استهدفت البلازما غشاء تسليم ومسعور الشحن مغلف في الكريستال السائل الجسيمات النانوية الناقل

Summary

واستغلت الكريستال السائل جسيمات متناهية الصغر (LCNP) nanocarrier كوسيلة لإيصال تسيطر عليها شحنة مسعور إلى غشاء البلازما من الخلايا الحية.

Abstract

والتسليم المراقب وكلاء المخدرات / التصوير للخلايا هو أمر حاسم لتطوير علاجات ولدراسة العمليات الإشارات الخلوية. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت النانوية (NPS) وعد كبير في تطوير نظم تسليم مثل هذه. هنا، وقد تم استخدام الكريستال السائل NP (LCNP) نظام تسليم المستندة للالتسليم المراقب صبغة غير قابلة للذوبان في الماء، 3،3'-dioctadecyloxacarbocyanine فوق كلورات (ديو)، من داخل نواة NP إلى المنطقة مسعور من البلازما غشاء طبقة ثنائية. خلال توليفة من مصادر القدرة النووية، تأسست الصبغة بكفاءة في صلب LCNP مسعور، وهو ما أكدته التحاليل الطيفية متعددة. الإقتران من مضاد للفيروسات الكولسترول مشتق إلى السطح NP (ديو-LCNP-PEG-تشول) تمكين الربط من مصادر القدرة النووية محملة صبغ إلى غشاء البلازما في كلوة 293T / 17 الخلايا. ليزر المسح المجهري متحد البؤر وفورستر نقل الطاقة الرنين وقت حل (الحنق) التصوير وأكد الممرإيف هروب رأس المال من ديو من صميم LCNP واندماجها طبقة ثنائية غشاء البلازما. وأخيرا، تقديم ديو باعتباره LCNP-PEG-تشول الموهن السمسة ديو. شكل NP ديو عرضت ~ 30-40٪ أقل سمية مقارنة ديو تسليمها _خالية من حل الجزء الأكبر. يوضح هذا النهج فائدة منصة LCNP كما طريقة فعالة لإيصال غشاء محددة وتعديل من الشحنات الجزيئية مسعور.

Introduction

منذ ظهور تفاعل المواد النانوية (المواد ≤100 نانومتر في بعد واحد على الأقل) مع الخلايا الحية، وكان هدف الاستمرار في الاستفادة من خصائص فريدة من نوعها تعتمد على حجم الجسيمات النانوية (NPS) لمختلف التطبيقات. وتشمل هذه التطبيقات الخلايا والأنسجة وصفها / التصوير (على حد سواء في التجارب المختبرية والحية)، والاستشعار في الوقت الحقيقي، والتسليم المراقب للمخدرات وغيرها من الشحنات ^1. ومن أمثلة هذه الخصائص NP ذات الصلة انبعاث تعتمد على حجم البلورات النانوية أشباه الموصلات (النقاط الكمومية، نقاط الكمية)؛ خصائص ضوئي؛ ضوحراري من جزيئات الذهب. قدرة التحميل كبيرة من جوهر مائي من الجسيمات الشحمية. والتوصيل الباليستية من المتآصلة الكربون، مثل الأنابيب النانوية الكربونية جدار واحد والجرافين.

وفي الآونة الأخيرة، ظهرت فائدة كبيرة في استخدام مصادر الطاقة النووية للتعديل تسيطر المخدرات والبضائع الأخرى، مثل التباين / التصوير لأيها السادة. هنا، فإن الأساس المنطقي هو أن يعزز إلى حد كبير / تحسين الذوبان الكلي، جرعة تسليمها، وقت الدورة الدموية، وإزالة في نهاية المطاف من شحن المخدرات من خلال تقديم أنها صيغة NP. وجاء ذلك ليكون المعروفة باسم تسليم المخدرات بوساطة NP (NMDD)، وهناك حاليا سبع وافقت ادارة الاغذية والعقاقير التركيبات الدوائية NP لاستخدامها في عيادة لعلاج مختلف أنواع السرطان ومئات أخرى في مراحل مختلفة من التجارب السريرية. في جوهرها، والهدف من ذلك هو "تحقيق المزيد بموارد أقل." وهذا هو، لاستخدام NP كما سقالة لتقديم المزيد من المخدرات مع الإدارات الجرعات أقل من خلال الاستفادة من مساحة كبيرة: حجم (على سبيل المثال، والجسيمات الصلبة، مثل نقاط الكمية وأكاسيد المعادن) من مصادر القدرة النووية أو حجم الداخلية كبيرة من أجل تحميل حمولات شحن كبيرة (على سبيل المثال، الجسيمات الشحمية أو المذيلات). والغرض هنا هو للحد من ضرورة لعدة الجرعات تسليمها بشكل منتظم وفي الوقت نفسه تعزيز الاستقرار المائي وتعزيز الدورة الدموية، وخاصة بالنسبة للتحدي الشحنات المخدرات مسعور أنه في حين فعالة للغاية، القابلة للذوبان لماما في الأوساط المائية.

وهكذا، كان الهدف من العمل الموصوفة هنا لتحديد إمكانية استخدام رواية NP سقالة للتسليم محددة ورقابة من الشحنات مسعور إلى محبة للدهون طبقة ثنائية غشاء البلازما. كان الدافع للعمل ذوبان محدود الكامنة وصعوبة في إيصال الجزيئات الكارهة للماء إلى خلايا من الأوساط المائية. عادة، وتسليم هذه الجزيئات الكارهة للماء يتطلب استخدام المذيبات العضوية (على سبيل المثال، دمس) أو السطحي محبة للجهتين (على سبيل المثال، Poloxamers)، التي يمكن أن تكون سامة وتسوية الخلايا والأنسجة الحيوية ^2، أو ناقلات مذيلة، الذي يمكن أن يكون محدودا تحميل الداخلي القدرات. كان الناقل NP اختار هنا رواية الكريستال السائل NP (LCNP) صياغة وضعت من قبل ³ والتي أثبتت في السابق لتحقيق ~ 40 أضعاف التحسن في كفاءة دوكسوروبيسين المخدرات المضادة للسرطان في الخلايا المستزرعة ^4.

في العمل الموصوفة هنا، كانت البضائع تمثيلية اختيار الجهدية غشاء صبغ، 3،3'-dioctadecyloxacarbocyanine فوق كلورات (ديو). ديو هو صبغة غير قابلة للذوبان المياه التي استخدمت لتقدمي والبحث عن المفقودين إلى الوراء في المعيشة والخلايا العصبية ثابتة، غشاء القياسات المحتملة، وغشاء العام وسم ^{5، 6، 7، 8، 9.} نظرا لطبيعتها مسعور، وعادة ما أضاف ديو مباشرة إلى الطبقات الوحيدة أو أنسجة الخلايا في شكل بلوري ^10، أو المحتضنة ذلك بتركيزات عالية جدا (~ 1-20 ميكرون) بعد التخفيف من محلول المخزون تركيز ^{11 و 12.}

محتوى "> هنا، كان نهج استخدام للمنصة LCNP، وأدرجت NP متعدد الوظائف الذي الداخلي الأساسي هو مسعور تماما والتي السطح هو ماء وقابلة للbioconjugation في وقت واحد، وسيلة لتسليم ديو. ديو في صلب LCNP خلال التوليف ، وسطح NP ثم يتم functionalized مع الكوليسترول شاردة مضاد للفيروسات لتعزيز غشاء ملزمة للفرقة ديو-LCNP إلى غشاء البلازما. أدى هذا النهج في نظام التسليم التي تقسم ديو في غشاء البلازما مع قدر أكبر من الدقة والإقامة الغشاء الوقت من شكل خال من ديو تسليم من حل الجزء الأكبر (ديو _مجاني). وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه الطريقة أن تسليم بوساطة LCNP ديو ينظم بشكل كبير ويدفع معدل تقسيم معين من الصبغة في محبة للدهون طبقة ثنائية الغشاء البلازمي، وهذا هو تحقق مع الحد بصورة متزامنة والسمية الخلوية للخال من المخدرات التي كتبها ~ 40٪ عن طريق تقديم أنها صيغة LCNP.

الحمار = "jove_content"> ومن المتوقع أن المنهجية الواردة في هذه الوثيقة ستكون قوية تقنية تمكن للباحثين الذين ينطوي أو يتطلب تسليم الخلوي من الشحنات مسعور للغاية القابلة للذوبان لماما أو غير قابلة للذوبان تماما في محلول مائي العمل.

Protocol

1. إعداد ديو-LCNP وديو-LCNP-PEG-تشول

1. حل السائل البلوري diacrylate عبر ربط وكيل (DACTP11، 45 ملغ)، 3،3'-dioctadecyloxacarbocyanine فوق كلورات (ديو، 2 ملغ)، والبادئ الجذور الحرة (azobisisobutyronitrile، 1 ملغ) عن البلمرة في 2 مل من الكلوروفورم. هذا إضافة إلى محلول مائي السطحي-functionalized اكريليت (AC10COONa، 13 ملغ في 7 مل).
2. يحرك الخليط لمدة 1 ساعة ويصوتن في 80٪ السعة لمدة 5 دقائق لإنتاج miniemulsion تتكون من قطرات صغيرة من المواد العضوية التي تحيط بها السطحي polymerizable في الماء.
3. حرارة الخليط إلى 64 درجة مئوية في حمام الزيت لبدء البلمرة كل من وكيل عبر ربط والسطحي مثل الكلوروفورم يتبخر ببطء، وترك تعليق NP ديو المحتوية على أن يستقر بها السطحي.
4. تصفية تعليق NP (3 مرات) من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون لإزالة أي التجميع. ستوإعادة الحل NP تصفيتها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
5. تصريف PEG-تشول إلى ديو-LCNP عبر اقتران EDC.
   1. حل تشول-PEG-NH ₂ · حمض الهيدروكلوريك (PEG-تشول، 0.9 ملم) في 25 ملي العازلة HEPES (7.0 درجة الحموضة).
   2. إعداد محلول العمل التي تحتوي على N-هيدروكسي sulfosuccinimide ملح الصوديوم (المرافق الوطنية للهيدرولوجيا، 40 ملم) و 1 إيثيل-3- (3- (dimethylamino) -propyl) carbodiimide هيدروكلوريد (EDC، 400 ملم) في المخزن HEPES من الحلول الأسهم المركزة.
   3. على الفور إضافة 20 ميكرولتر من محلول العمل الطازجة المرافق الوطنية للهيدرولوجيا / EDC إلى 1.0 مل من ديو-LCNP في المخزن HEPES ويقلب لمدة 5 دقائق.
   4. إضافة 20 ميكرولتر من محلول المخزون من تشول-PEG-NH ₂ · حمض الهيدروكلوريك إلى هذا الخليط ويقلب لمدة 2 ساعة.
   5. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة خليط التفاعل في أقصى سرعة (~ 2000 x ج) لمدة 30 ثانية باستخدام أجهزة الطرد المركزي الطاولة صغير وتمرير طاف من خلال PD-10 حجم الإقصاء اللوني العمود ¹³ معايرتها معDulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS، 0.1X).

2. توصيف ديو-LCNP وديو-LCNP-PEG-تشول

1. تأكيد نجاح الاقتران التساهمية PEG-تشول إلى السطح ديو-LCNP بواسطة الكهربائي للهلام.
   1. حل 0.5 غرام من الاغاروز في 50 مل (1X) من الكهربي تريس-بورات (TBE و 89 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 89 ملم حمض البوريك، و 2 ملي EDTA) العازلة. الحرارة الحل في فرن الميكروويف لإذابة الاغاروز. يسمح الحل ليبرد قليلا وتصب محتوياتها في لوحة هلام في المربع الكهربائي. إدراج مشط هلام لإنشاء آبار العينة.
   2. مرة واحدة وقد عززت هلام، إضافة المبلغ المطلوب (ما يكفي لغمر هلام في الغرفة) من TBE العازلة على التوالي إلى الغرفة.
   3. إضافة 35 ميكرولتر من عينة ديو-LCNP (المعدل مع الجلسرين، 5٪ ت / ت) لآبار جل وتشغيل لمدة 20 دقيقة في الجهد 110 V.
   4. صورة هلام باستخدام واي هلام نظام التصويرال الإثارة وانبعاث المرشحات في 488 نانومتر، و500-550 نانومتر، على التوالي.
2. تقييم حجم الجسيمات والتوزيع التي تشتت الضوء الحيوي (DLS) عن طريق تمييع الحل ديو-LCNP (تخفيف ~ 200 أضعاف) في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني ~ 8، 0.1X) وقياس على صك DLS ^14. قياس زيتا-إمكانات ديو-LCNPs باستخدام زيتا أداة قياس المحتملين المناسب.

3. إعداد خلية أطباق الثقافة للتجارب تسليم والتصوير

ملاحظة: يتم تنفيذ العلامات ديو-LCNP على كلوة 293T / 17 خلايا الكلى الجنينية البشرية (بين الممرات 5 و 15) التي هي مثقف كما هو موضح سابقا ^(4). إجراء التجارب تسليم والتصوير الخلية لاحقا كما هو موضح أدناه.

1. إعداد أطباق زراعة الأنسجة قطرها 35 ملم (مزودة 14 ملم إدراج رقم 1 ساترة) من قبل طلائها مع فبرونيكتين البقري (~ 100 ميكرولتر في تركيز 20 ميكروغرام/ مل) في DPBS لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
2. إزالة حل فبرونيكتين الطلاء من الطبق الثقافة. حصاد كلوة 293 T1 / 7 خلايا من القارورة T-25 عن طريق الغسيل الأول أحادي الطبقة الخلية مع 3 مل من DPBS ثم بإضافة 2 مل من التربسين-EDTA (0.5٪ التربسين 0.25٪ EDTA).
3. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 3 دقائق. إزالة التربسين-EDTA والعودة القارورة إلى حاضنة. مرة واحدة يتم فصل الخلايا من القارورة، تحييد التربسين بإضافة 4 مل من المتوسط ​​الشامل (Dulbecco لتعديل النسر المتوسط؛ DMEM، المعدل لاحتواء 10٪ مصل الجنين البقري، 5٪ البيروفات الصوديوم، و 5٪ مضاد حيوي / مضاد فطري) إلى قارورة . تحديد تركيز خلية في التعليق من اعدهم في عداد الخلية.
4. ضبط تركيز الخلية إلى ~ 8 × 10 ⁴ خلية / مل مع متوسط نمو. إضافة 3 مل من خلية إلى تعليق الطبق والثقافة في الحاضنة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وينبغي أن تكون الخلايا في ~ 70٪ confluency وينبغي أن تكون جاهزة للاستخدام. كافكثافة الخلية هو أمر حاسم لوضع العلامات قوي وفعال من نسبة عالية من الخلايا.

4. التسليم الخلوي ديو وديو-LCNPs والتصوير من الخلايا الثابتة

1. إعداد 1 مل حلول ديو، ديو-LCNP، وديو-LCNP-PEG-تشول في المتوسط تسليم (HEPES-DMEM؛ DMEM تحتوي على 25 ملي HEPES) عن طريق تمييع الحلول الأسهم ديو _الحرة وديو-LCNPs. وتركيزات ديو مناسبة لحضانة على الخلايا أن يكون ~ 1-10 ميكرومتر (معبرا عنها إما تركيز ديو _الحرة أو ديو في شكل ديو-LCNP).
2. إزالة المتوسطة النمو من الأطباق الثقافة باستخدام ماصة المصلية وغسل الطبقات الوحيدة الخلية (راجع الخطوة 3) مرتين مع HEPES-DMEM (2 مل كل غسل). أداء يغسل بإضافة بلطف وإزالة HEPES-DMEM باستخدام ماصة إلى / من على حافة الأطباق.
3. إضافة 0.2 مل من ديو حلول _خالية أو ديو-LCNP تسليم مستعدة لمركز أطباق ثقافة والعودة الأطباق إلى طncubator لفترة مناسبة من الوقت (عادة 15 أو 30 دقيقة، اعتمادا على احتياجات التجربة). حضانة مرات أطول إضافة إلى وضع العلامات الخلوي أكثر غير محدد من مجالات غير غشائي (على سبيل المثال، العصارة الخلوية).
4. بعد فترة الحضانة، وإزالة الحلول تسليم باستخدام ماصة المصلية. غسل الطبقات الوحيدة الخلية مرتين مع DPBS (2 مل كل غسل). أداء يغسل بإضافة بلطف وإزالة DPBS إلى / من على حافة الطبق.
5. إصلاح الطبقات الوحيدة الخلية باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ (المعد في DPBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   تنبيه: لامتصاص العرق غير قابل للاشتعال، مهيج الجهاز التنفسي، ويشتبه بأنها مسرطنة.
6. إزالة حل لامتصاص العرق باستخدام ماصة، ويغسل بلطف الخلايا 1 مرة مع DPBS (2 مل) من خلال إضافة وإزالة DPBS باستخدام ماصة لل/ من على حافة الأطباق.
7. الخلايا الثابتة هي جاهزة للتصوير لوجود إشارة مضان الغشائي باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤرالمجهري (CLSM). إجراء التصوير على الفور، أو بدلا من ذلك، استبدل المتوسطة مع DPBS تحتوي على 0.05٪ نان ₃ وتخزين الأطباق في 4 درجات مئوية.
   تنبيه: نان ₃ غير سامة. توخي الحذر الشديد عند استخدام نان _3.
   ملاحظة: الثابتة العينات المخزنة بهذه الطريقة يجب تصويرها خلال 48 ساعة من أجل تحقيق النتائج المثلى.

5. التسليم الخلوي ديو وديو-LCNPs والحنق التصوير في الخلايا الحية

ملاحظة: في هذه الطريقة، colabeled الخلايا مع 6 ميكرومتر كل ديو-LCNP-PEG-تشول (حيث ديو هو المانحة الحنق) و1،1'-dioctadecyl-3،3،3 "، بيركلورات 3'-tetramethylindocarbocyanine (صلاح الغيدان _مجانا، حيث الجاذبة هو متقبل الحنق). ويؤكد الافراج عن ديو من ديو-LCNP-PEG-تشول وإدماجه في غشاء البلازما من قبل الزيادة الملحوظة في نقل الطاقة من المانحين ديو إلى متقبل الجاذبة.

1. خلايا التسمية بالتتابع مع ديو-LCNP-PEG-تشول والجاذبة _{الصحائف}البريد باستخدام الطريقة الموضحة في الخطوة 4.
2. بعد التلوين، وغسل الخلايا 1 مرة مع DPBS (2 مل) باستخدام ماصة المصلية واستبدال غسل العازلة مع 2 مل من محلول التصوير الخلية الحية (LCIS).
3. على خشبة المسرح المجهر مجهزة غرفة الحضانة ساخنة، صورة عينة الخلايا الحية باستخدام المجهر متحد البؤر (الهدف 60X) مع تكوين الحنق التصوير في 30 فترات دقيقة على مدى 4 ساعات بواسطة مثير المتبرع ديو في 488 نانومتر، وجمع الانبعاثات الكامل أطياف من كل من الجهات المانحة ديو ومتقبل الجاذبة 490-700 نانومتر مع الطيف للكشف عن 32 قناة.
4. ملاحظة: للحصول على مزيد من المعلومات حول التصوير الحنق، يرجى أنظر المرجع ^15.
5. تحديد كثافة الانبعاثات وقت حل كل من الجهات المانحة ديو ومتقبل الجاذبة من خلايا ملطخة ديو-LCNP-PEG-تشول والجاذبة. حساب متقبل / المانحة وقت حل الحنق نسبة (الجاذبة _EMI / ديو _EMI) للصور، والتي سوف تزيد باطراد، وفي نهاية المطاف لوحةاو مرة واحدة كمية من ديو المانحة قسمت إلى الغشاء قد وصل إلى أقصى ^16.

6. السمسة الفحص ديو وديو-LCNPs إلى كلوة 293T / 17 خلايا

ملاحظة: يتم تقييم السمية الخلوية من المواد ديو-LCNP باستخدام انتشار فحص ¹⁷ صبغية-نتروبلو. الخلايا المستزرعة في لوحة multiwell في وجود تركيزات مختلفة من المواد في ظل الظروف التي تحاكي التسليم / وضع العلامات. ثم يتم تربيتها الخلايا لمدة 72 ساعة للسماح للانتشار. صبغة (MTS، (3- (4،5-dimethylthiazol-2-YL) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-نتروبلو) ثم يتم إضافته إلى الآبار، وتنشط عملية الأيض خلايا تحويل الصبغة إلى منتج formazan الأزرق، وكمية من تشكيل اللون يتناسب طرديا مع عدد من خلايا قابلة للحياة.

1. حصاد كلوة 293 T1 / 7 خلايا من القارورة T-25 عن طريق اتباع الإجراء الموضح في الخطوة 3.2.Seedكلوة 293T 17 خلية / (5000 خلية / 100 ميكرولتر / جيد) إلى آبار لوحة 96-جيدا المعالجة زراعة الأنسجة والثقافة لمدة 24 ساعة.
2. تماما إزالة وسائل الإعلام والثقافة من الآبار باستخدام micropipette وإضافة 50 ميكرولتر من HEPES-DMEM تحتوي على ديو _الحرة، ديو-LCNPs، أو ديو-LCNP-PEG-تشول إلى زيادة تركيزات لتكرار الآبار. احتضان على الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: عادة، ويكرر ذلك في ثلاث نسخ أو quadruplicate كافية لتكشف عن بيانات موثوقة إحصائيا.
   1. بعد الحضانة، وإزالة المتوسطة تسليم تحتوي على مواد باستخدام micropipette واستبدالها مع 100 ميكرولتر من متوسط ​​النمو. ثقافة الخلايا لمدة 72 ساعة.
3. إضافة 20 ميكرولتر من الركيزة نتروبلو إلى كل بئر، والعودة إلى لوحة الحاضنة، والسماح بتشكيل اللون بالمضي قدما عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. قراءة الامتصاصية (ABS) من الناتج formazan في 570 نانومتر (الدنيا امتصاص لديو-LCNPs المستخدمة في هذا ستودى) و 650 نانومتر (لالطرح الامتصاصية الخلفية غير محددة) باستخدام قارئ وحة microtiter.
4. رسم القيمة التفاضلية الامتصاصية (القيمة المطلقة ₅₇₀ - القيمة المطلقة ₆₅₀₎ مقابل تركيز المواد وتقديم تقرير عن نتائج كنسبة مئوية من تكاثر الخلايا السيطرة (درجة انتشار الخلايا في خلية ثقافة المتوسط فقط).

تحليل 7. البيانات

1. إحصائية تحليل البيانات مع تحليل أحادي المتغير التباين (ANOVA). للمقارنات المتعددة، وتطبيق اختبار بونفيروني وخاصة في مرحلة ما بعد. توفير كافة القيم المتوسطة كما ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) مالم يذكر غير ذلك.
   وكانت احتمال مقبول لأهمية ف <0.05: ملاحظة.

النتائج

أعدت LCNPs التي تم تحميلها جوهر مسعور من NP مع ممثل غشاء وضع العلامات التحقيق لإثبات فائدة من LCNP باعتباره وسيلة فعالة لتقديم الشحنات مسعور. لهذا الغرض، وكانت البضائع اختيار عالية غير قابلة للذوبان في الماء الجهدية غشاء وضع العلامات صبغ، ديو. تم توليفها LCNPs تحميل ديو (ديو-...

Discussion

هدف استمرار NMDD هو استهداف للرقابة وتسليم التركيبات الدوائية إلى الخلايا والأنسجة، جنبا إلى جنب مع متزامنة تحسين فعالية الدواء. واحد فئة معينة من جزيئات الدواء التي قد يشكلها هذا تحديا كبيرا هو مسعور وكلاء الأدوية / التصوير التي لديها لماما دون الذوبان في الوسط المائ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA)	ThermoFisher	E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO)	Sigma Aldrich	D4292-20MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride	Nanocs, Inc.	PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter	ThermoFisher	C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	ThermoFisher	14040182	Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma	ThermoFisher	33010018	Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V)	ThermoFisher	28906	Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17)	American Type Culture Collection	ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS)	ThermoFisher	A14291DJ	Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS)	ThermoFisher	24510
Nikon A1si spectral confocal microscope	Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)	ThermoFisher	T10282	mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor	Sonics and Materials Inc	GEX 600-5
Mini Cetntrifuge	Benchmark	Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium	GE Healthcare	17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System	Bio-RAD	76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056