂ O.
5. يعد حل الأسهم من 10 ملي فيراباميل في الإيثانول بنسبة 100٪.
6. إعداد 1 ملغ / مل (ث / ت) حل سهم فلوو-4 acetoxymethyl استر (فلوو-4، ص) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]).
   ملاحظة: فلوو-4، صباحا هو مؤشر الكالسيوم التي يسلك زيادة مضان على ربط الكالسيوم ^2+. فلوو-4 هو التناظرية من فلوو-3، مع بدائل الكلور اثنين من يحل محله الفلورين. هذا يؤدي إلى زيادة الإثارة مضان في 488 نانومتر، وأعلى مستويات إشارة مضان. النتائج AM استر الجماعة في بدون تهمة فلوو-4 الجزيء الذي يمكن أن تتخلل أغشية الخلايا. مرة واحدة داخل الخلية، هو المشقوق استر AM بواسطة المونوأمينوأوكسيداز غير محددة، مما أدى إلى شكل بتهمة فلوو-4 الذي محاصرين داخل الخلية.
7. إعداد محلول المخزون من 1 ملم الكربونيل السيانيد ف trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) في الإيثانول بنسبة 100٪.
8. إعداد محلول المخزون من 25 ملغ / مل (ث / ت) ديجيتونين في H المقطر ₂ O.
9. إعداد محلول المخزون من 100 thapsigargin ميكرومتر في DMSO.
10. إعداد محلول المخزون 40 ملي كلوريد الكالسيوم (CaCl ₂₎ في H المقطر ₂ O.

3. تلطيخ الخلايا مع TMRM وفلوو-4، AM

1. يعد حل RS تلطيخ مع 20 نانومتر TMRM، 5 ميكروغرام / مل (ث / ت) فلوو-4، صباحا و0.005٪ السطحي مثل Pluronic F-127 في RS.
   ملاحظة: هذه السطحي هو بوليول غير أيوني أن يسهل ذوبان من فلوو-4، ص. ملاحظة: يمكن أيضا إضافة 10 ميكرومتر فيراباميل لinhibiتصدير ر TMRM قبل نقل غشاء البلازما المتعددة إذا تم التعبير عن ذلك في نوع من الخلايا التي يجري تحليلها.
2. إزالة سائل الإعلام والثقافة من الخلايا عن طريق ماصة، ويغسل مع 100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X.
3. إزالة برنامج تلفزيوني 1X بواسطة ماصة واحتضان خلايا في 250 ميكرولتر حل RS تلطيخ لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: مرة واحدة في فلوو-4، AM يدخل الخلية، هو المشقوق استر AM بواسطة المونوأمينوأوكسيداز الخلوية. تفرخ في درجة حرارة الغرفة يثبط النشاط استريز، مما يسمح فلوو-4، صباحا لدخول الميتوكوندريا.
4. إزالة حل RS تلطيخ بواسطة ماصة وغسل الخلايا في 100 ميكرولتر الكالسيوم ²⁺ مجانا HBSS لإزالة الزائد فلوو-4، صباحا وTMRM.
5. إعداد IM حل التصوير مع 25 ميكروغرام / مل (ث / ت) ديجيتونين، 200 نانومتر TMRM و1 thapsigargin ميكرومتر في الدردشة.
   ملاحظة: قد تحتاج تركيز ديجيتونين إلى تعديل لضمان permeabilization الغشاء الداخلي الميتوكوندريا لا يحدث. وهذا يمكن أن تحدد تجريبيا من خلال تقييم كثافةللإشارة TMRM بتركيزات مختلفة من ديجيتونين.
6. إزالة الكالسيوم ²⁺ مجانا HBSS بواسطة ماصة وإضافة 300 ميكرولتر من محلول التصوير IM إلى الخلايا. ترك الخلايا لتتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. الخلايا هي الآن جاهزة للتصوير مع CaCl ₂ إضافات.

التصوير 4. خلية

1. وضع طبق أو غرف ساترة مع الخلايا في حل التصوير IM على مجهر متحد البؤر مقلوب المسح بالليزر.
2. استخدام الإعداد على أشعة الليزر المجهر لالإثارة وانبعاث أطياف TMRM وفلوو-4. على سبيل المثال، استخدم 543 نانومتر وني وخطوط 473 الأرجون ليزر نانومتر لإثارة TMRM وفلوو-4 على التوالي. استخدام طاقة الليزر المنخفضة ما يقرب من 5٪ للحد من أي الصور والأضرار التي لحقت الخلايا.
3. تعيين المجهر لمسح الصور كل 25 ثانية. خلايا المسح الضوئي لمدة 10 دقيقة لإقامة قراءات أساسية لTMRM وفلوو-4 إشارات.
   ملاحظة: إشارة فلوو-4 قد يكون ضعيفا أو لا يمكن الكشف عنها في يستريح تناسق الكالسيومحصص.
4. إضافة 3 ميكرولتر من 40 ملي CaCl ₂ حل الأسهم مباشرة إلى الخلايا في 300 ميكرولتر من محلول التصوير IM (التخفيف 1: 100) وتخلط بلطف مع ماصة. وقفة مسح صورة مع إضافة وخلط CaCl ₂ إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: مجانا الكالسيوم ²⁺ تركيز أيون النهائي [كا ^2+] في حل التصوير IM يمكن حسابها باستخدام برامج مثل Maxchelator WEBMAXC الموسعة ( http://www.stanford.edu/٪7Ecpatton/maxc.html ) أو خالب ^11. وصف مفصل لكيفية حساب مجانا الكالسيوم ²⁺ تركيز أيون النهائي [كا ^2+] يوصف في القسم 6 أدناه.
5. متابعة المسح الضوئي على الصورة لحوالي 4 دقائق، ثم كرر CaCl ₂ إضافات كل 4 دقائق حتى TMRM المطلوبة أو فلوو-4 الإشارات التي تم التوصل إليها، وعادة حوالي 8-10 الإضافات.
6. باستخدام ماصة، إضافة التخفيف 1: 100 1 ملم FCCP (ج النهائيةoncentration من 10 ميكرومتر) مباشرة إلى الخلايا لتبديد ΔΨ _م. خلايا صورة لمدة 5 دقائق إضافية. الانتهاء من التجربة الآن.

تحليل 5. صورة

1. مرة واحدة التصوير اكتمال، وتحديد كثافة إشارات فلوو-4 و TMRM باستخدام برمجيات تحليل الصور، للحصول على البرنامج المثال يماغيج مع البرنامج المساعد بيو تنسيقات (تنزيل "bioformats_package.jar" من http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / وحفظه في: المجلد "C الإضافات ملفات البرنامج يماغيج ').
2. فتح ملف التصوير (على سبيل المثال ملف .oif) في ImageJ. انقر على أداة التحديد واختر المنطقة ذات الاهتمام (ROI) الذي يحتوي على الميتوكوندريا. استخدام إشارة TMRM الأولية لتحديد العائد على الاستثمار.
3. فتح 'تحليل> أدوات> مدير العائد على الاستثمار "، انقر فوق' إضافة 'لتشمل العائد على الاستثمار التي اختيرت لقياس كثافة. يمكن اختيار رويس متعددة على صورة واحدة للقياس. الخطوات السابقة كرر حتى عن العائد على الاستثمارتم إضافة الصورة إلى مدير العائد على الاستثمار.
4. انقر على "المزيد> قياس متعددة، تأكد من أن" قياس جميع شرائح 'تم اختياره وهذا صف واحد لكل شريحة "سيتم إلغاء، ثم انقر فوق" موافق "للحصول على جدول كثافة الفلورسنت يعني من TMRM وفلوو-4 إشارات لكل العائد على الاستثمار في كل نقطة زمنية.
5. استخدام البيانات من جميع رويس لحساب متوسط ​​الشدة والانحراف المعياري لTMRM وفلوو-4 إشارات.

6. حساب الختامي ²⁺ الكالسيوم الحرة ايون تركيز [كا ^2+]

1. حرية الكالسيوم ²⁺ تركيز أيون [كا ^2+] في حل التصوير IM يمكن تحديد باستخدام برنامج مثل Maxchelator WEBMAXC الموسعة ( http://www.stanford.edu/٪7Ecpatton/maxc.html ) أو خالب ^11. على سبيل المثال، تعيين المتغيرات في WEBMAXC ممتدة على النحو التالي: درجة الحرارة = 24 درجة مئوية، ودرجة الحموضة = 7.1، أيوني قوة = 0.162، EGTA = 0.002 M، HEDTA = 0.01 م، كا ²⁺ = 0.0004 M والمغنيسيوم ²⁺ = 0،0078 م. وهذا يؤدي إلى حر كا ²⁺ التركيز النهائي أيون [كا ^2+] من 62 نانومتر . نلاحظ أن هذه البرامج لا يمكن أن تأخذ في الاعتبار كل متغير، مثل نقاء الكاشف، دقة القياسات وتحديد درجة الحموضة. الطريقة الأكثر دقة لتحديد المجاني تركيز الكالسيوم ²⁺ هو استخدام الكالسيوم معايرة ²⁺ القطب الانتقائي.

النتائج

وقد استخدمنا هذا البروتوكول لدراسة الآثار المترتبة على الطفرة MT-ND5 على قدرة الميتوكوندريا خلية 143B لتخفيف الزيادة في الكالسيوم ^12. في المثال الموضح هنا، تم تحميل خلايا 143B السيطرة مع TMRM وفلوو-4، صباحا قبل permeabilization مع ديجيتونين. بعد 5 د?...

Discussion

الكالسيوم يلعب دورا حاسما في العديد من عمليات الخلية، بما في ذلك تقلص العضلات، مما يشير الى العصبية والخلايا انتشار ^13. غالبا ما ترتبط الزيادة في تركيز الكالسيوم الخلية مع الطلب على الطاقة، مع الكالسيوم قادرة على تحفيز مباشرة الميتوكوندريا الفسفرة التأ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin/0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641