Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Резюме

Митохондрии могут использовать электрохимический потенциал через их внутреннюю мембрану (Δ _фт) секвестр кальция (Ca ^2+), что позволяет им формировать цитозольного Ca ²⁺ сигналов внутри клетки. Мы опишем метод для одновременного измерения митохондрий поглощения Са ²⁺ и ΔΨ _м в живых клетках с использованием флуоресцентных красителей и конфокальной микроскопии.

Аннотация

Помимо своей важной роли в создании АТФ, митохондрии также выступать в качестве местного кальция (Ca ²⁺⁾ буферы плотно регулировать концентрацию внутриклеточного Ca ^2+. Для этого, митохондрии используют электрохимический потенциал через их внутреннюю мембрану (ΔΨ _м) секвестр Ca ^2+. Приток Са ²⁺ в митохондрии стимулирует три ограничения скорости дегидрогеназ цикла лимонной кислоты, увеличивая перенос электронов через окислительное фосфорилирование (OXPHOS) комплексов. Эта стимуляция поддерживает Аф _м, что временно рассеиваемой как положительные ионы кальция пересекают внутренней мембраны митохондрий в митохондриях.

Здесь мы опишем метод одновременного измерения митохондрий поглощения Са ²⁺ и ΔΨ _м в живых клетках с использованием конфокальной микроскопии. По permeabilizing клеток, митохондриальных Ca ²⁺ можетбыть измерена с использованием флуоресцентного Са ²⁺ индикатора Fluo-4, AM, с измерением разориен- _м с использованием тетраметилродамин флуоресцентный краситель, метиловый эфир, перхлорат (TMRM). Преимущество этой системы состоит в том , что существует очень мало спектральное перекрытие между флуоресцентных красителей, что позволяет точно измерять митохондриального Са ²⁺ и Аф _м одновременно. Используя последовательное добавление Ca ²⁺ аликвот, митохондриальная Ca ²⁺ поглощение можно контролировать, и концентрация , при которой Са ²⁺ индуцирует митохондриальной переход проницаемость мембран и потеря Аф _м определяется.

Введение

Митохондрии играют важную роль в регуляции внутриклеточной концентрации Са ^2+, выступая в качестве местных Са2 ⁺ буферов ^1. Ca ²⁺ поступает в митохондрии через унипорт Ca ^2+, процесс , приводимый электрохимического градиента , который существует по всей внутренней митохондриальной мембране (ΔΨ _м) ^2. Оказавшись внутри митохондриях, Ca ²⁺ может активировать окислительного фосфорилирования, стимулируя три ограничения скорости дегидрогеназ цикла лимонной кислоты ^3. Эта стимуляция поддерживает Аф _м, что временно рассеиваемой как положительные ионы кальция пересекают внутренней мембраны митохондрий в митохондриях. Если концентрация Са ²⁺ в митохондриях становится очень высокой, митохондриальная переход проницаемость может быть инициирована, что приводит к распылению разориен- _м, то cessatioп окислительного фосфорилирования и индукция гибели клеток путей ⁴ передачи сигналов.

Важная роль, которую играют митохондрии в пространственной буферизации клеточного кальция делает точный мониторинг митохондриального кальция критическим. Различные методы были созданы для мониторинга митохондриальную кальция, в том числе с использованием красителей на основе родамина. Одним из таких красителей, Rhod-2, АМ, весьма эффективен при разбиении на митохондрии для измерения уровней митохондриальных ⁵ Ca ^{2+, 6.} Однако необходимо использовать в качестве какой-то краситель будет накапливаться в других органеллах, таких как липосомы, или остаются в цитозоле клетки. Тем не менее, ниже по течению анализы могут быть использованы , чтобы отличить эти сигналы от тех , из митохондрий ^7.

Другой метод для мониторинга митохондриальную кальций использует флуоресцентные репортер строит ⁸ вверх>. Польза от этих генетически кодируемых зондов является то, что они могут быть конкретно направлены на митохондрии с помощью эндогенные N-концевых пептидов, например, сигнал с N-концевым адресности человеческого ЦОГ-субъединицы VIII. Эта система была использована для создания митохондриальный-мишенью акворина зонд , который оказался чрезвычайно полезным для исследования митохондриальной кальция сигнализации ^9. Главный недостаток этих генетически кодируемых зондов является то, что они должны быть введены в клетки путем временной экспрессии (что не представляется возможным для некоторых типов клеток, и может производить различные результаты), либо путем создания стабильных систем экспрессии (что отнимает много времени).

Для того, чтобы обойти проблемы , описанные выше, мы разработали новый протокол для измерения митохондриальную Са ²⁺ и Аф _м одновременно. Этот протокол основан на методе, описанном ранее, который добавляет экзогенного кальция в клетках пермеабилизированныхs = "Xref"> 10. Наш протокол имеет три основных преимущества по сравнению с другими способами: во - первых, мы используем Fluo-4, AM и TMRM для мониторинга митохондриальную Са ²⁺ и Аф _м, два красителей , которые имеют очень разные спектральные свойства; Во- вторых, клетки проницаемыми , так что сигнал Fluo-4 только обнаружение митохондриальных Ca ²⁺ и Ca ²⁺ не локализованы в других органеллах , или в цитозоль клеток; и в- третьих, использование Fluo-4 для обнаружения митохондриальных Ca ²⁺ позволяет быстро и просто окрашивания клеток, отрицающий любые трансфекции клеток или трансформации проблемы , которые существуют при использовании генетически кодируемых зондов.

протокол

1. Получение клеток

1. Рост клеток на 10 см чашки для культивирования клеток или 75 см ² колбах в культуральной среде [10 мл Дульбекко Модифицированные орлов Medium (DMEM) , дополненной 5% (об / об) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1x пенициллина / стрептомицина (P / S )] при 37 ° C / 5% CO _2.
2. Для сбора клеток, удалить носитель путем аспирации, а затем промывают 5 мл 1x фосфатным буферным солевым раствором (1x PBS). Удалить 1X PBS отсасыванием, а затем добавляют 1,5 мл 0,25% (вес / об) трипсин / 0,25% (вес / объем) этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и инкубировать при 37 ° C / 5% CO ₂ в течение 2 мин. Нажмите чашка или колба осторожно, чтобы удалить клетки, а затем ресуспендируют в 5 мл культуральной среды.
3. Граф клеток путем добавления 12 мкл ресуспендировали клеток на гемоцитометра.
4. Пластина клеток в посуде или камерных покровные для конфокальной микроскопии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет иметь подходящий пластмассовый или со стеклянным дном, который был разработан для использования с перевернутыми микроскопов.
5. Пластинчатые клетки так йна ~ 80% конфлюэнтности достигается в день визуализации. Например, примерно 2 х 10 ⁴ 143B остеосаркомы клетки можно высевать в одну лунку 8-а камера слайд за один день до обработки изображений.
6. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° C / 5% CO ₂ , чтобы позволить клеткам прикрепляться и восстанавливаться.

2. Буферы для TMRM и Fluo-4 изображений

1. Подготовка записи решения (RS) , содержащего 156 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 2 мМ MgSO _4, 1,25 мМ KH ₂ PO _4, 10 мМ D-глюкозы, 2 мМ CaCl ₂ и 10 мМ HEPES , рН 7,35. Магазин RS в аликвотах при -20 ° С.
2. Подготовьте внутриклеточный Medium (IM) , содержащего 6 мМ NaCl, 130 мМ KCl, 7,8 мМ MgCl _2, 1 мМ KH ₂ PO _4, 0,4 мМ CaCl _2, 2 мМ EGTA, 10 мМ ГЭДТК, 2 мМ малат, 2 мМ глутамата, 2 мМ АДФ и 20 мМ HEPES, рН 7,1. 200 мМ маточные растворы малат, глутамат и АДФ могут быть приготовлены отдельно, на аликвоты и хранили при -20 ° С. Эти улocks могут быть добавлены в IM непосредственно перед использованием.
3. Ca ²⁺ свободного Хэнка буферном солевом растворе (HBSS) , может быть получен заранее подготовленные от коммерческих поставщиков. Добавить этиленгликоль-бис (β-аминоэтиловый эфир) -N, N, N ', N'-этилендиаминтетрауксусной кислоты (EGTA) до конечной концентрации 500 мкМ.
4. Подготовка исходного раствора 10 мМ тетраметилродамин, метиловый эфир, перхлорат (TMRM) в 100% метаноле. Из этого запаса, сделать рабочий запас 2 мкМ в дистиллированной H ₂ O.
5. Подготовка исходного раствора 10 мМ Верапамил в 100% этаноле.
6. Подготовьте 1 мг / мл (вес / об) маточного раствора Fluo-4 ацетоксиметил эфира (Fluo-4, AM) в диметилсульфоксиде (ДМСО).
   Примечание: Fluo-4, AM является индикатором кальция , который проявляет повышенную флуоресценцию при связывании Са ^2+. Fluo-4 является аналогом Fluo-3, с двумя заместителями хлора замещены атомами фтора. Это приводит к увеличению возбуждения флуоресценции при длине волны 488 нм и более высоким уровнем сигнала флуоресценции.сложноэфирная группа AM приводит к незаряженной Fluo-4 молекулы, которые могут проникать через клеточные мембраны. После того, как внутри клетки, сложный эфир АМ расщепляется неспецифических эстераз, в результате чего в заряженном виде Fluo-4, который захватывается внутри клетки.
7. Готовят раствор 1 мМ карбонилцианид р-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) в 100% этаноле.
8. Подготовка исходного раствора 25 мг / мл (вес / об) дигитонина в дистиллированной H ₂ O.
9. Готовят раствор 100 мкМ тапсигаргин в ДМСО.
10. Подготовка исходного раствора 40 мМ хлорида кальция (CaCl ₂₎ в дистиллированной H ₂ O.

3. Окрашивание клеток с TMRM и Fluo-4, AM

1. Готовят RS окрашивающий раствор с 20 нМ TMRM, 5 мкг / мл (вес / об) Fluo-4, AM и 0,005% поверхностно-активного вещества, такие как Pluronic F-127 в RS.
   Примечание: Этот поверхностно-активное вещество представляет собой неионный полиол, который облегчает солюбилизацию Fluo-4, AM. Примечание: 10 мкМ верапамила также могут быть добавлены к inhibiэкспорт т TMRM в плазматической мембране с множественной лекарственной переносчика, если она экспрессируется в типе клеток, анализируемой.
2. Удалить из культуральной среды клеток с помощью пипетки и промывают 100 мкл 1x PBS.
3. Удалить 1X PBS с помощью пипетки и инкубировать клеток в 250 мкл окрашивающего раствора Р.С. в течение 45 мин при комнатной температуре.
   Примечание: После того, как Fluo-4, М. поступает в клетку, сложный эфир АМ расщепляется с помощью клеточных эстераз. Инкубация при комнатной температуре ингибирует активность эстеразы, позволяя Fluo-4, AM, чтобы войти в митохондрии.
4. Удалить RS окрашивание раствора с помощью пипетки и промыть клетки в 100 мкл Ca ²⁺ свободный HBSS для удаления избытка Fluo-4, AM и TMRM.
5. Готовят раствор формирования изображения IM с 25 мкг / мл (вес / объем) дигитонин, 200 нМ TMRM и 1 мкМ тапсигаргин в IM.
   Примечание: Концентрация дигитонина может потребоваться скорректировать, чтобы гарантировать, что пермеабилизации из внутренней мембраны митохондрий не происходит. Это может быть определено эмпирически путем оценки интенсивностисигнала TMRM при различных концентрациях дигитонином.
6. Удалите Ca ²⁺ свободный HBSS с помощью пипетки и добавляют 300 мкл раствора визуализации IM к клеткам. Оставьте клетки уравновешивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Клетки теперь готовы для работы с изображениями с CaCl ₂ дополнения.

4. Сотовый обработки изображений

1. Поместите блюдо или камерные покровное с клетками в растворе визуализации IM на инвертированного лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
2. Используйте настройки на микроскоп лазеров для возбуждения и излучения спектров TMRM и Fluo-4. Например, можно использовать 543 нм He-Ne-и 473 нм аргонового лазера линии для возбуждения TMRM и Fluo-4 соответственно. Используйте низкую мощность лазера примерно на 5%, чтобы свести к минимуму любые фото-повреждения клеток.
3. Установите микроскоп для сканирования изображений каждые 25 сек. Сканирование клеток в течение 10 мин, чтобы получить базовые показания для TMRM и сигналов Fluo-4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал Fluo-4 может быть слабым или невозможно обнаружить при отдыхает ОБОГАЩЕНИЯ кальциярационы.
4. Добавить 3 мкл 40 мМ CaCl ₂ маточного раствора непосредственно в клетки в 300 мкл раствора изображений IM (1: 100 разведение) и осторожно перемешать с помощью пипетки. Приостановка сканирования изображения во время добавления и смешивания CaCl ₂ при необходимости.
   Примечание: Конечный свободный Са ²⁺ концентрации ионов [Са ^2+] в растворе визуализации IM можно рассчитать с помощью программного обеспечения , такого как Maxchelator WEBMAXC Длинное ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) или хелатор ^11. Подробное описание того , как вычислить конечный свободный Ca ²⁺ концентрации ионов [Са ^2+] описана в разделе 6 ниже.
5. Продолжить сканирование изображения в течение примерно 4 мин, а затем повторить CaCl ₂ дополнения каждые 4 мин до получения желаемого TMRM или сигналов Fluo-4 достигаются, как правило , около 8 до 10 дополнений.
6. С помощью пипетки добавьте 1: 100 разведение 1 мМ FCCP (финал Concentration 10 мкМ) непосредственно к клеткам , чтобы рассеять Аф _м. Клетки изображение еще в течение 5 мин. Эксперимент теперь закончен.

Анализ 5. Изображение

1. После завершения формирования изображения, определяют интенсивность сигналов Fluo-4 и TMRM с использованием программного обеспечения для анализа изображений, например, ImageJ программного обеспечения с помощью плагина Био-форматов (скачать 'bioformats_package.jar' от http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / и сохранить его в "C: Program Files ImageJ Plugins 'папку).
2. Откройте файл изображения (например, файл .oif) в ImageJ. Нажмите на инструмент выбора и выбора интересующей области (ROI), который содержит митохондрии. Использовать исходный сигнал TMRM для выбора ROI.
3. Открыть "Анализ> Инструменты> ROI менеджер", нажмите кнопку "Добавить", чтобы включить выбранный ROI для измерения интенсивности. Несколько трансформирования могут быть выбраны на одном изображении для измерения. Повторите предыдущие шаги, пока все ROIs, которые были добавлены в ROI Manager.
4. Нажмите кнопку "Дополнительно> Многопозиционное измерение ', убедитесь, что" Мера все ломтики' выбран и что "по одной строке на фрагмент 'снят, затем нажмите кнопку" OK ", чтобы получить таблицу средней интенсивности флуоресценции сигналов от TMRM и Fluo-4 для каждого ROI в каждый момент времени.
5. Используйте данные из всех трансформирования для расчета средней интенсивности и стандартное отклонение для TMRM и сигналов Fluo-4.

6. Расчет конечного свободного Са ²⁺ концентрации ионов [Са ^2+]

1. Бесплатно Ca ²⁺ концентрации ионов [Са ^2+] в растворе визуализации IM может быть определена с помощью программного обеспечения , таких как Maxchelator WEBMAXC РАСПРОСТРАНЕНИЯ ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) или хелатирующего ^11. Например, установите переменные в WEBMAXC РАСПРОСТРАНЕНИЯ следующим образом: температура = 24 ° С, рН = 7.1, Ионная сила = 0,162, EGTA = 0,002 М, ГЭДТК = 0,01 М, Са ²⁺ = 0,0004 М и Mg ²⁺ = 0,0078 М. Это приводит к конечной свободной Са ²⁺ концентрации ионов [Са ^2+] 62 нм , Обратите внимание, что эти программы не могут принимать во внимание каждую переменную, например, чистота реактива, точность измерений и определения рН. Наиболее точный метод определения концентрации свободного Ca ²⁺ является использование калиброванной Ca ²⁺ селективный электрод.

Результаты

Мы использовали этот протокол для изучения влияния мутации MT-ND5 на способность митохондрий клеток 143B в буфер возрастает кальция ^12. В примере, показанном здесь, клетки 143В управления были загружены TMRM и Fluo-4, М., прежде чем пермеабилизации дигитонином. Ч?...

Обсуждение

Кальций играет важную роль во многих клеточных процессах, в том числе сокращение мышц, нервных клеток сигнализации и пролиферации клеток ^13. Увеличение концентрации клеток кальция часто связаны с спроса на энергию, с кальцием , способного непосредственно стимулировать мит...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin/0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641