Fare Endometrial stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu için<em&gt; İn Vitro</em&gt; sidualizasyonu

Özet

Bu çalışma, in vitro desidualizasyon çalışma için Coculture sisteminde kullanılabilen birincil fare, endometriyal stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu ve kültürü, bir standart ve geçerli bir yöntem sunulur.

Özet

Sidualizasyonu endometrial stromal hücrelerin bir progesteron bağımlı farklılaşma süreci ve başarılı embriyo implantasyonu için bir ön koşuldur. pek çok çaba desidualizasyon mekanizmasının ortaya çıkarmak için yapılmış olsa da, embriyo ve altta yatan stromal hücreler ile temas halinde olan epitel hücreleri arasındaki kesin sinyal henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, desidualizasyon moleküler ayrıntıları hakkında bilgilerimizi getirebileceği dikkate epitelyal ve stromal hücreler hem götüren bir şekilde sidualizasyonu okuyan. Bu amaç için, suni desidualizasyon in vivo modellerde fizyolojik en alakalı; Bununla birlikte, hücreler arası iletişim manipülasyonu ile sınırlıdır. Şu anda, endometriyal stromal hücrelerin in vitro kültürler birçok sinyal molekülleri tarafından desidualizasyon modülasyonunu araştırmak için kullanılmaktadır. Geleneksel olarak, insan ya da fare endometriyal stromal hücreleriKullanılmış. Bununla birlikte, insan rezervden sıklıkla sınırlıdır. Bundan başka, fare dokularının kullanımı kültür yönteminde çeşitli eşlik etmektedir. Bu çalışma, saf Endometrial Epitel Hücre (AET) ve üç gün boyunca östrojen uygulanan erişkin sağlam fareler kullanılarak Stromal Cell (ESC) kültürleri elde etmek için valide ve standart bir yöntem sunar. protokol hücrelerinin verimi, canlılığı ve saflık geliştirmek için optimize edilmiştir ve daha AET ve ESC bir kokültürü içinde sidualizasyonu incelemek amacıyla genişletilmiştir. Bu model, desidualizasyon her iki hücre tipinde önemini yararlanma ve hücreler arası iletişim sırasında EEC veya ESC tarafından salgılanan önemli bir sinyal molekülleri katkısını değerlendirmek için uygun olabilir.

Giriş

İnsan endometrium rahim iç astar ve olası gebelik için hazırlık olarak arıza ve onarım aylık döngülerini uğrar. Uterus lümeni ve yumurtalık hormonları östrojen ve progesteron dalgalanmalara bağlı olarak yoğunluğu değişir yatan stroma epitelyal hücrelerin tek bir katmandan oluşur. Luteal faz sırasında, postovulatuvar progesteron dalgalanma büyük, yuvarlak desidual hücrelere endometriyal stromal hücrelerin farklılaşması, sidualizasyonu ^{1, 2} olarak adlandırılan bir süreç neden olacaktır. İnsanlarda, bu olgu predecidua oluşturulması için kendiliğinden ortaya çıkar, fakat embriyo implantasyonu sırasında daha belirgin hale gelir. desidualizasyon bir fonksiyonel sonucu uterus geçici embriyo implantasyonu için alıcı hale gelmesidir. Bu aralık 'implantasyon penceresi' olarak etiketlenmiş. Embriyo implantasyonu erken dönemde, decidualized e sırasındaimplante embriyoyu çevreleyen ndometrial stromal hücreler embriyo ³ zararlı maddelerin geçişini önlemek için bir bariyer sağlar. Hamilelik sırasında, bu desidua plasenta yerini almıştır önce gelişmekte olan fetus için besin sağlayacak ve daha sonra plasenta ⁴ maternal bölümünü oluşturacaktır.

Etik ve pratik düşünceler desidualizasyonda sürecini araştırmak için insan çalışmaların tasarımı sınırlamak ve hayvan modellerinde kullanımını teşvik etmiştir. Hemochorial plasentasyon grubunun bir üyesi olmak, kemirgenler endometriyum da plasenta ⁵ önceki sidualizasyonu uğrayacaktır. Kemirgenlerde, ancak, desidualizasyon sürecinin başlatılması ilave uyaran desidual yanıt ⁶ tetiklemek için gerekli olduğunu gösteren, rahim lümeninde blastosist varlığına bağlıdır. Bu tarihleri ​​arasında karmaşık bir iletişim imae blastosist ile doğrudan temas endometrial epitel hücreleri ve altta yatan stromal hücreler. Bununla birlikte, desidualizasyon yapay mekanik çizilme veya hormonal hazırlanmamış bir uterusa yağ damlatma gibi bir uyarıcıya kullanılarak indüklenebilir. Yapay sidualizasyonu modelleri kullanarak in vivo çalışmalar, örneğin desidualizasyon karmaşık sinyal sürecinde, mekanik derinlemesine çalışmalar, bizim bakış açısı geliştirmek için bize izin olmasına rağmen, epitelyal ve stromal hücreleri arasındaki vazgeçilmez iletişim soruşturma sınırlıdır. Bu nedenle, in vitro sidualizasyonu çalışmaları önemli yollar işlemek ve temel süreçleri incelemek için kullanılabilir. Bu amaçla, endometrium stromal hücre kültürleri, insan ya da kemirgen endometrium kadar ayarlanabilir. kemirgenler istihdam desidualizasyon sürecinde ilgi belirli bir proteinin rolünü araştırmak için genetik olarak değiştirilmiş hayvanların kullanımını rıza. Bununla birlikte, olgunlaşmamış prepuberty farenin genellikle diğer durumlarda rahimler kültürlerinde bir heterojen sonuçlanan östrus döngüsü, tüm aşamaları da toplama, östrus döngüsü komplikasyonları önlemek için kullanılır. Ayrıca, desidualizasyon bir işlem kültür ortamına (I) 'e ilave hormon (östrojen, progesteron ya da siklik adenosin monofosfat (cAMP)) farklı protokoller, örneğin, çalışılmıştır veya edilmiş farelerden desidual hücreler, (ii) izole en göre fiş denetimi ve Vasektomi erkeklerde ek ihtiyaç duyarlar (sözde) gebelik, gün 4.5. Bu sınırlamalar in vitro desidualizasyonda incelemek için standart bir yöntemin gerekliliğini göstermektedir. Bu çalışmada, fizyolojik bir model yetişkin başlayarak, in vitro sidualizasyonu incelemek olmayan (sözde) hamile fareler sunulacak. Bu yöntemde, 17β-estradiol (E2) günlük enjeksiyonu homojen ve p artmış bir verimle elde endometriyal hücrelerin proliferasyonunu neden olacaktırure hücre popülasyonları. Ayrıca, bir coculturing sisteminin kullanımı epitel-stromal karışma ve farklı düzeylerde desidualizasyon sürecini manipüle etme yeteneği çalışma sağlar.

Protokol

AlexaFluor

Bu çalışma için tüm hayvan deneyleri KU Leuven (Belçika) (/ 2013 Proje P174) etik inceleme komitesi tarafından kabul edildi. Fareler gıda pelet ad libitum erişimine sahip, standart koşullar altında muhafaza ve musluk suyu ve kontrollü koşullar (23 ± 1.5 ° C, bağıl nem% 40 - 60, 12/12 aydınlık / karanlık döngüsü) altında tutuldu.

1. Fare

1. Piyasada mevcut fare suşu (- 12 haftalık, yani C57BL / 6 kadın 8) kullanın. Tipik haliyle, 4-5 farenin başka deneyler için hücreler uygun miktarda ürün elde edilir.
2. için 17β-estradiyol, 100 uL (E2) çözeltisi (100 ng / 100 ul) ile deri altından sağlam fareler enjekte 3 ardışık D hayvanların estrojen döngüsü faz standartlaştırmak ve endometriyal proliferasyonu oluşumunu sağlamak üzere izolasyon öncesinde hücreler. protokolü başlamadan önce farelerin döngüsü aşamasını kontrol etmek için ihtiyaç önlenebilir be olduğunu3 d 'östradiol tedavisinin neden olur.

2. hazırlıklar

1. 100 ng / yerfıstığı yağı içinde 100 uL, E2'nin bir solüsyonun hazırlanması. Beş fareye (1.2 de tarif edildiği gibi) ve enjeksiyonlar için 1.5 ml bir miktarda gereklidir.
   1. 1 mg / mL'lik bir stok çözeltisi için 1 ml etanol içinde 1 mg E2 eritin.
   2. Bu stok solüsyonu 1 seyreltilir: 1.000 yerfıstığı yağı.
2. 500 ml 1 x 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile tamamlanmış Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBBS) (daha fazla HBSS + olarak anılacaktır) sağlayın.
3. Kültür Mesc filtre Fare Endometriyal stromal hücre 500 ml yapmak (MESC) ortamı: fenol kırmızısı, L-glutamin ve 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik Dulbecco'nun Modifiye edilmiş Eagle ortamı / Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12) asit, N - (2-Hidroksietil) piperazin-N '- (2-etansülfonik asit) (HEPES),% 10 FBS, 0.5 ug / ml amfoterisin B, 100 ug / ml gentamisin ihtiva eden (further) MESC ortam olarak adlandırılır.
4. desidualizasyon süresince kültür Mesc filtre% 2 MESC ortamının 500 ml yapmak: fenol kırmızısı, L-glutamin ve% 2 FBS, 0.5 ug / ml amfoterisin B ihtiva eden HEPES, 100 ug / ml gentamisin ile DMEM / F12.
5. süzüldü Fare Endometriyal Epitel Hücre 500 mL hazırlama (MEEC) ortamı:% 10 FBS, 0.5 ug / ml amfoterisin B, 100 ug / ml gentamisin, 25% MCDB-105 aracı ve 5 mg / ml insülin içeren DMEM (daha fazla ifade ) MEEC ortamı olarak.
6. MESC kültürü için Poli-L-lisin (PLL) kaplanmış lamelleri hazırlayın.
   1. damıtılmış su, 250 mL PLL 25 mg eritin. 0.22 mikron filtre kullanılarak çözüm Filtre.
   2. 12-çukurlu bir tabla içindeki steri lamelleri ekleyin. lamelleri üzerinde çözünmüş PLL 300 uL ekleyin.
   3. inkübasyon 30 dakika sonra çözelti çıkarın. (- 2 ay kadar 1) Plakalar, 4 ° C'de bir sonraki kullanıma kadar muhafaza edilebilir.
7. 10 mg / ml stok çözeltisi o hazırlanmasıF kollajenaz tip -20 ° C'de 300 uL IA ve mağaza alikotları. Kullanmadan önce Filtre.

24 saat İzolasyon önce Gerekli 3. Hazırlıklar

1. MEEC kültürü için kollajen kaplı lamelleri hazırlayın.
   1. damıtılmış su içinde bir 0.02 M asetik asit solüsyonu (lamel başına 1 ml) hazırlayın.
   2. 50 ug / mL bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere 0.02 M asetik asit 12 mL kollajen 150 uL ekleyin.
   3. 12-çukurlu bir tabla içindeki steri lamelleri ekleyin.
   4. kolajen çözeltisi 1 mL (3.1.2) ekleyin.
   5. 37 ° C sıcaklıkta O / N (en az 12 saat) inkübe edin.
      Izolasyon sırasında:
   6. emme lamelleri kapalı kollajen çözüm çıkarın ve (laminer akış kabini içinde) steril bir ortamda o hava kurumaya bırakın.
   7. Fosfat tamponlu tuz (PBS) ile iki kez lamelleri yıkayın.
2. 10 ml içeren 15 ml standart bir tüp içinde 0.25 g pankreatin ekleyerek% 2.5 pankreatin çözeltisi hazırlayınHBSS +. çözünürlüğünü arttırmak için, 1 saat boyunca (200 rpm) 37 ° C'da, çözelti çalkalayın. 4 ° C'de saklayın.

4. İzolasyon ve Fare endometrial epitel hücreleri Kültür (MEEC) ve Fare Endometrial Stromal hücreler (MESC)

1. (Daha MESC sindirim karışımı olarak adlandırılır)% 0.25 tripsin içeren nihai çözelti ile sonuna kadar% 2.5 pankreatin çözeltisi (3.2) ihtiva eden 15 ml bir tüp içinde tripsin 25 mg ekleyin.
2. Uteri izolasyonu
   1. vajinal smear incelemesinin hayvanların döngüsü aşamasını kontrol edin.
      1. hayvan dizginlemek ve 50 ul PBS 3 nazikçe vajina yıkayın - 5 kez.
      2. Bir bardak slayt son floş toplayın.
      3. 10X veya 20X objektif kullanarak parlak alan mikroskobu altında malzemeyi inceleyin.
      4. Sadece kızışma aşamasında olan fareler kullanın. Bu aşama, vajinal lavajda bulunan kornifıye epitel hücrelerinin varlığı (Şekil 1 ile karakterize edilir ).
   2. Böyle servikal dislokasyon veya CO ₂ indüklenen narkoz gibi uygun bir yöntem kullanılarak hayvanları euthanize.
   3. steril bir ortam oluşturmak için% 70 etanol ile karkas püskürtün.
   4. Steril cerrahi aletler kullanarak, karın açın ve her iki rahim boynuzları görselleştirmek için bir kenara bağırsak itin.
   5. fallop tüpü altında en uzak ucunda uterin horn tut. Fallop tüpünden rahim boynuzları incelemek ve yağ ve bağ dokusu çıkarın. rahim vücudun üstünde uzak ucunda korna kesip HBSS + 3 mL ile 35 mm Petri kabı yerleştirin.
      1. tüm rahim boynuzları toplanana kadar diğer boynuz ve diğer hayvanlar için bu adımı yineleyin.
   6. ayrıca bir Stereoskop altında (HBSS + içinde) uterin boynuz temizleyin ve kalan tüm adipoz veya bağ dokusu kaldırmak.
   7. rahim lümen maruz ve inci yerine uzunlamasına açık rahim boynuzları CutTaze HBSS + ile yeni bir Petri kabındaki e boynuz.
   8. pankreatini ve tripsin içeren 15 ml tüp tüm rahim boynuzları aktarın.
   9. orbital çalkalayıcı (50 rpm) ile, 4 ° C'de 60 dakika boyunca yatay olarak inkübe edin.
   10. çalkalamadan, 23 ° C (RT) 45 dakika boyunca yatay olarak inkübe edin.
   11. çalkalamadan, 37 ° C (su banyosu) 15 dakika boyunca yatay olarak inkübe edin.
   12. Öte yandan,% 0.05 Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi 2.7 mL, 1 mg / ml kollajenaz stokunun 300 uL çözülmesiyle MESC sindirim karışımı tercih.
       Not: Bundan sonra, daha fazla yalıtım adımları bir laminar akış kabini altında steril bir ortamda gerçekleştirilir.
3. Fare Endometrial Epitel Hücre (MEEC) Kültür
   1. 2 saat kuluçkalamadan sonra, dikkatli bir şekilde yüzer solüsyonundan dökün.
   2. Tripsin inaktive etmek için soğuk MEEC ortam içeren bir Petri kutusu içine uteri aktarın ve 5 dakika boyunca inkübeaktivite.
   3. soğuk HBSS + 3 mL içeren 15 ml tüp uteri aktarın.
   4. 10 sn için vorteks epitel kağıtları açmak için.
   5. 3 ml HBSS + ile temiz bir Petri kabındaki uterus durulayın.
   6. Adımı tekrarlayın 4.3.2 - 4.3.4 epitel tablolarını içeren üç süspansiyonlar toplam elde etmek.
   7. MESC sindirim karışımı uteri aktarın ve (200 rpm) çalkalayarak 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika inkübe edilir (Mesc daha izolasyonu için 4.4 adıma git).
   8. Doku enkaz kaldırmak için 100 mikron naylon örgü hafifçe üç hücre süspansiyonları pipetleme epitel yaprak kurtarın.
   9. 5 dakika boyunca 500 xg'de toplanan hücre süspansiyonu santrifüj.
   10. MEEC ortamı 12 mL pelet yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın.
   11. gravite sedimantasyon kullanılarak geri kalan Mesc ayırmak için 5 dakika boyunca çözeltiden yerleşirler.
   12. 5 ml pipet kullanarak dikkatlice üst 2 mL çıkarın.
   13. Hücre suspensio santrifüjn, 5 dakika boyunca 500 xg'de.
   14. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme MEEC ortamda süspanse.
   15. Diğer deneylerde (Şekil 2a) için istenen yoğunluğa kollajen kaplı lamelleri, hücreler plaka.
   16. 12 saat en az% 5 _CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
       Not: RNA veya protein izolasyon arzu edildiğinde, bir 6-yuvalı plaka tohumlama tavsiye edilirken immün veya floresan kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel deneylerde, bu lamelleri, hücreleri doğrudan doğruya levha için tavsiye edilir. Fare endometriyal stromal hücrelerin izolasyonu yetersiz tek bir sindirimden sonra hücre saflığı iki tur ayrılmıştır. rahimler optimal hücre iyileşme ve saflık için iki kez sindirilir. Her iki turda da teknik müdahaleler aynıdır. araştırmacı tarafından istenen her iki turda toplanan hücreler, daha fazla deneyler için muhafaza edilebilir.
4. Fare Endometrial Stromal Hücre (MESC) Kültür: ^1. Yuvarlak
   1. İlk sindirim ayağı başlamadan önce, 2.7 mi,% 0.05 Tripsin-EDTA çözeltisi içinde 1 mg / ml kollajenaz stokunun 300 uL eritilerek ikinci bir sindirim karışımı hazırlayın. Bu karışım aşama 4.4.8 gereklidir.
   2. soğuk (4 ° C) HBSS + ve MESC ortamının 3 mL, 3 x 15 ml tüpler (tüp, X1, X2 ve X3) ile üç kültür kaplarına hazırlayın.
   3. inkübasyon 30 dakika sonra, 10 saniye için hafifçe rahim içeren tripsin solüsyonu sallayın. MESC hücreleri rahim dokusu ayırmak ve tripsin çözeltisi içinde kalır.
   4. soğuk (4 ° C) HBSS + 3 mL içeren ilk Petri kabı uterus aktarın ve iyice durulayın.
   5. tripsin aktivitesi inhibe başlangıçta (adım 4.4.3 tüp) rahim boynuzları içeren tüp MESC orta 3 mL ekleyin.
   6. HBSS + MESC ortamının 3 mL içeren tüp X1 soğuk (4 ° C) Petri kabı rahimleri aktarın ve 10 sn için hafifçe çalkalanır.
   7. Tekrarlayın 4.4.4 (soğuk (4 ° C ile Petri kabı transfer) HBSS +) ve iki kez 4.4.6 (tüp X2 ve X3 transfer) yineleyin.
      Not: Son olarak, bu protokol, 4 hücre süspansiyonları neden olur: bir boru tripsin solüsyonu ve Mesc içeren MESC ortam ile 3 tüp (tüpler, X1, X2 ve X3) ihtiva etmektedir.
   8. Aşama 4.4.1 de tarif edildiği gibi, yeni MESC sindirime uteri aktarın ve dikey olarak, 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
   9. 40 mikron naylon örgü ile dört hücre süspansiyonları geçerek stromal hücreler toplayın. Mesc ek 5 ml ile örgü durulayın.
   10. 7 dakika boyunca 500 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj.
   11. istenen yoğunluğa sahip başka deneyler için PLL kaplı lamelleri Mesc ve plakadaki pelletini.
   12. % 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 6 saat ve O / N 4 - en az inkübe edin.
5. Fare Endometrial Stromal Cell (MESC) Kültür: ^2. Yuvarlak
   1. soğuk (4 ° C) HBSS + ve MESC ortamının 3 mL, 3 x 15 ml tüpler (Borular, Y1, Y2 ve Y3) ile üç kültür kaplarına hazırlayın.
   2. 4.4.7 - Tekrar 4.4.3 adımları.
   3. 40 mikron naylon örgü uteri ile birlikte son hücre süspansiyonu aktarın.
   4. naylon gözlü bir tüp Y1, Y2 ve Y3 içeriğini geçirilerek stromal hücreler toplanır. Mesc ek 5 ml ile örgü durulayın.
   5. 7 dakika boyunca 500 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj.
   6. Diğer deneylerde (Şekil 2b) için PLL kaplı lamelleri MESC orta ve plaka pelletini.
   7. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 6 saat 4 - en az inkübe edin.
      Not: RNA veya protein izolasyon arzu edildiğinde önerilir 6 oyuklu bir plaka içerisinde tohum ise immün veya floresan kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel deneylerde, bu lamelleri hücreleri plaka tavsiye edilir.

5. Vimentin/ Saf MEEC ve MESC Kültürlerin Doğrulama için Sitokeratin Çift Boyama

1. lamelleri hücreleri Tohum.
2. PBS orbital çalkalayıcı (50 rpm) üzerine, kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden 3 x 5 dk yıkayın.
3. Olmayan bir karıştırıcı üzerinde 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) (Dikkat gösterilmelidir!) Hücreleri saptamak.
4. çalkalayıcı (50 rpm) üzerine kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile 3 kez yıkanır.
5. bir çalkalayıcı (50 rpm) ile 10 dakika boyunca% 0.2 Triton X-100 hücreleri geçirgenliği.
6. bir çalkalayıcı üzerinde PBS ile 3 kez yıkayın.
7. bir çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca PBS içerisinde% 5 keçi serumu (GS) ile blok (50 rpm)
8. bir çalkalayıcı (50 rpm) ile 4 ° C'de (: 1: 500) ve monoklonal fare anti-insan pansitokeratin (1.000 1) tek klonlu tavşan anti-insan vimentin hücreleri inkübe edin. Antikorlar% 0.5 GS PBS içinde seyreltilir.
9. bir çalkalama (50 rpm) ile, PBS ile yıkayın 3x.
10. sekonder antikor ile inkübe hücreleri (1: 1,000% 0.5 GS) Alexa Fluor 488-bağlı anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 488-konjugatbir çalkalayıcı üzerinde bir kapı anti-fare IgG.
11. bir çalkalayıcı üzerinde PBS ile 3 kez yıkayın.
12. Dağı DAPI ve kuru O / N ihtiva eden sulu montaj orta ile slaytlar.
13. Oje ile slaytlar Seal ve daha sonra kullanmak üzere 4 ° C üzerinde tutmak (Şekil 2a, b).

Bir Coculture Sistemde Vitro desidualizasyonda 6.

Not: Dört ila beş hayvandan, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, bir Coculture sistemi kurmak için gereklidir. tercihen bir laminer akış kabini altında steril bir ortamda aşağıdaki protokol ile devam edin.

1. bir 24-çukurlu plaka epitel hücre izolasyonu (4.3 de tarif edildiği gibi), santrifüj ve / veya İnkübasyon sırasında hücre kültürü ekler hazırlayın.
   1. 24 oyuklu bir plaka içerisinde kuyu istenen miktarda içine MESC ortamı 400 uL - 200.
   2. Steril forseps kullanarak önceden doldurulmuş 24-kuyularda ekler yerleştirin.
2. MEEC peletekler üzerinde MEEC orta ve bölmek (aşama 4.3.14) (çalışma hacmi: 150 - uç başına 300 uL). Kültür, bir% 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de hücreler.
3. stromal hücre izolasyonu ikinci tur (aşama 4.5.6) sonra, (hücre kültürü ekler ile uyumlu) bir 24-çukurlu plaka içinde stromal hücreler tohumu. oyuk başına 400 uL hücre süspansiyonu bir çalışma hacmi kullanın.
4. % 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 6 saat - stromal hücreler en az 4 eklemesini sağlar.
5. stromal hücreler tarafından kapanan ikinci 24 oyuklu plaka ilk 24 oyuklu plaka epitel hücreleri ile kaplı hücre kültürü ekler aktarın. sterilize forseps kullanın ya da sadece kendi asılı dibinde ekler dokunun.
6. Kültür 3 bir süre için% 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de hücreler -% 90 oranında konfluent - epitel hücreleri kadar 5 gün, bir tek-tabakalı ve stromal hücreler 80 elde oluşturur. Ayrıca, kullanımı Transepitelyal Elektrik Direnci (TEER)Grant ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi bir ohm / epitel metre kullanımı ile epitel tek tabaka izlemek için. ^7. 800-1000 civarında / kuyu değerleri epitel tek tabakalı konfluent dikkate yeterli.
7. cam pipetler veya ince pipet ipuçlarını kullanarak 3 d - Gerekirse, orta her 2 değiştirin. ekler de orta değiştirmeden önce, (altta seribaşı) stromal hücrelerin orta değiştirme ile başlayın. 37 ° C'de önceden ısıtılmış bir hücre kültür ortamını kullanmak tavsiye edilir.
8. Deney başlamadan önce in vitro desidualizasyonda ikna etmek için desidualizasyon ortamı hazırlayın. stromal hücrelerin oyuk başına 400 uL bir çalışma hacmi kullanın.
   1. -20 ° C'de aşağıdaki stok çözümleri ve mağaza alikotları hazırlayın.
      1. etanol 250 uM medroksiprogesteron 17-asetat (MPA) hazırlayın.
      2. 100 mM stok çözeltisi, 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-ultra saf su içinde cAMP'yi hazırlayın.
   2. 1 uM MPA ve% 2 FBS içeren MESC ortamı içinde 0.5 mM cAMP ihtiva eden desidual tanesidir.
9. Yavaşça kuyulardan orta kaldırmak ve stromal hücreleri üzerine desidual orta ekleyin. bir kontrol durumu gerekli ise,% 2 FBS içeren MESC ortamını kullanmak.
10. hücre kültürü ekler orta çıkarın ve hücreler üzerine MEEC orta 300 mcL ekleyin.
11. % 5 _CO2 içinde 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde 5 gün boyunca hücrelerin inkübe edin.
12. Beşinci gün sonra, RT-qPCR stromal hücrelerde desidualizasyon ölçüde değerlendirmek (aşağıya bakınız).
13. Resazurin tabanlı canlılığı bir reaktif kullanılarak epitel hücrelerin canlılığını doğrula.
    1. MEEC ortamda yaşama güçlerine reajanı 1:10 çözeltisi hazırlayın.
    2. Yeni 24-yuvalı plaka içine hücre kültür ekleri aktarın.
    3. hücreleri üzerine MEEC solüsyon - canlılığı reaktifi 300 uL - 150 ekleyin.
    4. De% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edinEn az 4-5 saat veya gece boyunca ve (mor / pembe mavi) bir renk değişimine gözlemleyerek hücre canlılığını değerlendirmek.
       NOT: araştırmacı tarafından tercih edildiği gibi sidualizasyonu ayrıca, bir fare prolaktin spesifik ELISA yöntemi ile değerlendirilebilir.

Mah-PCR ile sidualizasyonu ve 7.Validation

Not: QRT-PCR ile desidualizasyon geçerli olabilmesi için, bu RNA analizi için bir hücre yeterli miktarda almak için iki kez tüm test koşulları gerçekleştirmek tavsiye edilir.
De Clercq ve arkadaşları, daha önce tarif edildiği gibi kantitatif RT-PCR gerçekleştirilir. ^8.
Kısaca:

1. ticari RNA izolasyon kiti kullanılarak toplam RNA izole.
   1. sırasıyla, üreticinin protokolüne göre, ticari yöntemlerle RNA miktarını ve kalitesini değerlendirmek.
2. toplam RNA'nın 1 | ig itibaren üreticinin protokolüne uygun olarak, cDNA sentez.
3. QRT-PCR reaksiyonunu gerçekleştirmek için, üreticinin protokolüne uygun olarak, ticari bir kit kullanın.
   1. üç nüsha tüm örnekleri çalıştırın.
   2. reaksiyonu yürütmek için istenen temizlik genler ve prolaktin (prl8a2) ticari TaqMan Master Mix ve spesifik TaqMan probları yararlanın.

Sonuçlar

Protokolün Genel Bakış

Şekil 1A protokolünün genel bir bakış göstermektedir. arka arkaya üç gün boyunca E2 (100 ng) bir günlük enjeksiyonu hayvanları senkronize etmek ve östrus döngüsü faz standardize etmek için kullanıldı. estrojen döngüsü vajinal lavaj ile değerlendirilebilir ve Proestrus, östrus, diöstrusun ve ostrus faz ayrılmıştır. döngüsü faz hormonal değişikliklere maruz lavaj dökülmüş hücrelerin oranına göre ifade edilebilir. östrojen düzeyleri artan hayvanlar kızışma faza gelişmeye yapacaktır. Bu aşama, kolayca özel olarak açığa çıkan epitel hücrelerinin varlığı ve lökositlerin yokluğunda (Şekil 1B) ile tespit edilebilir. 4. günde, östrus fazda hayvanların rahim toplanır ve MEEC ve MESC (Şekil 1C) izole edilir. desidualizasyon cBir 5 gün bir inkübasyon süresi boyunca 0.5 mM cAMP ve% 2 FBS ortamına 1 uM MPA eklenerek uyarılabilmektedir.

MEEC ve MESC Kültürlerinin Kalite Kontrol

Birincil hücre kültürlerinin saflığı vimentin ve sitokeratin ifade farkı ile değerlendirilebilir. Vimentin dolayısıyla endometriyal stromal hücrelerde, mezenşim hücrelerinde eksprese edilen bir ara madde filamenttir. Sitokeratin epitel doku hücre iskeleti içinde bulunan bir ara filamenttir. Şekil 2A MEEC ve Mesc vimentin ve sitokeratin mRNA ekspresyon seviyesi QRT-PCR kullanılarak değerlendirildi gösterir. Vimentin seviyeleri MEEC içinde Mesc yüksek ve düşük (yüksek 2.2X, p <0.001), sitokeratin düzeyleri Mesc içinde MEEC yüksek ve düşük iken (36x yüksek, p <0.001). Bir vimentin / sitokeratin çift boyama yapılmıştır ve stromal hücreler epit oysa vimentin ifade belirtilmiştirHelial hücreleri (Şekil 2B, C), sitokeratin ifade eder. Primer antikorun yokluğunda immün (Şekil 2D, E) için negatif bir kontrol olarak kullanıldı. Bu immünohistolojik renklendirmeler hem endometriyal hücre kültürleri (MEEC ve MESC)% 90 kadar bir saflığa sahip olduğunu göstermektedir.

MEEC / MESC cocultures sidualizasyonu

İzolasyondan sonra, fare endometriyal stromal hücreleri endometriyal ortamı taklit etmek için bir ko-kültür sisteminde tohumlandı. Ve stromal hücreler bir alt konfluent devlet ulaştı - epitel hücreleri (/ kuyu 1.000 800 TEER değerlerini) hücre kültür insert içinde bir tek tabaka oluşuncaya kadar hücreler kültüre edildi. Sidualizasyonu 0.5 mM cAMP uygulama ve 1 uM MPA ile stromal hücrelerinde olduğu görüldü. İnkübasyondan beş gün sonra, prolaktin mRNA düzeyleri yaprak döken bir gösterge olarak QRT-PCR ile stromal hücrelerde değerlendirildiualization (Şekil 3A). Prolaktin seviyeleri yüksek hücre kontrol ortamı (p <0.01) ile inkübe edilen hücrelerde hormon tabi tutulur ve tespit edilemeyen olarak ifade edildi.

Epitel hücreleri, hücre kültürü ekler içinde görselleştirmek için sabit olduğu için, bir canlılığı deneyi beş günlük kuluçka süresi (Şekil 3B) hemen sonra uygulandı. normal büyüme ortamı ve bir canlılık reaktif bir karışımı oyuklarına ilave edildi ve en az 8 bir süre için kuluçkalanmıştır - 12 saat. parlak pembe mavi renk kayması epitel hücrelerinin mevcudiyetine işaret etmiştir. canlı hücreler mevcut olduğunda renk kayması yalnızca ortaya çıkar unutmayın.

Şekil 1: Protokol Genel Bakış. (A), yalıtım protokol Şema üç ile başlayanÖstrojen enjeksiyonları ardışık gün. 3. günde, gerekli hazırlıklar hazırlanmalıdır. 4. günde, kızgınlık faz vajinal lavaj yapılarak (yıldız ile gösterilir) değerlendirilir. MESC ve MEEC farklı sindirim adımları kullanarak izole edilmiştir. Hücreler birleştiklerinde, ne 6. günde veya desidualizasyon orta ve beş günlük bir kuluçka dönemi (11 - Gün 6) için cAMP ve MPA eklenerek eş-kültür sistemine indüklenebilir. (B) vajinal lavajda bulunan kornifıye epitel hücrelerinin varlığı ile karakterize östrus fazın Örnek resmi (büyütme 10X). (C) Mesc ve MEEC Temsilcisi resmi (büyütme 20X, ölçek çubuğu: 100 mikron). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: immünolekeleme MEEC ve Mesc vimentin ve sitokeratin nicel RT-PCR. (A) vimentin ve sitokeratin ifade haberci RNA düzeylerinin kültürlerin saflığını gösterir. RNA seviyeleri göreceli olarak temizlik genleri ACTB ve TBP geometrik ortalama ile ölçüldü. Veri ortalama ± SEM olarak gösterildi. MESC kültürleri (B) ve MEEC kültürleri (C) vimentin / sitokeratin çift boyama. Sol takın 63X büyütme görünümünü göstermektedir. Mesc (D) MEEC (E) için hariç primer antikor ile negatif kontrol (ölçek çizgisi: 50 um). ***: P <çoklu test için Bonferroni düzeltmesi ile iki yönlü ANOVA ile 0.001. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: RT-PCR aracılığıyla sidualizasyonu Doğrulama. Stromal hücrelerde prolaktin ekspresyon (A) mRNA seviyeleri desidualizasyon değerlendirmek. RNA seviyeleri göreceli olarak temizlik genleri PGK1 ve TBP geometrik ortalama ile ölçüldü. kontrol veya desidual ortam içinde kültürlenen hücrelerde kat değişimi ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir. (B) (üst) ve sonra (alt) desidualizasyon uyaran önce stromal hücrelerin Örnek resimler. sağındaki Ek bir decidualized stromal hücre bir büyütme göstermektedir. Desidualizasyon siyah oklarla gösterilen çok çekirdekli hücrelerin varlığı ile karakterize edilir. (C), tahlil sonra ekleme epitel hücre canlılığının değerlendirilmesi Örnek ve görüntüler. Resimler canlılığı reaktifi idaresi (Prestoblue) (0 saat) ve f hemen sonra alındıollowing sabah (ON). **: P Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Sidualizasyonu yuvarlak salgılayan desidua hücrelere endometriyal stromal hücrelerin progesteron bağımlı farklılaşma olduğunu. İnsanlarda, bu işlem, adet döngüsünün luteal faz sırasında kendiliğinden oluşur ve predecidua oluşturmak üzere vasküler hücreleri çevreleyen stromal hücrelerde başlatılır. Ancak, kemirgenlerde, bir blastosist varlığı desidualizasyon ikna etmek zorunludur. desidualizasyon endometrial epitel hücreleri ile temas ettikten sonra meydana olması önemli faktörler altta yatan stromada desidualizasyonu indükleme epitelyal hücreleri tarafından salgılanan ifade eder. desidualizasyon sürecinin başlamasında bu fark kabul edilmelidir rağmen, insan sidualizasyonu, embriyo implantasyonu üzerine daha sağlam hale gerçeği benzer mekanizmaların rol düşündürmektedir. İn vitro hücre kültürleri, genellikle desidualizasyon sürecinde özel moleküllerin etkilerini incelemek için kullanılır.Bununla birlikte, toplanabilir kullanılabilirliği ve insan dokusunun miktarı genellikle sınırlı ve örneğin varyasyonları, döngüsü evresi, gebelik sayısı ve endometriozis veya Adenomiyozis gibi jinekolojik hastalıkların varlığı ile eşlik ediyor. Bu sorunların çoğu kolay erişilebilir ve döngüsü faz bağımsız murin dokusunun kullanılması ile önlenebilir. fare doku kullanmanın bir diğer güçlü bir avantaj genetiği değiştirilmiş kemirgenler kullanmak için fırsat ve deneyler çok sayıda kurulum imkanı vardır. Şu anda, bir çok farklı yalıtım protokolleri, yüksek hayvanların yaş değişkenliği ve kullanım anında östrus fazda süresi ile, literatürde tarif edilmiştir.

Bu çalışma, bir avantaj izole önce östrojenin günlük enjeksiyonu ile standart östrus döngüsü çekildiği stromal ve epitelyal hücrelerin birincil endometrial ko-kültürler için yeni bir yöntem sunmaktadır. Bundan başka, estrojen known ayrıca izolasyon başına verimi artırır epitel ve stromal hücrelerde çoğalmasını teşvik etmek. Bu yazıda anlatılan izolasyon protokolü Grant ve ark dayanmaktadır. ^7, bununla birlikte, daha fazla optimizasyon adımları farklı hücre kültürlerinin verimini, saflık ve canlılığını geliştirmek için dahil edilmiştir. İlk olarak, HBSS her zaman birincil kültür kirlenmesini önlemek için antibiyotikler ile takviye edilmiştir. MEEC izolasyonu sırasında sıcaklık adaptasyonu birinci sindirim sırasında epitel hücrelerinin hasat geliştirmek için (37 ° C'de 15 dakika) yapıldı. Daha sonra, ek bir adım aktivitesini inhibe etmek için FBS içeren ortam eklenerek tripsin sindirimden sonra enzimatik aktivitesi temper dahil edilmiştir. Ayrıca, MEECs örgü genel olarak genellikle küme ve hücre tabakaları gelir (100 um) tarif edilene göre daha büyük olduğu bir filtre içinden geçirildi. Ayrıca, stromal hücreler tarafından kirlenme bir eklenti gerçekleştirerek indirgenerekMEECs ve MESCs yerçekimi sedimantasyon dayalı ayrıştırılır edildiği itional adım. kaplanmamış veya PLL kaplı cam lamelleri bağlılık yetersiz olduğu netleşti Son olarak, MEECs, cam lamelleri hücrelerin eki artırmak için kollajen kaplı lamelleri numaralı seribaşı bulundu. MESCs izolasyonu sırasında kolajenaz (1 mg / ml) sindirim geliştirmek için ilave edildi. Bundan başka, bu sindirme basamak kalan MEECs kirlenmesini önlemek için iki kopya halinde yapıldı. Bütün bu ilave basamaklar homojen hücre popülasyonlarının saf ve canlı kültürler ile sonuçlanmıştır.

hücrelerinin saflığı immün ve QRT-PCR epitelyal marker olarak stromal işareti ve sitokeratin olarak vimentin kullanılarak değerlendirildi. Açıktır ki, vimentin ve sitokeratin bir karşı ifade modeli MEEC ve Mesc gözlenmiştir. Bununla birlikte, vimentin ve sitokeratin nispi mRNA ifadesi MEEC kültürler içindeki olduğu fark edilebilir. similar sonuçları, diğer araştırma grupları tarafından yayımlanan kültür acquire vimentin ifade ⁹ hangi epitel hücreler. Daha da önemlisi vimentin ve farklı hücre popülasyonlarının immünohistolojik boyamalar gözlendi sitokeratin arasındaki protein ekspresyonu farkıdır. Çift immün EECS sitokeratin ile pozitif idi ve ESC vimentin pozitif olduğunu göstermiştir. Immün bu belirteçlerin kullanımı kabul görmüş bir yöntemdir ve standart olarak hücre tipleri ¹⁰ belirtmek için kullanılır.

bir çok araştırma Mesc desidualizasyon gerçekleştirilen edilmiş olmasına rağmen, bu modelde epitel hücrelerinin varlığı desidualizasyon sonuçlarını değiştirebilir mümkün kalır. İlk olarak, MEEC MESC durumunu ortamın mevcudiyetinde ya da bir ko-kültür ortamında bir tek tabaka büyümeye halinde, tek tabaka geliştirilmiş bir epitel hücre transepitelyal elektrik direnci (olduğu gösterilmiştirTEER), Mesc ⁷ tarafından salgılanan faktörlerden kaynaklanan. Ayrıca, Pierro ve diğ. ¹¹ 17β-estradiyol etkilenmiş epitel proliferasyonu, stromal hücrelerinden salgılanan faktörlerle aracılık ettiğini kanıtlar sağlamıştır, ve alternatif olarak, epitel hücreleri, stromal desidualizasyon ^{12, 13} modüle faktörleri serbest kalabilir. Genel olarak, epitel-stromal ko-kültür ortamı parakrin etkileşim ve iletişim sağlayan bir daha fizyolojik bir durum sağladığı açıktır. Bir ekleme ko-kültür sistemi kullanılarak, iki farklı hücre tipleri kültürlenmesi gibi bir yöntem ^{14, 15} daha önce tarif edilmiş ve murin primer hücre kullanım için adapte edilmiştir. desidualizasyon bir okuma olarak prolaktin mRNA seviyelerinin tespiti ile, tarif edilen teknik mevcuttur ve izin desidualizasyon için çok tekrarlanabilir okunmasını sahipböylece desidualizasyon sırasında epitel-stromal ilişkinin çalışma s. MEEC mediated parakrin sinyaller stromal hücrelerde desidualizasyon ölçüde değiştirebilir. Ayrıca, model, doğrudan stromal hücreleri etkilemeden epitel yan spesifik modülasyon sağlar. Bu nedenle, MEEC ve Mesc bu ko-kültür stromal desidualizasyonda üzerinde bir okuma-out ile epitel hücreleri vb hormonlar, sitokinler, etkisini değerlendirmek için mükemmel bir araç sunar. Bu ko-kültür sisteminin diğer bir avantajı, araştırmacılar transjenik hayvanlardan izole edilen hücreler kullanılarak epitelyal veya stromal bölmesinde ya desidualizasyonu işlem, belirli bir proteinin tutulumu olup olmadığını araştırmak için izin vermektedir. Ayrıca, bu teknik bir blastokist varlığında epitel hücreleri tarafından salgılanan parakrin faktörler altta yatan stromal desidualizasyon ikna etmek için yeterli olup olmadığını değerlendirmek için blastosist yapışmasını araştırmak için çok yararlı olacaktırHücreler. trofoblast invazyonu önemli bir adım proteolitik enzimlerin faaliyetine aracılık hücre dışı matris degradasyonu ile korelasyon gösterdi. Önerilen teknik blastosist, epitel hücreleri ve destekleyici stromada arasındaki çapraz konuşma araştırmak için, bir in vitro modeli olarak uygulanabilir.

Ancak şu anda çok az glandüler yanı sıra luminal olabilir epitel hücrelerinin kökeni hakkında bilinmektedir. Bu nedenle, epitel hücrelerinin, genetik ve moleküler profili daha da karakterize gereklidir. Buna ek olarak, tarif edilen yöntem, epitel hücreleri polarizasyon ile ilgili mevcut bilgiler sınırlıdır. Şu anda, epitel hücreleri polarizasyonu dikkate alınmamıştır. Bununla birlikte, membran protein ifadesindeki farklar apikal ve bazal membranların anlatılmıştır. epitel tabakası olmayan polarizasyon epitheli arasında parakrin etkileşim üzerinde bir etkiye sahip olabiliral ve stromal hücreler. Ancak bu yöntemler de tarif edilmiştir polarize epitel hücreleri elde etmek için ve tarif edilen tekniğin ^{15, 16} dahil edilebilir.

Özet olarak, açıklanan protokol başarıyla fare endometriyal stromal ve epitelyal hücrelerin birincil hücre kültürleri oluşturulması için bir yöntem önermektedir. QRT-PCR ile teyit vimentin ve sitokeratin immün Bu teknik olarak saf hücre kültürlerinde sonuçlanır. Sonuçta, bir epitel ve stromal ko-kültür desidualizasyon sürecinde MEEC ve / veya Mesc ya aracılık ettiği parakrin sinyallerin soruşturma için izin verdiğini tanıtıldı.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant	Greiner Bio-one	662610	Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/
Nunc Cell culture treated 24 well plates	Thermo Scientific	142475	http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma Aldrich	B7880	Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE
Medroxyprogesterone 17-acetate	Sigma Aldrich	M1629	Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE
Arachis oil	Supermarket		Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used
PrestoBlue cell viability reagent	Thermo Scientific	A13261	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175-046	Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046
17-β Estradiol	Sigma Aldrich	E8875	Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&region=BE
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized	Merck Millipore	SCGPU05RE	http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070-063	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063
DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES	Gibco	11330-032	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin	Gibco	10500-056	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064
Amphotericin B	Gibco	15290-018	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750-037	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Sigma Aldrich	D5921	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE
MCDB-105	Sigma Aldrich	M6395	Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE
Insulin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	I1882	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE
Coverslips, glass, 18 mm Ø	Glaswarenfabrik Karl Hecht	1001/18	http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 &tx_rmproducts_pi1[p]=3504 &tx_rmproducts_pi1[v]=20088 &cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P2636	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE
Collagenase type IA from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C2674	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-094	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094
Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	T7409	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300-054	Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable	BD Falcon	352340	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Cell strainer, 100 µm mesh, disposable	BD Falcon	352360	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized	Merck Millipore	SLGP033RS	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1
Acetic acid (glacial) 100%	Merck Millipore	1.00063	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063
Collagen I	Corning	354236	From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29#
Pancreatin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	P3292	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE
35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile	BD Falcon	353001	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630
Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent	VWR Chemicals	20821296	https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP
monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)	Cell Signalling Tech	#5741	Use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741
monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin	Sigma Aldrich	C2562	Use 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&region=BE
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	Affymetrix	19943	http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-11034	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor®%20488\%22$;;
Goat anti-mouse Alexa Fluor 594	Thermo Scientific	A-11032	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;
VECTASHIELD mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html
DPBS, with calcium and magnesium	Gibco	14040174	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133