عزل ماوس بطانة الرحم طلائي واللحمية خلايا ل<em&gt; في المختبر</em&gt; Decidualization

Summary

تقدم هذه الدراسة طريقة موحدة والتحقق من صحتها للعزلة وثقافة الماوس الرئيسي انسجة بطانة الرحم والخلايا الظهارية، والتي يمكن استخدامها في نظام coculture للدراسة في decidualization المختبر.

Abstract

Decidualization هو عملية المفاضلة التي تعتمد على هرمون البروجسترون من خلايا انسجة بطانة الرحم، وهو شرط أساسي لنجاح زرع الأجنة. رغم ما بذل الكثير من الجهود للكشف عن الآليات الكامنة وراء decidualization، والإشارات الدقيقة بين الخلايا الظهارية التي هي على اتصال مع الجنين والخلايا اللحمية الأساسية لا تزال غير مفهومة. لذلك، ودراسة decidualization بطريقة يأخذ كل الظهارية وخلايا اللحمية في الاعتبار يمكن تحسين معرفتنا حول التفاصيل الجزيئية للdecidualization. لهذا الغرض، في النماذج الحية من decidualization الاصطناعي هي من الناحية الفسيولوجية الأكثر أهمية. ومع ذلك، والتلاعب من الاتصالات بين الخلايا غير محدود. حاليا، في الثقافات المختبر من خلايا انسجة بطانة الرحم يتم استخدامها للتحقيق في التشكيل من decidualization عدة جزيئات الإشارة. تقليديا، وخلايا انسجة الإنسان أو الماوس بطانة الرحم هيمستخدم. ومع ذلك، فإن توافر العينات البشرية وفي كثير من الأحيان محدودة. وعلاوة على ذلك، ويرافق استخدام أنسجة الفئران مع التنوع في طريقة زراعة. تقدم هذه الدراسة طريقة التحقق من صحة وموحدة للحصول النقي بطانة الرحم الخلايا الظهارية (EEC) والثقافات اللحمية الخليوي (ESC) باستخدام الكبار الفئران سليمة تعامل مع هرمون الاستروجين لمدة ثلاثة أيام متتالية. تم تحسين بروتوكول لتحسين العائد، والسلامة، ونقاء من الخلايا وكذلك تمديد لدراسة decidualization في coculture الجماعة الاقتصادية الأوروبية وESC. هذا النموذج قد تكون مناسبة لاستغلال أهمية كل أنواع الخلايا في decidualization وتقييم مساهمة الجزيئات يشير الهامة التي يفرزها EEC أو ESC خلال الاتصالات بين الخلايا.

Introduction

بطانة الرحم البشري هو البطانة الداخلية للرحم ويخضع لدورات شهرية من انهيار وإصلاح تمهيدا لحالات الحمل المحتملة. وهو يتألف من طبقة واحدة من الخلايا الطلائية المبطنة لتجويف الرحم وسدى الكامنة التي تختلف في السمك وفقا لتقلبات المبيض هرمونات الاستروجين والبروجستيرون. خلال مرحلة الجسم الأصفر، وارتفاع هرمون البروجسترون بعد الإباضي لحث على تمايز الخلايا اللحمية بطانة الرحم إلى خلايا الساقطية أكبر، جولة، وهي عملية تسمى decidualization ^{1 و 2.} في الإنسان، تحدث هذه الظاهرة بشكل عفوي لتشكيل predecidua، ولكنه يصبح أكثر وضوحا على زرع الأجنة. والنتيجة الوظيفية decidualization هي أن الرحم يصبح عابر تقبلا لزرع الجنين. وصفت هذه الفترة باسم "نافذة زرع". خلال الفترة المبكرة من زرع الأجنة، البريد decidualizedوالخلايا اللحمية ndometrial المحيطة الجنين زرع توفر حاجزا لمنع مرور المواد الضارة إلى الجنين ^3. خلال فترة الحمل، وهذا الساقط توفير المواد الغذائية للجنين النامي قبل اتخذت المشيمة مكان، وستشكل لاحقا الجزء الأمهات من المشيمة ^(4).

الاعتبارات الأخلاقية والعملية تحد من تصميم الدراسات الإنسان للتحقيق في عملية decidualization ولقد دفعت استخدام النماذج الحيوانية. كونه عضوا في مجموعة المشيمة دموية مشيمائية، فإن بطانة الرحم من القوارض تخضع أيضا decidualization قبل المشيمة ^5. في القوارض، ومع ذلك، فإن الشروع في عملية decidualization يعتمد على وجود الكيسات الأريمية في تجويف الرحم، مما يدل على أن التحفيز الإضافي اللازم لتحريك ردود الساقطية ^6. هذا ينطوي على الاتصالات المعقدة بين عشرالبريد خلايا بطانة الرحم الظهارية التي لها اتصال مباشر مع الكيسة، والخلايا اللحمية الأساسية. ومع ذلك، decidualization يمكن أن يتسبب بشكل مصطنع استخدام المنبهات مثل الخدش الميكانيكي أو تقطير النفط في الرحم تستعد هرمونيا. على الرغم من الدراسات المجراة باستخدام نماذج decidualization الاصطناعية سمحت لنا لتحسين رؤيتنا في عملية معقدة إشارات من decidualization، الميكانيكية دراسات معمقة، على سبيل المثال، التحقيق في البلاغ الذي لا غنى عنه بين الخلايا الظهارية واللحمية، محدودة. لذلك، في الدراسات المختبرية decidualization يمكن استخدامها لمعالجة مسارات مهمة ودراسة العمليات الأساسية. تحقيقا لهذه الغاية، مزارع الخلايا اللحمية بطانة الرحم الأولية يمكن إعدادها من بطانة الرحم البشري أو القوارض. توظيف القوارض يوافق على استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا للتحقيق في دور بروتين معين من الاهتمام أثناء عملية decidualization. ومع ذلك، غير ناضج، prepuberوغالبا ما تستخدم تاي الفئران من أجل تجنب المضاعفات دورة داقية، بينما في حالات أخرى يتم جمع رحم من جميع مراحل دورة داقية، مما يؤدي إلى عدم التجانس في الثقافات. وعلاوة على ذلك، وقد تمت دراسة عملية decidualization في بروتوكولات مختلفة، على سبيل المثال، عن طريق (ط) الهرمونات المكمل (الاستروجين والبروجسترون أو الأدينوزين الأدينوزين الحلقي (المخيم)) إلى وسيلة زراعة، أو (ب) عزل الخلايا الساقطة من الفئران في اليوم 4.5 من (الزائفة) الحمل، والتي تتطلب ضرورة إضافية لفحص المكونات والذكور أجريت لهم هذه العمليات. هذه القيود تدل على ضرورة وجود طريقة موحدة للدراسة في decidualization المختبر. في هذه الدراسة، وهذا نموذج الفسيولوجية لفحص في المختبر decidualization بدءا من الكبار، وستعرض غير (الزائفة) الفئران الحوامل. في هذه الطريقة، سوف حقن يومية من 17β استراديول (E2) تحفز تكاثر خلايا بطانة الرحم، مما أدى إلى زيادة العائد من متجانسة وصالسكان الخلية لدى عودتهم. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام نظام coculturing يسمح دراسة الحديث المتبادل-الظهارية انسجة والقدرة على التعامل مع عملية decidualization على مستويات مختلفة.

Protocol

AlexaFluor

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات لهذه الدراسة من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية من جامعة الكويت لوفين (بلجيكا) (مشروع P174 / 2013). تم إيواء الفئران تحت الظروف القياسية، مع إعلان بالمال وبالشهرة أيضا الوصول إلى الغذاء الكريات وماء الصنبور، وأبقى تحت ظروف خاضعة للرقابة (23 ± 1.5 درجة مئوية والرطوبة النسبية 40-60٪، 12/12 دورة الضوء / الظلام).

1. الفئران

1. استخدام المتاحة تجاريا سلالة الماوس (أي C57BL / 6، أنثى 8-12 أسابيع من العمر). عادة، 4 - 5 الفئران تسفر عن مبلغ مناسب من الخلايا لمزيد من التجارب.
2. حقن الفئران سليمة تحت الجلد مع 100 ميكرولتر من 17β استراديول (E2) حل (100 نانوغرام / 100 ميكرولتر) لمدة 3 مرات متتالية د قبل العزلة من أجل توحيد مرحلة من مراحل دورة داقية من الحيوانات وللحث على انتشار بطانة الرحم الخلايا. الحاجة للتحقق من مرحلة دورة من الفئران قبل بدء البروتوكول هو إمكانية تجنبهاسبب 3 د "علاج استراديول.

2. التحضيرات

1. جعل حل من 100 نانوغرام / 100 ميكرولتر E2 في arachis النفط. لحقن الفئران خمسة (كما هو موضح في 1.2)، هناك حاجة إلى مبلغ 1.5 مل.
   1. حل 1 ملغ E2 في 1 مل ايثانول أن يكون لها حل الأوراق المالية من 1 ملغ / مل.
   2. تمييع هذا الحل الأوراق المالية 1: 1000 في مجال النفط arachis.
2. جعل 500 مل من محلول ملح هانك المتوازن (HBBS) 1X تستكمل مع 100 البنسلين U / مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (أشار أيضا إلى أنه HBSS +).
3. جعل 500 مل من تصفية خلية الفأر بطانة الرحم اللحمية (مسك) متوسطة إلى مسك الثقافة: Dulbecco لتعديل النسر متوسطة / المغذيات خليط F12 (DMEM / F12) مع الفينول الأحمر، L-الجلوتامين و4- (2-هيدروكسي) بيبيرازين-1-ethanesulfonic حامض، N - (2-هيدروكسي) piperazine- N '- (حمض 2-ethanesulfonic) (HEPES) تحتوي على 10٪ FBS، و 0.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B، و 100 ميكروغرام / مل الجنتاميسين (فويشار rther باسم مسك المتوسطة).
4. جعل 500 مل من تصفيتها 2٪ متوسطة مسك للثقافة مسك خلال decidualization: DMEM / F12 مع الفينول الأحمر، L-الجلوتامين وHEPES تحتوي على 2٪ FBS، و 0.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B، و 100 ميكروغرام / مل الجنتاميسين.
5. إعداد 500 مل من تصفية خلية الفأر بطانة الرحم طلائي (MEEC) المتوسطة: DMEM تحتوي على 10٪ FBS، و 0.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B، و 100 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 25٪ MCDB-105 متوسطة، و 5 ميكروغرام / مل الانسولين (ويشار كذلك إلى كما MEEC المتوسطة).
6. إعداد coverslips بولي-L-ليسين (PLL) المغلفة للثقافة مسك.
   1. حل 25 ملغ من PLL في 250 مل من الماء المقطر. تصفية الحل باستخدام فلتر 0.22 ميكرون.
   2. إضافة coverslips العقيمة في لوحة 12-جيدا. إضافة 300 ميكرولتر من PLL حله في لل coverslips.
   3. إزالة حل بعد 30 دقيقة من الحضانة. ويمكن تخزين لوحات في 4 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى (حتى 1-2 أشهر).
7. إعداد 10 ملغ / مل حل الأسهم سو نوع كولاجيناز IA وتخزين aliquots من 300 ميكرولتر في -20 درجة مئوية. تصفية قبل الاستخدام.

3. الاستعدادات المطلوبة 24 ساعة قبل عزل

1. إعداد الكولاجين coverslips المغلفة للثقافة MEEC.
   1. إعداد محلول حمض الخليك 0.02 M في الماء المقطر (1 مل لكل ساترة).
   2. إضافة 150 ميكرولتر من الكولاجين في 12 مل من 0.02 حمض الخليك M للحصول على تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل.
   3. إضافة coverslips العقيمة في لوحة 12-جيدا.
   4. إضافة 1 مل من محلول الكولاجين (انظر 3.1.2).
   5. احتضان O / N (الحد الأدنى 12 ساعة) عند 37 درجة مئوية.
      خلال العزلة:
   6. إزالة حل الكولاجين قبالة لل coverslips عن طريق الشفط والسماح لها الهواء الجاف في بيئة معقمة (في مجلس الوزراء تدفق الصفحي).
   7. غسل لل coverslips مرتين مع المالحة الفوسفات مخزنة (PBS).
2. يعد حل البنكرياتين 2.5٪ بإضافة 0.25 ز البنكرياتين في أنبوب الكنسي 15 مل تحتوي على 10 مل منHBSS +. تهز (200 دورة في الدقيقة) الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة إلى زيادة القابلية للذوبان. تخزينها في 4 درجات مئوية.

4. العزلة والثقافة من خلايا الفأر بطانة الرحم طلائي (MEEC) وماوس بطانة الرحم اللحمية خلايا (مسك)

1. إضافة 25 ملغ من التربسين في أنبوب 15 مل تحتوي على حل البنكرياتين 2.5٪ (انظر 3.2) في نهاية المطاف إلى حل نهائي يتضمن 0.25٪ التربسين (أشار أيضا إلى أنه مزيج الهضم مسك).
2. العزلة من رحم
   1. تحقق مرحلة دورة من الحيوانات مع فحص اللطاخة المهبلية.
      1. كبح جماح الحيوان ومسح المهبل بلطف مع 50 ميكرولتر PBS 3-5 مرات.
      2. جمع دافق النهائي على شريحة زجاجية.
      3. فحص المواد تحت المجهر مشرق الميدان باستخدام الهدف 10X أو 20X.
      4. فقط استخدام الفئران التي هي في مرحلة الشياع. وتتميز هذه المرحلة من وجود خلايا الظهارية متقرن في غسل المهبل (الشكل 1 ).
   2. الموت ببطء الحيوانات باستخدام الطريقة المناسبة مثل خلع عنق الرحم أو CO ₂ الخدر -induced.
   3. رش جثث مع 70٪ من الإيثانول من أجل توليد بيئة معقمة.
   4. استخدام الأدوات الجراحية المعقمة، وفتح البطن ودفع أمعاء جانبا لتصور كل من قرون الرحم.
   5. الاستيلاء على قرن الرحم في نهاية معظم القاصي تحت أنبوب فالوب. تشريح قرون الرحم من قناة فالوب وإزالة الدهنية والنسيج الضام. قطع قرن في النهاية البعيدة فوق جسم الرحم ووضعه في طبق بتري 35 ملم مع 3 مل من HBSS +.
      1. كرر هذه الخطوة لقرن آخر وللحيوانات أخرى حتى يتم جمع كل أبواق الرحم.
   6. تنظيف قرن الرحم (في HBSS +) مزيد من تحت المجسام، وإزالة جميع الدهنية المتبقية أو النسيج الضام.
   7. قطع قرون الرحم مفتوحة طوليا لفضح تجويف الرحم واستبدال عشره قرن في طبق بيتري جديد مع HBSS + الطازجة.
   8. نقل جميع قرون الرحم إلى أنبوب 15 مل تحتوي على البنكرياتين والتربسين.
   9. احتضان أفقيا لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية على شاكر المداري (50 دورة في الدقيقة).
   10. احتضان أفقيا لمدة 45 دقيقة في 23 ° C (RT)، دون أن تهتز.
   11. احتضان أفقيا لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية (حمام مائي)، دون أن تهتز.
   12. جعل وفي الوقت نفسه مزيج الهضم مسك عن طريق تذويب 300 ميكرولتر من 1 ملغ / مل الأسهم كولاجيناز في 2.7 مل من 0.05٪ من محلول حمض التربسين-Ethylenediaminetetraacetic (EDTA).
       ملاحظة: من الآن فصاعدا، يتم تنفيذ المزيد من الخطوات العزلة في بيئة معقمة في إطار مجلس الوزراء تدفق الصفحي.
3. الماوس بطانة الرحم الخلايا الظهارية (MEEC) الثقافة
   1. بعد 2 ساعة من الحضانة، صب بعناية بعيدا الحل طاف.
   2. نقل رحم في طبق بتري تحتوي على المتوسط ​​MEEC الباردة واحتضان لمدة 5 دقائق لتعطيل التربسيننشاط.
   3. نقل رحم لأنبوب 15 مل تحتوي على 3 مل من البرد HBSS +.
   4. دوامة لمدة 10 ثانية لاطلاق سراح الأوراق الظهارية.
   5. شطف رحم في طبق بيتري نظيفة مع 3 مل HBSS +.
   6. كرر الخطوة 4.3.2 - 4.3.4 للحصول على ما مجموعه ثلاثة الايقاف التي تحتوي على أوراق الظهارية.
   7. نقل رحم إلى مزيج الهضم مسك واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حين تهز (200 دورة في الدقيقة) (انتقل إلى الخطوة 4.4 لمزيد من العزلة لمسك).
   8. استرداد أوراق الظهارية بواسطة pipetting تعليق خلية ثلاثة بلطف على شبكة من النايلون 100 ميكرون لإزالة الحطام الأنسجة.
   9. الطرد المركزي تعليق الخلية التي تم جمعها في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
   10. Resuspend وبيليه في 12 مل من المتوسط ​​MEEC وتخلط جيدا.
   11. تسوية حل لمدة 5 دقائق وذلك لفصل المتبقية مسك باستخدام الجاذبية الترسيب.
   12. إزالة بعناية العليا 2 مل باستخدام ماصة 5 مل.
   13. الطرد المركزي suspensio خليةن في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
   14. resuspend في المتوسط ​​MEEC من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
   15. لوحة الخلايا coverslips على المغلفة الكولاجين في كثافة المطلوبة لمزيد من التجارب (الشكل 2A).
   16. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ حاضنة لمدة لا تقل عن 12 ساعة.
       ملاحظة: للحصول على المناعية أو التجارب الفنية مثل التصوير الكالسيوم الفلورسنت، وينصح لوحة الخلايا مباشرة على لل coverslips، بينما يوصى بذر في لوحة 6 جيدا عند الرغبة RNA أو البروتين العزلة. وينقسم عزل الماوس خلايا انسجة بطانة الرحم في جولتين حيث النقاء من الخلايا بعد الهضم واحد فقط يمكن أن تكون غير كافية. يتم هضمها في رحم مرتين لاستعادة خلية الأمثل والنقاء. في الجولتين التدخلات التقنية متطابقة. الخلايا التي تم جمعها من الجولتين يمكن أن تبقى لمزيد من التجارب، كما هو مطلوب من قبل الباحث.
4. الماوس بطانة الرحم شارعخلية العمال (مسك) الثقافة: 1 ^شارع جولة
   1. قبل بدء الجولة الأولى الهضم، وإعداد مزيج الهضم الثاني عن طريق تذويب 300 ميكرولتر من 1 ملغ / مل الأسهم كولاجيناز في 2.7 مل 0.05٪ حل التربسين-EDTA. هناك حاجة إلى هذا المزيج في خطوة 4.4.8.
   2. إعداد ثلاثة أطباق بتري صغيرة من البرد (4 درجات مئوية) HBSS + و 3 × 15 مل أنابيب مع 3 مل من مسك المتوسطة (أنبوب X1، X2 و X3).
   3. بعد 30 دقيقة من الحضانة، يهز الحل التربسين التي تحتوي على عنق بلطف لمدة 10 ثانية. وخلايا مسك فصل من أنسجة الرحم وستبقى في حل التربسين.
   4. نقل رحم إلى طبق بيتري الأولى تحتوي على 3 مل البرد (4 درجات مئوية) HBSS + وشطف جيدا.
   5. إضافة 3 مل من مسك المتوسطة إلى الأنبوب الذي يحتوي أصلا قرون الرحم (أنبوب في الخطوة 4.4.3) لكبح النشاط التربسين.
   6. نقل رحم من طبق بيتري مع الباردة (4 درجة مئوية) HBSS + لX1 أنبوب يحتوي على 3 مل من مسك المتوسطة ويهز بلطف لمدة 10 ثانية.
   7. كرر الخطوات من 4.4.4 (نقل إلى طبق بيتري مع الباردة (4 درجة مئوية) HBSS +) و4.4.6 (نقل إلى X2 أنبوب وX3) مرتين.
      ملاحظة: وأخيرا، فإن هذا البروتوكول يؤدي إلى 4 الايقاف الخلية: أنبوب واحد تحتوي على الحل التربسين و 3 أنابيب مع المتوسط ​​مسك تحتوي على مسك (أنابيب X1، X2 و X3).
   8. نقل رحم في الهضم مسك الجديد، كما هو موضح في الخطوة 4.4.1 واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وعموديا.
   9. جمع الخلايا اللحمية عن طريق تمرير تعليق خلية أربع من خلال شبكة من النايلون 40 ميكرون. شطف شبكة مع 5 مل إضافية من مسك.
   10. الطرد المركزي تعليق خلية في 500 x ج لمدة 7 دقائق.
   11. Resuspend وبيليه في مسك ولوحة coverslips على المغلفة PLL-لمزيد من التجارب مع الكثافة المطلوبة.
   12. احتضان لمدة لا تقل عن 4-6 ساعات أو O / N عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
5. الماوس بطانة الرحم اللحمية الخليوي (مسك) الثقافة: 2 ^{الثانية} جولة <رأ>
6. إعداد ثلاثة أطباق بتري صغيرة من البرد (4 درجات مئوية) HBSS + و 3 × 15 مل أنابيب مع 3 مل من مسك المتوسطة (أنابيب Y1، Y2 وY3).
7. كرر الخطوات من 4.4.3 - 4.4.7.
8. نقل آخر تعليق خلية جنبا إلى جنب مع عنق إلى شبكة من النايلون 40 ميكرون.
9. جمع الخلايا اللحمية عن طريق تمرير مضمون Y1 أنبوب، Y2 وY3 من خلال شبكة من النايلون. شطف شبكة مع 5 مل إضافية من مسك.
10. الطرد المركزي تعليق خلية في 500 x ج لمدة 7 دقائق.
11. Resuspend وبيليه في مسك المتوسطة ولوحة coverslips على المغلفة PLL-لمزيد من التجارب (الشكل 2B).
12. احتضان لمدة لا تقل عن 4-6 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
    ملاحظة: للحصول على المناعية أو التجارب الفنية مثل التصوير الكالسيوم الفلورسنت، وينصح لوحة الخلايا coverslips على، في حين أن البذر في لوحة 6 جيدا ينصح عند الرغبة RNA أو البروتين العزلة.

5. فيمنتين/ Cytokeratin تلطيخ مزدوجة للتأكد من صحة MEEC البحتة والثقافات مسك

1. البذور خلايا coverslips على.
2. غسل 3 × 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم على شاكر المداري (50 دورة في الدقيقة).
3. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) (تنبيه!) لمدة 10 دقيقة، وليس على شاكر.
4. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم والمغنيسيوم على شاكر (50 دورة في الدقيقة).
5. Permeabilize الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة على شاكر (50 دورة في الدقيقة).
6. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني على شاكر.
7. كتلة مع 5٪ مصل الماعز (ع) في برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة على شاكر (50 دورة في الدقيقة)
8. احتضان الخلايا مع وحيدة النسيلة أرنب فيمنتين مكافحة الإنسان (1: 500)، والماوس وحيدة النسيلة pancytokeratin مكافحة الإنسان (1: 1000) في 4 درجات مئوية على شاكر (50 دورة في الدقيقة). مخففة الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ GS.
9. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني على شاكر (50 دورة في الدقيقة).
10. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية (1: 1000 في 0.5٪ GS) اليكسا فلور 488 مترافق مفتش المضادة للأرنب واليكسا فلور 488 conjuمسور مفتش مكافحة فأر على شاكر.
11. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني على شاكر.
12. جبل الشرائح مع مائي المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي دابي ويا جاف / N.
13. ختم الشرائح مع طلاء الأظافر والحفاظ على 4 درجات مئوية لاستخدامها مرة أخرى (الشكل 2A، ب).

6. في المختبر Decidualization في نظام Coculture

ملاحظة: يطلب من أربعة إلى خمسة الحيوانات لإنشاء نظام coculture في 24 لوحة جيدا. تواصل مع بروتوكول التالية في بيئة معقمة، ويفضل أن يكون في إطار مجلس الوزراء تدفق الصفحي.

1. إعداد إدراج زراعة الخلايا خلال الطرد المركزي و / أو حضانة الخطوات من العزلة الخلايا الظهارية (كما هو موضح في 4.3) في 24 لوحة جيدا إضافية.
   1. إضافة 200-400 ميكرولتر من مسك المتوسطة إلى المبلغ المطلوب من الآبار في 24 لوحة جيدا.
   2. وضع تدرج في المعبأة مسبقا 24 بئرا باستخدام ملقط معقم.
2. resuspend الكرية MEEC(حجم العمل: 150-300 ميكرولتر في إدراج) (الخطوة 4.3.14) في المتوسط ​​MEEC والانقسام على إدراج. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
3. البذور الخلايا اللحمية في 24 لوحة جيدا آخر (متوافقة مع إدراج ثقافة الخلية) بعد الجولة الثانية من العزلة الخلايا اللحمية (الخطوة 4.5.6). استخدام حجم العمل من 400 ميكرولتر تعليق خلية لكل بئر.
4. السماح للخلايا انسجة إرفاق عن الحد الأدنى من 4-6 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
5. نقل إدراج ثقافة الخلية مغطاة الخلايا الظهارية من أول 24 لوحة جيدا في الثانية 24 لوحة جيدا من قبل خلايا انسجة تغطيتها. استخدام ملقط معقم أو لمس إدراج فقط في القدم اعدامهما.
6. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة لمدة 3-5 د حتى الخلايا الظهارية شكل أحادي الطبقة وخلايا انسجة تحقيق 80-90٪ confluency. بالإضافة إلى ذلك، استخدام المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير)لمراقبة أحادي الطبقة الظهارية عن طريق استخدام متر الظهارية فولت / أوم كما وصفه غرانت وآخرون. ^7. وكانت قيم 800-1،000 / جيد كافية للنظر في متموجة أحادي الطبقة الظهارية.
7. إذا لزم الأمر، استبدل المتوسطة كل 2-3 د باستخدام ماصات زجاجية أو نصائح الماصة الجميلة. نبدأ مع استبدال المتوسطة من الخلايا اللحمية (المصنف في الأسفل)، قبل استبدال المتوسطة في إدراج. فمن المستحسن استخدام مسخن خلية ثقافة المتوسط ​​عند 37 درجة مئوية.
8. إعداد المتوسطة decidualization للحث في decidualization المختبر قبل بدء التجربة. استخدام حجم العمل من 400 ميكرولتر لكل بئر من خلايا انسجة.
   1. إعداد الحلول الأوراق المالية التالية وقسامات مخزن في -20 درجة مئوية.
      1. إعداد 250 ميكرومتر ميدروكسي 17-خلات (MPA) في الإيثانول.
      2. إعداد 100 ملي حل الأوراق المالية 8 Bromoadenosine 3 "، 5'- المخيم في الماء عالى النقاء.
   2. جعل المتوسطة ساقطي تحتوي على MPA 1 ميكرومتر و 0.5 ملي المخيم في وسط مسك تحتوي على 2٪ FBS.
9. إزالة بلطف المتوسطة من الآبار وإضافة المتوسطة ساقطي على الخلايا اللحمية. إذا كانت هناك حاجة لحالة السيطرة، واستخدام وسيلة مسك تحتوي على 2٪ FBS.
10. إزالة المتوسطة من إدراج زراعة الخلايا وإضافة 300 ميكرولتر من المتوسطة MEEC على الخلايا.
11. احتضان الخلايا لمدة 5 د في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.
12. بعد اليوم الخامس، وتقييم مدى decidualization في الخلايا اللحمية التي كتبها RT-QPCR (أنظر أدناه).
13. التحقق من سلامة الخلايا الظهارية باستخدام كاشف الجدوى استنادا ريسازورين.
    1. يعد حل 01:10 من كاشف الجدوى في المتوسط ​​MEEC.
    2. نقل إدراج ثقافة خلية في 24 لوحة جيدا جديدة.
    3. إضافة 150-300 ميكرولتر من كاشف جدوى - حل MEEC على الخلايا.
    4. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ لفيأقل 4-5 ساعة أو بين عشية وضحاها وتقييم قابلية الخلية من خلال مراقبة تحول اللون (الأزرق إلى الأرجواني / الوردي).
       ملاحظة: يمكن أيضا Decidualization يتم تقييمها باستخدام ELISA الماوس البرولاكتين محددة، كما يفضل من قبل الباحث.

7.Validation من Decidualization التي كتبها QRT-PCR

ملاحظة: للحصول على المصادقة على decidualization التي كتبها QRT-PCR، فمن المستحسن لأداء جميع ظروف الاختبار في نسختين من أجل الحصول على كمية كافية من الخلايا لتحليل الحمض النووي الريبي.
يتم تنفيذ الكمي RT-PCR كما هو موضح سابقا في دي كليرك وآخرون. ^8.
باختصار:

1. عزل الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مجموعة RNA العزلة التجارية.
   1. تقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي باستخدام الأساليب التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، على التوالي.
2. توليف [كدنا]، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة بدءا من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع.
3. استخدام عدة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لتنفيذ رد فعل QRT-PCR.
   1. تشغيل جميع العينات في ثلاث نسخ.
   2. الاستفادة من التجاري TAQMAN ميكس ماستر وتحقيقات TAQMAN محددة لالجينات التدبير المنزلي المطلوب والبرولاكتين (prl8a2) لتنفيذ رد فعل.

النتائج

لمحة عامة عن بروتوكول

ويوضح الشكل 1A لمحة عامة عن البروتوكول. تم استخدام حقن يومية من E2 (100 نانوغرام) لمدة ثلاثة أيام متتالية لمزامنة الحيوانات وتوحيد مرحلة من مراحل دورة داقية. دورة داقية يمكن تقييم من قبل lavages المهبلية، وينقسم إلى مقدمات الوداق، شبق، هجوع الودق، ومرحلة تلية الوداق. يمكن أن يتم تعيين مرحلة دورة وفقا لنسبة من خلايا بشرية في غسيل، التي تخضع لتغيرات هرمونية. وزيادة مستويات هرمون الاستروجين جعل الحيوانات تتطور إلى مرحلة الشبق. يمكن بسهولة الكشف عن هذه المرحلة من وجود خلايا الظهارية متقرن حصرا وعدم وجود الكريات البيض (الشكل 1B). في يوم 4، رحم من الحيوانات التي هي في مرحلة الشياع يتم جمع وMEEC ومسك معزولة (الشكل 1C). Decidualization جليكون ذلك حافزا بإضافة 0.5 ملي المخيم و1 ميكرومتر MPA إلى 2٪ FBS المتوسطة خلال فترة الحضانة من 5 د.

مراقبة نوعية MEEC ومسك الثقافات

نقاء الثقافات الخلية الأولية يمكن تقييمها من قبل الفرق في فيمنتين وcytokeratin التعبير. فيمنتين غير لخيوط المتوسطة التي يعبر عنها في خلايا اللحمة المتوسطة، وبالتالي في الخلايا اللحمية بطانة الرحم. Cytokeratin هو خيوط وسيطة وجدت في الهيكل الخلوي من الأنسجة الطلائية. ويبين الشكل 2A مستوى التعبير مرنا من فيمنتين وcytokeratin في MEEC ومسك تقييم استخدام QRT-PCR. مستويات فيمنتين على نسبة عالية من مسك وانخفاض في MEEC (2.2x العالي، ف <0.001)، في حين أن مستويات cytokeratin مرتفعة في MEEC وانخفاض في مسك (36X العالي، ف <0.001). أجري فيمنتين / تلطيخ مزدوج cytokeratin وأشار إلى أن الخلايا اللحمية تعبر عن فيمنتين في حين epitخلايا helial تعبر عن cytokeratin (الشكل 2B، C). وقد استخدم غياب الأجسام المضادة الأولية كوسيلة لمراقبة سلبية على المناعية (الشكل 2D، E). تظهر هذه stainings immunohistological أن كلا من مزارع الخلايا بطانة الرحم (MEEC ومسك) لديها نقاء تصل إلى 90٪.

Decidualization في MEEC / مسك Cocultures

بعد العزلة، والمصنف خلايا بطانة الرحم الماوس واللحمية في نظام الثقافة المشتركة لمحاكاة بيئة الرحم. وكانت الخلايا المستزرعة حتى شكلت خلايا الظهارية أحادي الطبقة في إدراج الثقافة الخلية (قيم طير من 800 - 1000 / جيد)، وصلت إلى خلايا انسجة دولة شبه متموجة. وكان المستحث Decidualization في الخلايا اللحمية مع تطبيق 0.5 ملي المخيم و1 ميكرومتر MPA. بعد خمسة أيام من الحضانة، تم تقييم مستويات مرنا البرولاكتين في الخلايا اللحمية التي كتبها QRT-PCR مؤشرا لdecidualization (الشكل 3A). وأعرب عن مستويات البرولاكتين العالية في الخلايا تتعرض للهرمونات وnondetectable في الخلايا المحتضنة مع وسيلة التحكم (P <0.01).

منذ الخلايا الظهارية من الصعب تصور داخل إدراج ثقافة الخلية، تم إجراء فحص قابلية على الفور بعد فترة الحضانة لمدة خمسة أيام (الشكل 3B). تمت إضافة مزيج من متوسط ​​النمو الطبيعي وكاشف الجدوى إلى الآبار وحضنت لمدة الحد الأدنى من 8-12 ساعة. وأشار التحول من اللون الأزرق إلى اللون الوردي مشرق وجود خلايا الظهارية قابلة للحياة. لاحظ أن تحول لون سوف تحدث فقط عند وجود خلايا قابلة للحياة.

الشكل 1: نظرة شاملة من البروتوكول. (أ) مخطط للبروتوكول العزلة بدأت مع ثلاثةأيام متتالية من حقن هرمون الاستروجين. في يوم 3، وينبغي إعداد التحضيرات اللازمة. في يوم 4، يتم تقييم مرحلة الشبق (المشار إليها نجوم) عن طريق إجراء غسيل المهبل. مسك وMEEC يتم عزل باستخدام الخطوات الهضم مختلفة. في يوم 6، أو عندما الخلايا هي متكدسة، decidualization يمكن أن يتسبب في نظام المشاركة في الثقافة بإضافة المخيم والمناطق البحرية المحمية إلى المتوسطة وفترة الحضانة من خمسة أيام (يوم 6-11). (ب) الصورة التمثيلية للمرحلة الشياع تتميز بوجود خلايا الظهارية متقرن في غسل المهبل (التكبير 10X). (C) الصورة التمثيلية للمسك وMEEC (التكبير 20X، شريط مقياس: 100 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ز> الشكل 2: المناعية والكمي RT-PCR لفيمنتين وCytokeratin في MEEC ومسك. (أ) مستويات رسول الحمض النووي الريبي فيمنتين وcytokeratin التعبير للدلالة على نقاء الثقافات. وتم قياس كمية الحمض النووي الريبي مستويات نسبيا في الوسط الهندسي من الجينات التدبير المنزلي ACTB وTBP. وقد أظهرت البيانات كما يعني ± SEM. فيمنتين / تلطيخ مزدوج cytokeratin على الثقافات مسك (ب) والثقافات MEEC (C). إدراج في الجهة اليسرى يظهر عرض التكبير 63X. السيطرة السلبية مع الأجسام المضادة الأولية حذفت لمسك (D) وMEEC (E) (مقياس شريط: 50 ميكرومتر). ***: P <0.001 مع اتجاهين أنوفا مع تصحيح بونفيروني لاختبار متعددة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

EP-together.within الصفحات = "1">
الرقم 3: التحقق من Decidualization عبر RT-PCR. مستويات (A) مرنا التعبير للبرولاكتين في خلايا انسجة لتقييم decidualization. وتم قياس كمية الحمض النووي الريبي مستويات نسبيا في الوسط الهندسي من الجينات التدبير المنزلي PGK1 وTBP. ويظهر التغير أضعاف في الخلايا المستزرعة في السيطرة أو المتوسطة ساقطي كما يعني ± SEM. (ب) صور توضيحية للخلايا انسجة قبل (أعلى) وبعد (القاع) التحفيز decidualization. إدراج على اليمين يوضح التكبير من خلية انسجة decidualized. يتميز Decidualization عن وجود خلايا متعددة النوى، وأشار السهام السوداء. (C) صور الممثل لتقييم قابلية الخلايا الظهارية في إدراج بعد الفحص. وتم التقاط الصور على الفور بعد إدارة كاشف الجدوى (Prestoblue) (0 ح) ووصباح ollowing (ON). **: ف <0.01 مع اختبار مان ويتني U. ON: بين عشية وضحاها. شريط مقياس: 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

Decidualization هو التمايز التي تعتمد على هرمون البروجسترون من خلايا انسجة بطانة الرحم إلى خلايا الساقطية إفراز الجولة. في الإنسان، هذه العملية تحدث بشكل عفوي خلال مرحلة الجسم الأصفر من الدورة الشهرية، وبدأت في الخلايا اللحمية المحيطة خلايا الأوعية الدموية لتشكيل predecidua. ومع ذلك، في القوارض، وجود الكيسة لا بد للحث على decidualization. حقيقة أن decidualization يحدث إلا بعد الاتصال مع الخلايا الظهارية بطانة الرحم يعني أن هناك عوامل مهمة تفرز من خلايا الظهارية للحث على decidualization في سدى الكامنة. وعلى الرغم من هذا الاختلاف في بدء عملية decidualization ينبغي الاعتراف، والحقيقة أن decidualization الإنسان يصبح أكثر قوة على زرع الأجنة تشير إلى أن آليات مماثلة يمكن أن تشارك. في المختبر غالبا ما تستخدم مزارع الخلايا لدراسة تأثير جزيئات محددة خلال عملية decidualization.ومع ذلك، فإن توافر وكمية من الأنسجة البشرية التي يمكن جمعها وغالبا ما يقتصر ويرافقه الاختلافات، وعلى سبيل المثال، مرحلة دورة، وعدد حالات الحمل وجود أمراض النساء مثل التهاب بطانة الرحم أو غدي. العديد من هذه القضايا يمكن الوقاية منها عن طريق استخدام أنسجة الفئران التي يمكن الوصول إليها بسهولة ومرحلة دورة مستقلة. ميزة أخرى قوية من استخدام أنسجة الفئران هي الفرصة لاستخدام القوارض المعدلة وراثيا وإمكانية إعداد عدد كبير من التجارب. في هذه اللحظة، وقد وصفت العديد من البروتوكولات العزلة مختلفة في الأدب مع تفاوت الكبير في السن من الحيوانات وفترة في مرحلة الشياع في لحظة الاستخدام.

تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لبطانة الرحم المشترك الثقافات الأولية للانسجة والخلايا الظهارية التي تم اتخاذها الاستفادة من دورة داقية موحدة من قبل حقن يومية من هرمون الاستروجين قبل العزلة. وعلاوة على ذلك، هرمون الاستروجين هو كnown للحث على الانتشار في الخلايا الظهارية وانسجة الخلايا مما يزيد العائد في العزلة. واستند بروتوكول العزلة وصفها في هذه الورقة على غرانت وآخرون. ^7، ومع ذلك، تم إدراج المزيد من الخطوات الأمثل لزيادة الغلة، والنقاء، والجدوى من ثقافات مختلفة من الخلايا. أولا، كان HBSS تستكمل دائما مع المضادات الحيوية لتجنب التلوث من ثقافة الأولية. خلال عزل MEEC، تم إجراء التكيف درجة حرارة (15 دقيقة عند 37 درجة مئوية) لزيادة حصاد الخلايا الظهارية أثناء عملية الهضم الأول. بعد ذلك، أدرج خطوة إضافية لتهدئة النشاط الأنزيمي بعد التربسين الهضم عن طريق إضافة المتوسطة التي تحتوي على FBS لكبح نشاطها. وعلاوة على ذلك، صدرت MEECs من خلال مرشح والذي كانت شبكة أكبر مما هو شائع وصفها (100 ميكرون) لأنها غالبا ما تأتي في مجموعات وأوراق الخلية. وعلاوة على ذلك، تم تخفيض التلوث من قبل خلايا انسجة عن طريق أداء الوظيفةخطوة itional التي تم فصلها استنادا MEECs وMESCs على الترسيب الجاذبية. وأخيرا، تم المصنف MEECs coverslips على المغلفة الكولاجين لزيادة المرفق من الخلايا لcoverslips الزجاج، كما أصبح واضحا أن التعلق coverslips الزجاج غير المصقول أو المطلي PLL-لم يكن كافيا. خلال عزل MESCs، واستكملت كولاجيناز (1 ملغ / مل) لتحسين الهضم. وعلاوة على ذلك، تم تنفيذ هذه الخطوة الهضم في مكررة لتجنب التلوث من MEECs المتبقية. أدت كل هذه خطوات إضافية في ثقافات نقية وقابلة للحياة السكان خلية متجانسة.

تم تقييم نقاء سكان الخلية مع المناعية وQRT-PCR تستخدم فيمنتين كعلامة انسجة وcytokeratin باعتباره علامة الظهارية. بشكل واضح، وقد لوحظ نمط التعبير الآخر من فيمنتين وcytokeratin في MEEC ومسك. ومع ذلك، فإنه يمكن أن يكون لاحظت أن التعبير مرنا نسبيا من فيمنتين وcytokeratin مشابه في الثقافات MEEC. Similيتم نشر النتائج ع من قبل مجموعات بحثية أخرى، حيث تنمو الخلايا الظهارية في الثقافة اكتساب فيمنتين التعبير ^9. الأهم من ذلك هو الاختلاف في التعبير البروتين بين فيمنتين وcytokeratin كما لوحظ في stainings immunohistological من السكان مختلفة من الخلايا. أظهر المناعية المزدوج الذي EECS كانت إيجابية للcytokeratin وكانت ESC إيجابية لفيمنتين. استخدام هذه العلامات في المناعية هو وسيلة ثابتة وتستخدم standardly للإشارة إلى أنواع الخلايا ^10.

على الرغم من أن الكثير من الأبحاث قد أجريت على decidualization من مسك، فإنه لا يزال من الممكن أن وجود الخلايا الظهارية في هذا النموذج قد يغير من نتائج decidualization. أولا، وقد تبين أنه إذا MEEC تنمو إلى أحادي الطبقة بحضور المتوسطة مكيفة مسك أو في إعداد ثقافة مشتركة، أحادي الطبقة لديها مقاومة كهربائية تحسين الظهارية الخلايا بطريق الظهارة (طير)، والناجمة عن العوامل التي يفرزها مسك ^7. وعلاوة على ذلك، بييرو وآخرون. ¹¹ تقدم أي دليل على انتشار الظهارية، وتتأثر 17β استراديول، قد بوساطة العوامل يفرز من خلايا انسجة، وبدلا من ذلك، يمكن للخلايا الظهارية الافراج عن العوامل التي تعدل انسجة decidualization ^{12 و 13.} وعموما، فمن الواضح أن البيئة المشارك ثقافة الظهارية انسجة توفر وضعا أكثر الفسيولوجية التي تسمح للتفاعل نظير الصماوي والاتصالات. وقد وصفت طريقة زراعة اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا باستخدام نظام المشاركة في ثقافة إدراج سابق ^{14 و 15} و تم تكييفها للاستخدام الخلايا الأولية الفئران. من خلال الكشف عن مستويات البرولاكتين مرنا باعتباره من قراءة لdecidualization، تقنية الموضحة لديها استنساخه جدا للقراءة خارج لdecidualization المتاحة والسماح للليالي بالتالي دراسة للعلاقة بين الظهارية انسجة خلال decidualization. إشارات نظير الصماوي بوساطة من MEEC قد يغير مدى decidualization في خلايا انسجة. وعلاوة على ذلك، فإن النموذج يسمح لتعديل معين من الجانب الظهارية دون أن يؤثر بشكل مباشر على خلايا انسجة. لذلك، هذا التعاون ثقافة MEEC ومسك تقدم أداة مثالية لتقييم تأثير الهرمونات، السيتوكينات، وما إلى ذلك على الخلايا الظهارية مع التدريجي على قراءة decidualization اللحمية. ميزة أخرى لهذا النظام المشترك الثقافة هو أنه يسمح للباحثين للتحقيق في تورط بروتين معين في العملية decidualization سواء في الظهارية أو مقصورة انسجة باستخدام الخلايا المعزولة من الحيوانات المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، فإن هذه التقنية أن تكون مفيدة جدا للتحقيق في الكيسة التصاق لتقييم ما إذا كانت العوامل نظير الصماوي يفرز من قبل خلايا الظهارية في وجود الكيسة كافية للحث على decidualization من انسجة الكامنةالخلايا. خطوة هامة في غزو الأرومة الغاذية ربطها تدهور المصفوفة خارج الخلية، التي تتوسط فيها عمل الإنزيمات المحللة للبروتين. التقنية المقترحة يمكن تطبيقها كنموذج في المختبر للتحقيق في الحديث عبر بين الكيسة، والخلايا الظهارية وسدى الداعمة.

ومع ذلك، في هذه اللحظة لا يعرف إلا القليل عن أصل الخلايا الظهارية التي يمكن أن تكون اللمعية كذلك غدي. لذلك، هناك حاجة إلى مزيد توصيف الصورة الجينية والجزيئية للخلايا الظهارية. وبالإضافة إلى ذلك، يقتصر الطريقة الموصوفة في المعرفة المتاحة عن الاستقطاب من الخلايا الظهارية. في هذه اللحظة، لم تؤخذ استقطاب الخلايا الظهارية في الاعتبار. ومع ذلك، يتم وصف الاختلافات في التعبير عن بروتينات الغشاء في الأغشية القمية والقاعدية. الاستقطاب غير المناسب للطبقة الطلائية يمكن أن يكون لها تأثير على التفاعل نظير الصماوي بين epitheliالقاعدة والخلايا اللحمية. ومع ذلك، طرق للحصول على الخلايا الظهارية الاستقطاب وصفت ويمكن إدراجها في تقنية وصفها ^{15 و 16.}

وإجمالا، يقترح بروتوكول صفها تقنية لإنشاء مزارع الخلايا الأولية من الماوس طلائي بطانة الرحم وخلايا انسجة بنجاح. نتائج هذا الأسلوب في مزارع الخلايا نقية كما أكد QRT-PCR والمناعية من فيمنتين وcytokeratin. في النهاية تم عرض الظهارية وانسجة الثقافة المشتركة التي تسمح للتحقيق في إشارات نظير الصماوي بوساطة إما MEEC و / أو مسك في عملية decidualization.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant	Greiner Bio-one	662610	Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/
Nunc Cell culture treated 24 well plates	Thermo Scientific	142475	http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma Aldrich	B7880	Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE
Medroxyprogesterone 17-acetate	Sigma Aldrich	M1629	Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE
Arachis oil	Supermarket		Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used
PrestoBlue cell viability reagent	Thermo Scientific	A13261	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175-046	Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046
17-β Estradiol	Sigma Aldrich	E8875	Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&region=BE
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized	Merck Millipore	SCGPU05RE	http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070-063	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063
DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES	Gibco	11330-032	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin	Gibco	10500-056	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064
Amphotericin B	Gibco	15290-018	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750-037	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Sigma Aldrich	D5921	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE
MCDB-105	Sigma Aldrich	M6395	Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE
Insulin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	I1882	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE
Coverslips, glass, 18 mm Ø	Glaswarenfabrik Karl Hecht	1001/18	http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 &tx_rmproducts_pi1[p]=3504 &tx_rmproducts_pi1[v]=20088 &cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P2636	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE
Collagenase type IA from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C2674	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-094	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094
Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	T7409	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300-054	Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable	BD Falcon	352340	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Cell strainer, 100 µm mesh, disposable	BD Falcon	352360	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized	Merck Millipore	SLGP033RS	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1
Acetic acid (glacial) 100%	Merck Millipore	1.00063	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063
Collagen I	Corning	354236	From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29#
Pancreatin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	P3292	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE
35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile	BD Falcon	353001	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630
Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent	VWR Chemicals	20821296	https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP
monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)	Cell Signalling Tech	#5741	Use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741
monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin	Sigma Aldrich	C2562	Use 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&region=BE
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	Affymetrix	19943	http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-11034	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor®%20488\%22$;;
Goat anti-mouse Alexa Fluor 594	Thermo Scientific	A-11032	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;
VECTASHIELD mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html
DPBS, with calcium and magnesium	Gibco	14040174	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133