Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu çalışma, in vitro desidualizasyon çalışma için Coculture sisteminde kullanılabilen birincil fare, endometriyal stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu ve kültürü, bir standart ve geçerli bir yöntem sunulur.
Sidualizasyonu endometrial stromal hücrelerin bir progesteron bağımlı farklılaşma süreci ve başarılı embriyo implantasyonu için bir ön koşuldur. pek çok çaba desidualizasyon mekanizmasının ortaya çıkarmak için yapılmış olsa da, embriyo ve altta yatan stromal hücreler ile temas halinde olan epitel hücreleri arasındaki kesin sinyal henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, desidualizasyon moleküler ayrıntıları hakkında bilgilerimizi getirebileceği dikkate epitelyal ve stromal hücreler hem götüren bir şekilde sidualizasyonu okuyan. Bu amaç için, suni desidualizasyon in vivo modellerde fizyolojik en alakalı; Bununla birlikte, hücreler arası iletişim manipülasyonu ile sınırlıdır. Şu anda, endometriyal stromal hücrelerin in vitro kültürler birçok sinyal molekülleri tarafından desidualizasyon modülasyonunu araştırmak için kullanılmaktadır. Geleneksel olarak, insan ya da fare endometriyal stromal hücreleriKullanılmış. Bununla birlikte, insan rezervden sıklıkla sınırlıdır. Bundan başka, fare dokularının kullanımı kültür yönteminde çeşitli eşlik etmektedir. Bu çalışma, saf Endometrial Epitel Hücre (AET) ve üç gün boyunca östrojen uygulanan erişkin sağlam fareler kullanılarak Stromal Cell (ESC) kültürleri elde etmek için valide ve standart bir yöntem sunar. protokol hücrelerinin verimi, canlılığı ve saflık geliştirmek için optimize edilmiştir ve daha AET ve ESC bir kokültürü içinde sidualizasyonu incelemek amacıyla genişletilmiştir. Bu model, desidualizasyon her iki hücre tipinde önemini yararlanma ve hücreler arası iletişim sırasında EEC veya ESC tarafından salgılanan önemli bir sinyal molekülleri katkısını değerlendirmek için uygun olabilir.
İnsan endometrium rahim iç astar ve olası gebelik için hazırlık olarak arıza ve onarım aylık döngülerini uğrar. Uterus lümeni ve yumurtalık hormonları östrojen ve progesteron dalgalanmalara bağlı olarak yoğunluğu değişir yatan stroma epitelyal hücrelerin tek bir katmandan oluşur. Luteal faz sırasında, postovulatuvar progesteron dalgalanma büyük, yuvarlak desidual hücrelere endometriyal stromal hücrelerin farklılaşması, sidualizasyonu 1, 2 olarak adlandırılan bir süreç neden olacaktır. İnsanlarda, bu olgu predecidua oluşturulması için kendiliğinden ortaya çıkar, fakat embriyo implantasyonu sırasında daha belirgin hale gelir. desidualizasyon bir fonksiyonel sonucu uterus geçici embriyo implantasyonu için alıcı hale gelmesidir. Bu aralık 'implantasyon penceresi' olarak etiketlenmiş. Embriyo implantasyonu erken dönemde, decidualized e sırasındaimplante embriyoyu çevreleyen ndometrial stromal hücreler embriyo 3 zararlı maddelerin geçişini önlemek için bir bariyer sağlar. Hamilelik sırasında, bu desidua plasenta yerini almıştır önce gelişmekte olan fetus için besin sağlayacak ve daha sonra plasenta 4 maternal bölümünü oluşturacaktır.
Etik ve pratik düşünceler desidualizasyonda sürecini araştırmak için insan çalışmaların tasarımı sınırlamak ve hayvan modellerinde kullanımını teşvik etmiştir. Hemochorial plasentasyon grubunun bir üyesi olmak, kemirgenler endometriyum da plasenta 5 önceki sidualizasyonu uğrayacaktır. Kemirgenlerde, ancak, desidualizasyon sürecinin başlatılması ilave uyaran desidual yanıt 6 tetiklemek için gerekli olduğunu gösteren, rahim lümeninde blastosist varlığına bağlıdır. Bu tarihleri arasında karmaşık bir iletişim imae blastosist ile doğrudan temas endometrial epitel hücreleri ve altta yatan stromal hücreler. Bununla birlikte, desidualizasyon yapay mekanik çizilme veya hormonal hazırlanmamış bir uterusa yağ damlatma gibi bir uyarıcıya kullanılarak indüklenebilir. Yapay sidualizasyonu modelleri kullanarak in vivo çalışmalar, örneğin desidualizasyon karmaşık sinyal sürecinde, mekanik derinlemesine çalışmalar, bizim bakış açısı geliştirmek için bize izin olmasına rağmen, epitelyal ve stromal hücreleri arasındaki vazgeçilmez iletişim soruşturma sınırlıdır. Bu nedenle, in vitro sidualizasyonu çalışmaları önemli yollar işlemek ve temel süreçleri incelemek için kullanılabilir. Bu amaçla, endometrium stromal hücre kültürleri, insan ya da kemirgen endometrium kadar ayarlanabilir. kemirgenler istihdam desidualizasyon sürecinde ilgi belirli bir proteinin rolünü araştırmak için genetik olarak değiştirilmiş hayvanların kullanımını rıza. Bununla birlikte, olgunlaşmamış prepuberty farenin genellikle diğer durumlarda rahimler kültürlerinde bir heterojen sonuçlanan östrus döngüsü, tüm aşamaları da toplama, östrus döngüsü komplikasyonları önlemek için kullanılır. Ayrıca, desidualizasyon bir işlem kültür ortamına (I) 'e ilave hormon (östrojen, progesteron ya da siklik adenosin monofosfat (cAMP)) farklı protokoller, örneğin, çalışılmıştır veya edilmiş farelerden desidual hücreler, (ii) izole en göre fiş denetimi ve Vasektomi erkeklerde ek ihtiyaç duyarlar (sözde) gebelik, gün 4.5. Bu sınırlamalar in vitro desidualizasyonda incelemek için standart bir yöntemin gerekliliğini göstermektedir. Bu çalışmada, fizyolojik bir model yetişkin başlayarak, in vitro sidualizasyonu incelemek olmayan (sözde) hamile fareler sunulacak. Bu yöntemde, 17β-estradiol (E2) günlük enjeksiyonu homojen ve p artmış bir verimle elde endometriyal hücrelerin proliferasyonunu neden olacaktırure hücre popülasyonları. Ayrıca, bir coculturing sisteminin kullanımı epitel-stromal karışma ve farklı düzeylerde desidualizasyon sürecini manipüle etme yeteneği çalışma sağlar.
AlexaFluor
Bu çalışma için tüm hayvan deneyleri KU Leuven (Belçika) (/ 2013 Proje P174) etik inceleme komitesi tarafından kabul edildi. Fareler gıda pelet ad libitum erişimine sahip, standart koşullar altında muhafaza ve musluk suyu ve kontrollü koşullar (23 ± 1.5 ° C, bağıl nem% 40 - 60, 12/12 aydınlık / karanlık döngüsü) altında tutuldu.
1. Fare
2. hazırlıklar
24 saat İzolasyon önce Gerekli 3. Hazırlıklar
4. İzolasyon ve Fare endometrial epitel hücreleri Kültür (MEEC) ve Fare Endometrial Stromal hücreler (MESC)
5. Vimentin/ Saf MEEC ve MESC Kültürlerin Doğrulama için Sitokeratin Çift Boyama
Bir Coculture Sistemde Vitro desidualizasyonda 6.
Not: Dört ila beş hayvandan, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, bir Coculture sistemi kurmak için gereklidir. tercihen bir laminer akış kabini altında steril bir ortamda aşağıdaki protokol ile devam edin.
Mah-PCR ile sidualizasyonu ve 7.Validation
Not: QRT-PCR ile desidualizasyon geçerli olabilmesi için, bu RNA analizi için bir hücre yeterli miktarda almak için iki kez tüm test koşulları gerçekleştirmek tavsiye edilir.
De Clercq ve arkadaşları, daha önce tarif edildiği gibi kantitatif RT-PCR gerçekleştirilir. 8.
Kısaca:
Protokolün Genel Bakış
Şekil 1A protokolünün genel bir bakış göstermektedir. arka arkaya üç gün boyunca E2 (100 ng) bir günlük enjeksiyonu hayvanları senkronize etmek ve östrus döngüsü faz standardize etmek için kullanıldı. estrojen döngüsü vajinal lavaj ile değerlendirilebilir ve Proestrus, östrus, diöstrusun ve ostrus faz ayrılmıştır. döngüsü faz hormonal değişikliklere maruz lavaj dökülmüş hücrelerin oranına göre ifade edilebilir. östrojen düzeyleri artan hayvanlar kızışma faza gelişmeye yapacaktır. Bu aşama, kolayca özel olarak açığa çıkan epitel hücrelerinin varlığı ve lökositlerin yokluğunda (Şekil 1B) ile tespit edilebilir. 4. günde, östrus fazda hayvanların rahim toplanır ve MEEC ve MESC (Şekil 1C) izole edilir. desidualizasyon cBir 5 gün bir inkübasyon süresi boyunca 0.5 mM cAMP ve% 2 FBS ortamına 1 uM MPA eklenerek uyarılabilmektedir.
MEEC ve MESC Kültürlerinin Kalite Kontrol
Birincil hücre kültürlerinin saflığı vimentin ve sitokeratin ifade farkı ile değerlendirilebilir. Vimentin dolayısıyla endometriyal stromal hücrelerde, mezenşim hücrelerinde eksprese edilen bir ara madde filamenttir. Sitokeratin epitel doku hücre iskeleti içinde bulunan bir ara filamenttir. Şekil 2A MEEC ve Mesc vimentin ve sitokeratin mRNA ekspresyon seviyesi QRT-PCR kullanılarak değerlendirildi gösterir. Vimentin seviyeleri MEEC içinde Mesc yüksek ve düşük (yüksek 2.2X, p <0.001), sitokeratin düzeyleri Mesc içinde MEEC yüksek ve düşük iken (36x yüksek, p <0.001). Bir vimentin / sitokeratin çift boyama yapılmıştır ve stromal hücreler epit oysa vimentin ifade belirtilmiştirHelial hücreleri (Şekil 2B, C), sitokeratin ifade eder. Primer antikorun yokluğunda immün (Şekil 2D, E) için negatif bir kontrol olarak kullanıldı. Bu immünohistolojik renklendirmeler hem endometriyal hücre kültürleri (MEEC ve MESC)% 90 kadar bir saflığa sahip olduğunu göstermektedir.
MEEC / MESC cocultures sidualizasyonu
İzolasyondan sonra, fare endometriyal stromal hücreleri endometriyal ortamı taklit etmek için bir ko-kültür sisteminde tohumlandı. Ve stromal hücreler bir alt konfluent devlet ulaştı - epitel hücreleri (/ kuyu 1.000 800 TEER değerlerini) hücre kültür insert içinde bir tek tabaka oluşuncaya kadar hücreler kültüre edildi. Sidualizasyonu 0.5 mM cAMP uygulama ve 1 uM MPA ile stromal hücrelerinde olduğu görüldü. İnkübasyondan beş gün sonra, prolaktin mRNA düzeyleri yaprak döken bir gösterge olarak QRT-PCR ile stromal hücrelerde değerlendirildiualization (Şekil 3A). Prolaktin seviyeleri yüksek hücre kontrol ortamı (p <0.01) ile inkübe edilen hücrelerde hormon tabi tutulur ve tespit edilemeyen olarak ifade edildi.
Epitel hücreleri, hücre kültürü ekler içinde görselleştirmek için sabit olduğu için, bir canlılığı deneyi beş günlük kuluçka süresi (Şekil 3B) hemen sonra uygulandı. normal büyüme ortamı ve bir canlılık reaktif bir karışımı oyuklarına ilave edildi ve en az 8 bir süre için kuluçkalanmıştır - 12 saat. parlak pembe mavi renk kayması epitel hücrelerinin mevcudiyetine işaret etmiştir. canlı hücreler mevcut olduğunda renk kayması yalnızca ortaya çıkar unutmayın.
Şekil 1: Protokol Genel Bakış. (A), yalıtım protokol Şema üç ile başlayanÖstrojen enjeksiyonları ardışık gün. 3. günde, gerekli hazırlıklar hazırlanmalıdır. 4. günde, kızgınlık faz vajinal lavaj yapılarak (yıldız ile gösterilir) değerlendirilir. MESC ve MEEC farklı sindirim adımları kullanarak izole edilmiştir. Hücreler birleştiklerinde, ne 6. günde veya desidualizasyon orta ve beş günlük bir kuluçka dönemi (11 - Gün 6) için cAMP ve MPA eklenerek eş-kültür sistemine indüklenebilir. (B) vajinal lavajda bulunan kornifıye epitel hücrelerinin varlığı ile karakterize östrus fazın Örnek resmi (büyütme 10X). (C) Mesc ve MEEC Temsilcisi resmi (büyütme 20X, ölçek çubuğu: 100 mikron). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: immünolekeleme MEEC ve Mesc vimentin ve sitokeratin nicel RT-PCR. (A) vimentin ve sitokeratin ifade haberci RNA düzeylerinin kültürlerin saflığını gösterir. RNA seviyeleri göreceli olarak temizlik genleri ACTB ve TBP geometrik ortalama ile ölçüldü. Veri ortalama ± SEM olarak gösterildi. MESC kültürleri (B) ve MEEC kültürleri (C) vimentin / sitokeratin çift boyama. Sol takın 63X büyütme görünümünü göstermektedir. Mesc (D) MEEC (E) için hariç primer antikor ile negatif kontrol (ölçek çizgisi: 50 um). ***: P <çoklu test için Bonferroni düzeltmesi ile iki yönlü ANOVA ile 0.001. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: RT-PCR aracılığıyla sidualizasyonu Doğrulama. Stromal hücrelerde prolaktin ekspresyon (A) mRNA seviyeleri desidualizasyon değerlendirmek. RNA seviyeleri göreceli olarak temizlik genleri PGK1 ve TBP geometrik ortalama ile ölçüldü. kontrol veya desidual ortam içinde kültürlenen hücrelerde kat değişimi ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir. (B) (üst) ve sonra (alt) desidualizasyon uyaran önce stromal hücrelerin Örnek resimler. sağındaki Ek bir decidualized stromal hücre bir büyütme göstermektedir. Desidualizasyon siyah oklarla gösterilen çok çekirdekli hücrelerin varlığı ile karakterize edilir. (C), tahlil sonra ekleme epitel hücre canlılığının değerlendirilmesi Örnek ve görüntüler. Resimler canlılığı reaktifi idaresi (Prestoblue) (0 saat) ve f hemen sonra alındıollowing sabah (ON). **: P Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sidualizasyonu yuvarlak salgılayan desidua hücrelere endometriyal stromal hücrelerin progesteron bağımlı farklılaşma olduğunu. İnsanlarda, bu işlem, adet döngüsünün luteal faz sırasında kendiliğinden oluşur ve predecidua oluşturmak üzere vasküler hücreleri çevreleyen stromal hücrelerde başlatılır. Ancak, kemirgenlerde, bir blastosist varlığı desidualizasyon ikna etmek zorunludur. desidualizasyon endometrial epitel hücreleri ile temas ettikten sonra meydana olması önemli faktörler altta yatan stromada desidualizasyonu indükleme epitelyal hücreleri tarafından salgılanan ifade eder. desidualizasyon sürecinin başlamasında bu fark kabul edilmelidir rağmen, insan sidualizasyonu, embriyo implantasyonu üzerine daha sağlam hale gerçeği benzer mekanizmaların rol düşündürmektedir. İn vitro hücre kültürleri, genellikle desidualizasyon sürecinde özel moleküllerin etkilerini incelemek için kullanılır.Bununla birlikte, toplanabilir kullanılabilirliği ve insan dokusunun miktarı genellikle sınırlı ve örneğin varyasyonları, döngüsü evresi, gebelik sayısı ve endometriozis veya Adenomiyozis gibi jinekolojik hastalıkların varlığı ile eşlik ediyor. Bu sorunların çoğu kolay erişilebilir ve döngüsü faz bağımsız murin dokusunun kullanılması ile önlenebilir. fare doku kullanmanın bir diğer güçlü bir avantaj genetiği değiştirilmiş kemirgenler kullanmak için fırsat ve deneyler çok sayıda kurulum imkanı vardır. Şu anda, bir çok farklı yalıtım protokolleri, yüksek hayvanların yaş değişkenliği ve kullanım anında östrus fazda süresi ile, literatürde tarif edilmiştir.
Bu çalışma, bir avantaj izole önce östrojenin günlük enjeksiyonu ile standart östrus döngüsü çekildiği stromal ve epitelyal hücrelerin birincil endometrial ko-kültürler için yeni bir yöntem sunmaktadır. Bundan başka, estrojen known ayrıca izolasyon başına verimi artırır epitel ve stromal hücrelerde çoğalmasını teşvik etmek. Bu yazıda anlatılan izolasyon protokolü Grant ve ark dayanmaktadır. 7, bununla birlikte, daha fazla optimizasyon adımları farklı hücre kültürlerinin verimini, saflık ve canlılığını geliştirmek için dahil edilmiştir. İlk olarak, HBSS her zaman birincil kültür kirlenmesini önlemek için antibiyotikler ile takviye edilmiştir. MEEC izolasyonu sırasında sıcaklık adaptasyonu birinci sindirim sırasında epitel hücrelerinin hasat geliştirmek için (37 ° C'de 15 dakika) yapıldı. Daha sonra, ek bir adım aktivitesini inhibe etmek için FBS içeren ortam eklenerek tripsin sindirimden sonra enzimatik aktivitesi temper dahil edilmiştir. Ayrıca, MEECs örgü genel olarak genellikle küme ve hücre tabakaları gelir (100 um) tarif edilene göre daha büyük olduğu bir filtre içinden geçirildi. Ayrıca, stromal hücreler tarafından kirlenme bir eklenti gerçekleştirerek indirgenerekMEECs ve MESCs yerçekimi sedimantasyon dayalı ayrıştırılır edildiği itional adım. kaplanmamış veya PLL kaplı cam lamelleri bağlılık yetersiz olduğu netleşti Son olarak, MEECs, cam lamelleri hücrelerin eki artırmak için kollajen kaplı lamelleri numaralı seribaşı bulundu. MESCs izolasyonu sırasında kolajenaz (1 mg / ml) sindirim geliştirmek için ilave edildi. Bundan başka, bu sindirme basamak kalan MEECs kirlenmesini önlemek için iki kopya halinde yapıldı. Bütün bu ilave basamaklar homojen hücre popülasyonlarının saf ve canlı kültürler ile sonuçlanmıştır.
hücrelerinin saflığı immün ve QRT-PCR epitelyal marker olarak stromal işareti ve sitokeratin olarak vimentin kullanılarak değerlendirildi. Açıktır ki, vimentin ve sitokeratin bir karşı ifade modeli MEEC ve Mesc gözlenmiştir. Bununla birlikte, vimentin ve sitokeratin nispi mRNA ifadesi MEEC kültürler içindeki olduğu fark edilebilir. similar sonuçları, diğer araştırma grupları tarafından yayımlanan kültür acquire vimentin ifade 9 hangi epitel hücreler. Daha da önemlisi vimentin ve farklı hücre popülasyonlarının immünohistolojik boyamalar gözlendi sitokeratin arasındaki protein ekspresyonu farkıdır. Çift immün EECS sitokeratin ile pozitif idi ve ESC vimentin pozitif olduğunu göstermiştir. Immün bu belirteçlerin kullanımı kabul görmüş bir yöntemdir ve standart olarak hücre tipleri 10 belirtmek için kullanılır.
bir çok araştırma Mesc desidualizasyon gerçekleştirilen edilmiş olmasına rağmen, bu modelde epitel hücrelerinin varlığı desidualizasyon sonuçlarını değiştirebilir mümkün kalır. İlk olarak, MEEC MESC durumunu ortamın mevcudiyetinde ya da bir ko-kültür ortamında bir tek tabaka büyümeye halinde, tek tabaka geliştirilmiş bir epitel hücre transepitelyal elektrik direnci (olduğu gösterilmiştirTEER), Mesc 7 tarafından salgılanan faktörlerden kaynaklanan. Ayrıca, Pierro ve diğ. 11 17β-estradiyol etkilenmiş epitel proliferasyonu, stromal hücrelerinden salgılanan faktörlerle aracılık ettiğini kanıtlar sağlamıştır, ve alternatif olarak, epitel hücreleri, stromal desidualizasyon 12, 13 modüle faktörleri serbest kalabilir. Genel olarak, epitel-stromal ko-kültür ortamı parakrin etkileşim ve iletişim sağlayan bir daha fizyolojik bir durum sağladığı açıktır. Bir ekleme ko-kültür sistemi kullanılarak, iki farklı hücre tipleri kültürlenmesi gibi bir yöntem 14, 15 daha önce tarif edilmiş ve murin primer hücre kullanım için adapte edilmiştir. desidualizasyon bir okuma olarak prolaktin mRNA seviyelerinin tespiti ile, tarif edilen teknik mevcuttur ve izin desidualizasyon için çok tekrarlanabilir okunmasını sahipböylece desidualizasyon sırasında epitel-stromal ilişkinin çalışma s. MEEC mediated parakrin sinyaller stromal hücrelerde desidualizasyon ölçüde değiştirebilir. Ayrıca, model, doğrudan stromal hücreleri etkilemeden epitel yan spesifik modülasyon sağlar. Bu nedenle, MEEC ve Mesc bu ko-kültür stromal desidualizasyonda üzerinde bir okuma-out ile epitel hücreleri vb hormonlar, sitokinler, etkisini değerlendirmek için mükemmel bir araç sunar. Bu ko-kültür sisteminin diğer bir avantajı, araştırmacılar transjenik hayvanlardan izole edilen hücreler kullanılarak epitelyal veya stromal bölmesinde ya desidualizasyonu işlem, belirli bir proteinin tutulumu olup olmadığını araştırmak için izin vermektedir. Ayrıca, bu teknik bir blastokist varlığında epitel hücreleri tarafından salgılanan parakrin faktörler altta yatan stromal desidualizasyon ikna etmek için yeterli olup olmadığını değerlendirmek için blastosist yapışmasını araştırmak için çok yararlı olacaktırHücreler. trofoblast invazyonu önemli bir adım proteolitik enzimlerin faaliyetine aracılık hücre dışı matris degradasyonu ile korelasyon gösterdi. Önerilen teknik blastosist, epitel hücreleri ve destekleyici stromada arasındaki çapraz konuşma araştırmak için, bir in vitro modeli olarak uygulanabilir.
Ancak şu anda çok az glandüler yanı sıra luminal olabilir epitel hücrelerinin kökeni hakkında bilinmektedir. Bu nedenle, epitel hücrelerinin, genetik ve moleküler profili daha da karakterize gereklidir. Buna ek olarak, tarif edilen yöntem, epitel hücreleri polarizasyon ile ilgili mevcut bilgiler sınırlıdır. Şu anda, epitel hücreleri polarizasyonu dikkate alınmamıştır. Bununla birlikte, membran protein ifadesindeki farklar apikal ve bazal membranların anlatılmıştır. epitel tabakası olmayan polarizasyon epitheli arasında parakrin etkileşim üzerinde bir etkiye sahip olabiliral ve stromal hücreler. Ancak bu yöntemler de tarif edilmiştir polarize epitel hücreleri elde etmek için ve tarif edilen tekniğin 15, 16 dahil edilebilir.
Özet olarak, açıklanan protokol başarıyla fare endometriyal stromal ve epitelyal hücrelerin birincil hücre kültürleri oluşturulması için bir yöntem önermektedir. QRT-PCR ile teyit vimentin ve sitokeratin immün Bu teknik olarak saf hücre kültürlerinde sonuçlanır. Sonuçta, bir epitel ve stromal ko-kültür desidualizasyon sürecinde MEEC ve / veya Mesc ya aracılık ettiği parakrin sinyallerin soruşturma için izin verdiğini tanıtıldı.
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Bu çalışma Araştırma Vakfı-Flanders (FWO G.0856.13N) ve KU Leuven Araştırma Kurumu (OT / 13/113) hibe tarafından desteklenmiştir. KDC FWO Belçika tarafından finanse edilmektedir. AH OT / 13/113 tarafından finanse edilmektedir. Biz konfokal mikroskop kullanımı için KU Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) Hücre Görüntüleme Çekirdek tesis teşekkür etmek istiyorum.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant | Greiner Bio-one | 662610 | Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/ |
Nunc Cell culture treated 24 well plates | Thermo Scientific | 142475 | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475 |
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma Aldrich | B7880 | Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en®ion=BE |
Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma Aldrich | M1629 | Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en®ion=BE |
Arachis oil | Supermarket | Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used | |
PrestoBlue cell viability reagent | Thermo Scientific | A13261 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1 |
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175-046 | Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046 |
17-β Estradiol | Sigma Aldrich | E8875 | Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en®ion=BE |
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized | Merck Millipore | SCGPU05RE | http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063 |
DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES | Gibco | 11330-032 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057 |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | Gibco | 10500-056 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064 |
Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018 |
Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750-037 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037 |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Sigma Aldrich | D5921 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en®ion=BE |
MCDB-105 | Sigma Aldrich | M6395 | Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en®ion=BE |
Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I1882 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en®ion=BE |
Coverslips, glass, 18 mm Ø | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 1001/18 | http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 &tx_rmproducts_pi1[p]=3504 &tx_rmproducts_pi1[v]=20088 &cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06 |
Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en®ion=BE |
Collagenase type IA from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C2674 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en®ion=BE |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-094 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094 |
Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | T7409 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en®ion=BE |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054 |
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352340 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
Cell strainer, 100 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352360 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1 |
Acetic acid (glacial) 100% | Merck Millipore | 1.00063 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063 |
Collagen I | Corning | 354236 | From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29# |
Pancreatin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | P3292 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en®ion=BE |
35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | BD Falcon | 353001 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630 |
Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent | VWR Chemicals | 20821296 | https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP |
monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3) | Cell Signalling Tech | #5741 | Use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 |
monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin | Sigma Aldrich | C2562 | Use 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en®ion=BE |
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix | 19943 | http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1 |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en®ion=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ |
Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en®ion=BE |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-11034 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor®%20488\%22$;; |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 594 | Thermo Scientific | A-11032 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;; |
VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html |
DPBS, with calcium and magnesium | Gibco | 14040174 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır