Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Mitochondria kann das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (Δ _{& psi; m)} verwenden , Calcium (Ca ²⁺⁾ zu maskieren, so dass sie cytosolischen Ca ²⁺ zu formen innerhalb der Zelle signalisiert. Wir beschreiben ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen Mitochondrien Ca ²⁺ -Aufnahme und ΔΨ _m in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe und konfokale Mikroskopie.

Zusammenfassung

Abgesehen von ihrer wesentliche Rolle bei der ATP zu erzeugen, Mitochondrien wirken auch als lokale Calcium (Ca ²⁺⁾ Puffer zu eng regulieren intrazelluläre Ca2 ⁺ -Konzentration. Dazu nutzen Mitochondrien das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (ΔΨ _m) zu sequestrieren Ca ^2+. Der Zustrom von Ca ²⁺ in die Mitochondrien stimuliert drei geschwindigkeitsbestimmend Dehydrogenasen des Zitronensäurezyklus, Erhöhung der Elektronentransfer durch die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Komplexe. Diese Stimulation unterhält ΔΨ _m, die vorübergehend als die positiven Calciumionen überqueren die inneren Mitochondrienmembran in die mitochondriale Matrix abgeführt wird.

Wir beschreiben hier ein Verfahren zur gleichzeitigen Messung von Mitochondrien Ca ²⁺ -Aufnahme und ΔΨ _m in lebenden Zellen konfokalen Mikroskopie. Durch die Permeabilisierung der Zellen, Mitochondrien - Ca ²⁺ kannVerwendung der fluoreszierenden Ca ²⁺ Indikator Fluo-4, AM, gemessen werden mit der Messung der ΔΨ _m den Fluoreszenzfarbstoff Tetramethylrhodamin Verwendung von Methylester, Perchlorat (TMRM). Der Vorteil dieses Systems ist , dass es sehr wenig spektrale Überlappung zwischen den fluoreszierenden Farbstoffen, so dass eine genaue Messung der mitochondrialen Ca ²⁺ und ΔΨ _m gleichzeitig. Verwendung der sequentiellen Zugabe von Ca ²⁺ Aliquots können mitochondriale Ca ²⁺ -Aufnahme überwacht werden, und die Konzentration , bei der Ca ²⁺ mitochondrialen Membranpermeabilität Übergang und den Verlust von ΔΨ induziert _m bestimmt.

Einleitung

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle intrazelluläre Ca2 ⁺ -Konzentration in der Regulation von ¹ als lokale Ca ²⁺ Puffer wirken. Ca ²⁺ tritt in die Mitochondrien über das Ca ²⁺ Uniporter, ein Verfahren , mit dem elektrochemischen Gradienten angetrieben, der über den inneren Mitochondrienmembran (ΔΨ _m) ² existiert. Einmal in der mitochondrialen Matrix, Ca ²⁺ kann die oxidative Phosphorylierung aktivieren , indem drei geschwindigkeitsbegrenzenden stimulierenden Dehydrogenasen des Zitronensäurezyklus ^3. Diese Stimulation unterhält ΔΨ _m, die vorübergehend als die positiven Calciumionen überqueren die inneren Mitochondrienmembran in die mitochondriale Matrix abgeführt wird. Wenn der Ca ²⁺ -Konzentration in den Mitochondrien sehr hoch wird, kann mitochondrial permeability transition eingeleitet werden, was zur Dissipation von ΔΨ _m, die cessation der oxidativen Phosphorylierung und die Induktion von Zelltod - Signalwege ^4.

Die wichtige Rolle, die Mitochondrien in der räumlichen Pufferung von zellulären Kalzium spielen macht die genaue Überwachung der mitochondrialen Kalzium kritisch. Es wurden verschiedene Verfahren etabliert mitochondrialen Calcium zu überwachen, einschließlich der Verwendung von Rhodamin-basierte Farbstoffe. Ein solcher Farbstoff, Rhod-2, AM, ist sehr effektiv bei der Aufteilung in die Mitochondrien mitochondrialen Ca ²⁺ -Spiegel ⁵ zu ^{messen, 6.} Jedoch muss darauf verwendet werden, wie einige Farbstoff in anderen Organellen, wie Liposomen ansammelt, oder verbleiben in der Zell-Cytosol. Dennoch können Downstream - Analysen ⁷ diese Signale von den aus den Mitochondrien zu unterscheiden , eingesetzt werden.

Eine andere Technik zur mitochondrialen Kalzium Monitor nutzt fluoreszierende Reporterkonstrukte ⁸ up>. Der Vorteil dieser genetisch codierten Sonden ist, dass sie gezielt durch die Verwendung endogener N-terminalen Peptide in die Mitochondrien ziel werden, beispielsweise die N-terminale Targeting-Signal des menschlichen COX-Untereinheit VIII. Dieses System wurde verwendet , um eine mitochondriale gezielte Aequorin Sonde zu erzeugen , die extrem nützlich für die Untersuchung der mitochondrialen Calcium erwiesen hat Signalisierungs ^9. Der Hauptnachteil dieser genetisch codierten Sonden ist, dass sie in die Zellen durch transiente Expression eingeführt werden müssen (was nicht durchführbar für bestimmte Zelltypen und unterschiedliche Ergebnisse produzieren kann) oder durch stabile Expressionssysteme zu schaffen (was zeitaufwändig).

Um die Probleme zu umgehen oben dargelegt, haben wir ein neues Protokoll zur Messung der mitochondrialen Ca2 ⁺ und ΔΨ _m gleichzeitig entwickelt. Dieses Protokoll basiert auf einem vorher beschriebenen Verfahren, die permeabilisierten Zellen exogene Calcium fügts = "xref"> 10. Unser Protokoll hat drei wesentliche Vorteile gegenüber anderen Methoden: Zum einen nutzen wir Fluo-4, AM und TMRM mitochondrialen Ca ²⁺ zu überwachen und ΔΨ _m, zwei Farbstoffe , die sehr unterschiedliche spektrale Eigenschaften aufweisen; Zweitens werden die Zellen permeabilisiert so daß der Fluo-4 - Signal nur mitochondrialen Ca ²⁺ und Ca ²⁺ nicht an andere Organellen oder Zell - Cytosol lokalisiert ist , zu erfassen; und drittens, die Verwendung von Fluo-4 zu mitochondrialen Ca ²⁺ erkennen ermöglicht eine schnelle und einfache Zellfärbung, negiert alle Zelle Transfektion oder Transformation Probleme, die bestehen , wenn genetisch kodierte Sonden verwendet.

Protokoll

1. Herstellung von Zellen

1. Wachsen Zellen auf 10 cm Zellkulturschalen oder 75 cm ² -Kolben in Kulturmedium [10 ml Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) , ergänzt mit 5% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1 x Penicillin / Streptomycin (P / S )] bei 37 ° C / 5% CO _2.
2. Um Zellen ernten, entfernen Medien durch Absaugen, dann waschen mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung (1x PBS). Entfernen 1x PBS durch Absaugen, dann wurden 1,5 ml 0,25% addieren (w / v) Trypsin / 0,25% (w / v) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und inkubiere bei 37 ° C / 5% CO ₂ für 2 min. Tippen Sie Teller oder Kolben sanft Zellen zu entfernen, dann Resuspendieren in 5 ml Kulturmedien.
3. Zählen von Zellen durch Zugabe von 12 ul resuspendierten Zellen auf einem Hämozytometer.
4. Platten-Zellen in Schalen oder chambered Deck für die konfokale Bildgebung.
   ANMERKUNG: Diese werden eine geeignete Kunststoff- oder Glasboden haben, der für die Verwendung mit inverse Mikroskope konzipiert wurde.
5. Plattenzellen so thbei ~ 80% Konfluenz am Tag der Bildgebung erreicht. Beispielsweise etwa 2 x 10 & ^sup4 ; 143B Osteosarkomzellen können in einer Vertiefung eines 8-Well - Kammerobjektträger einen Tag vor der Abbildungs plattiert werden.
6. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C / 5% CO ₂ an Zellen ermöglichen , zu befestigen und zu erholen.

2. Puffer für TMRM und Fluo-4 Imaging

1. Prepare Record Solution (RS) , enthaltend 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgSO _4, 1,25 mM KH ₂ PO _4, 10 mM D-Glucose, 2 mM CaCl ₂ und 10 mM HEPES pH 7,35. Shop RS in Aliquots bei -20 ° C.
2. Vorbereitung intrazelluläres Medium (IM) , enthaltend 6 mM NaCl, 130 mM KCl, 7,8 mM MgCl _2, 1 mM KH ₂ PO _4, 0,4 mM CaCl _2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM Malat, 2 mM Glutamat, 2 mM ADP und 20 mM HEPES pH 7.1. 200 mM Stammlösungen von Malat, Glutamat und ADP getrennt, aliquotiert und bei -20 ° C hergestellt werden. Diese stocks kann kurz vor dem Gebrauch mit dem IM hinzugefügt werden.
3. Ca ²⁺ frei können Hanks gepufferte Salzlösung (HBSS) erhalten werden von kommerziellen Anbietern vorbereiteten. Hinzufügen, Ethylenglykol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N ', N'-tetraessigsäure (EGTA) in einer Endkonzentration von 500 uM.
4. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM Tetramethylrhodamin, Methylester, Perchlorat (TMRM) in 100% Methanol. Von diesem Lager, machen eine Arbeits Bestand von 2 uM in destilliertem H ₂ O
5. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM Verapamil in 100% Ethanol.
6. Bereiten Sie eine 1 mg / ml (w / v) Stammlösung von Fluo-4 Acetoxymethylester (Fluo-4, AM) in Dimethylsulfoxid (DMSO).
   HINWEIS: Fluo-4, AM ist ein Kalzium - Indikator, der Fluoreszenz bei der Bindung Ca ²⁺ erhöht aufweist. Fluo-4 ist ein Analogon von Fluo-3, mit den beiden Chlorsubstituenten durch Fluoratome ersetzt. Dies führt zu einer erhöhten Fluoreszenzanregung bei 488 nm und eine höhere Fluoreszenzsignalpegel. DasAM Estergruppe führt zu einer ungeladenen Fluo-4-Molekül, das die Zellmembranen durchdringen kann. Einmal in der Zelle, wird der AM-Ester durch unspezifische Esterasen gespalten, was zu einer geladenen Form von Fluo-4, die in der Zelle eingeschlossen ist.
7. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mM carbonyl Cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) in 100% igem Ethanol.
8. Bereiten Sie eine Stammlösung von 25 mg / ml (w / v) Digitonin in destilliertem H ₂ O
9. Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 uM Thapsigargin in DMSO.
10. Bereiten Sie eine Stammlösung von 40 mM Calciumchlorid (CaCl ₂₎ in destilliertem H ₂ O

3. Anfärben von Zellen mit TMRM und Fluo-4, AM

1. Vorzubereiten RS Färbelösung mit 20 nM TMRM, 5 ug / ml (w / v) Fluo-4, AM und 0,005% Tensid, wie Pluronic F-127 in RS.
   HINWEIS: Dieses Tensid ist ein nicht-ionisches Polyol, das die Solubilisierung von Fluo-4, AM erleichtert. Anmerkung: 10 uM Verapamil können auch hinzugefügt werden, um inhibit TMRM Export durch die Plasmamembran Multidrug-Transporter wenn es in der Zelltyp exprimiert wird analysiert.
2. Entfernen Kulturmedien von Zellen mit einer Pipette und waschen mit 100 ul 1x PBS.
3. Entfernen 1x PBS pipettiert und inkubieren Zellen in 250 & mgr; l RS Färbelösung für 45 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Nachdem die Fluo-4, AM in die Zelle eindringt, die AM-Ester durch zelluläre Esterasen gespalten wird. Inkubieren bei Raumtemperatur hemmt Esterase-Aktivität, so dass Fluo-4, AM die Mitochondrien zu betreten.
4. Entfernen RS Färbelösung mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen in 100 & mgr; l Ca ²⁺ freies HBSS Überschuss Fluo-4, AM und TMRM zu entfernen.
5. Bereiten Sie IM Imaging-Lösung mit 25 ug / ml (w / v) Digitonin, 200 nM TMRM und 1 uM Thapsigargin in IM.
   HINWEIS: Die Konzentration von Digitonin müssen diese Permeabilisierung der mitochondrialen inneren Membran sicherzustellen angepasst werden nicht auftritt. Dies kann empirisch bestimmt werden, indem die Intensität der Beurteilungdes TMRM Signals bei verschiedenen Konzentrationen von Digitonin.
6. Entfernen Sie die Ca ²⁺ freies HBSS mit einer Pipette und 300 ul IM Imaging - Lösung zu den Zellen. Lassen Zellen für 10 min bei Raumtemperatur äquilibrieren. Die Zellen sind nun bereit für die Bildgebung mit CaCl ₂ Ergänzungen.

4. Cell Imaging

1. Legen Gericht oder chambered Deckglas mit Zellen in IM Imaging-Lösung auf einem invertierten Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop.
2. Verwendung auf dem Mikroskop-Laser-Einstellung für die Anregungs- und Emissionsspektren von TMRM und Fluo-4. Verwenden Sie zum Beispiel 543 nm He-Ne und 473 nm Argon-Laser Linien TMRM und Fluo-4 bzw. zu erregen. Verwenden Sie eine niedrige Laserleistung von ca. 5% ein beliebiges Foto-Schäden an den Zellen zu minimieren.
3. Stellen Sie Mikroskopbilder alle 25 Sekunden zu scannen. Scan-Zellen für 10 min herzustellen Basisablesungen für die TMRM und Fluo-4-Signale.
   HINWEIS: Die Fluo-4-Signal bei ruhenden Kalzium concent schwach oder nicht nachweisbar seinVerpflegung.
4. In 3 ul 40 mM CaCl ₂ Stammlösung direkt auf die Zellen in 300 ul IM Imaging - Lösung (eine 1: 100 - Verdünnung) und vorsichtig mischen mit einer Pipette. Pause , um die Bildabtastung während das Hinzufügen und die CaCl ₂ bei Bedarf mischen.
   HINWEIS: Die endgültige können freie Ca ²⁺ Ionenkonzentration [Ca ^2+] in der IM - Imaging - Lösung mit einer Software wie Maxchelator WEBMAXC berechnet werden VERLÄNGERT ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) oder Chelator ^11. Eine detaillierte Beschreibung, wie die letzte freie Ca ²⁺ -Ionen - Konzentration zu berechnen [Ca ^2+] wird in Abschnitt 6 weiter unten beschrieben.
5. Weiter Bildabtastung für ca. 4 min, dann wiederholen CaCl ₂ Ergänzungen alle 4 min , bis die gewünschte TMRM oder Fluo-4 Signale erreicht werden, in der Regel um 8 bis 10 Ergänzungen.
6. Mit einer Pipette, fügen Sie eine 1: 100 Verdünnung von 1 mM FCCP (endgültige cONZENTRATION von 10 & mgr; M) direkt zu den Zellen ΔΨ _m abzuleiten. Bildzellen für weitere 5 min. Das Experiment ist nun abgeschlossen.

5. Bildanalyse

1. Sobald Bildgebung abgeschlossen ist, bestimmen die Intensität der Fluo-4 und TMRM Signale Bildanalyse-Software unter Verwendung beispielsweise ImageJ Software mit dem Bio-Formats Plugin (download 'bioformats_package.jar' von http://downloads.openmicroscopy.org/bio -Formate / und speichern sie es in der "C: Program Files ImageJ plugins" Ordner).
2. Öffnen Sie die Bilddatei (zum Beispiel eine .OIF-Datei) in ImageJ. Klicken Sie auf das Auswahlwerkzeug und wählen Sie eine Region of Interest (ROI), die Mitochondrien enthält. Verwenden Sie das anfängliche TMRM Signal den ROI zu wählen.
3. Open 'Analysieren> Tools> ROI-Manager', klicken Sie auf "Hinzufügen", um die ausgewählte ROI zur Intensitätsmessung einzubeziehen. Multiple ROIs können auf einem einzigen Bild für die Messung ausgewählt werden. Wiederholen Sie vorherigen Schritte, bis alle ROIs wurden dem ROI-Manager hinzugefügt.
4. Klicken Sie auf "Mehr> Multi Measure", stellen Sie sicher, dass "alle Scheiben messen" ausgewählt ist, und dass "eine Zeile pro Scheibe 'deaktiviert ist, und klicken Sie auf" OK ", eine Tabelle der mittleren Fluoreszenzintensität der TMRM und Fluo-4 Signale zu erhalten, für jeden ROI zu jedem Zeitpunkt.
5. Verwenden von Daten aus allen ROIs die mittleren Intensitäten und Standardabweichung für die TMRM und Fluo-4 Signale zu berechnen.

6. Berechnung der letzten freien Ca ²⁺ Ionenkonzentration [Ca ^2+]

1. Die freie Ca ²⁺ Ionenkonzentration [Ca ^2+] in der IM - Imaging - Lösung kann mit einer Software wie Maxchelator WEBMAXC VERLÄNGERT (bestimmt werden http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ¹¹⁾ oder Chelat. Sie können beispielsweise die Variablen in WEBMAXC VERLÄNGERT wie folgt: Temperatur = 24 ° C, pH = 7.1, Stärke Ionic = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca ²⁺ = 0,0004 M und Mg ²⁺ = 0,0078 M. Dies führt zu einem Endgehalt an freiem Ca ²⁺ Ionenkonzentration [Ca ^2+] i von 62 nM . Beachten Sie, dass diese Programme nicht berücksichtigt jede Variable annehmen kann, wie beispielsweise Reagenz Reinheit, die Genauigkeit der Messungen und die pH-Bestimmung. Die genaueste Methode für die freie Ca ²⁺ Konzentration bestimmen , ist eine kalibrierte Ca ²⁺ selektive Elektrode zu verwenden.

Ergebnisse

Wir haben dieses Protokoll verwendet , um die Auswirkungen einer MT-ND5 Mutation auf die Fähigkeit der Zelle 143B Mitochondrien zu untersuchen Erhöhungen ¹² Calcium zu puffern. In dem hier gezeigten Beispiel wurden Kontroll 143B Zellen beladen mit TMRM und Fluo-4, AM vor Permeabilisierung mit Digitonin. Nach 5 min der Bildgebung, acht aufeinanderfolgende Zugaben einer 1: 100 - Verdünnung von 40 mM CaCl ₂ exogene hergestellt wurden, mit der l...

Diskussion

Calcium spielt eine wichtige Rolle in vielen Zellprozessen, einschließlich Muskelkontraktion, neuronaler Signalgebung und Zellproliferation ^13. Erhöhungen der Zelle Calciumkonzentrationen sind oft mit Energiebedarf verbunden sind , mit Kalzium können direkt mitochondriale oxidative Phosphorylierung zu stimulieren ATP Generation ³ zu erhöhen. Es ist daher wichtig, dass wir die Fähigkeit, effektiv überwachen mitochondriale Calciumakkumulation und der Lage sein, zu verg...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin/0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641