Targeted membrana plasmatica di consegna di un idrofobo Cargo incapsulato in un cristallo nanoparticelle Carrier Liquid

Riepilogo

Un cristallo liquido nanoparticella (LCNP) nanocarrier viene sfruttato come veicolo per l'erogazione controllata di un carico idrofoba sulla membrana plasmatica delle cellule viventi.

Abstract

L'erogazione controllata di agenti droga / imaging per cellule è critico per lo sviluppo di terapie e per lo studio dei processi di segnalazione cellulare. Recentemente, le nanoparticelle (NP) hanno mostrato significativa promessa per lo sviluppo di tali sistemi di consegna. Qui, un cristallo liquido NP (LCNP) sistema di erogazione sede è stato impiegato per l'erogazione controllata di un colorante insolubile in acqua, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO), all'interno del nucleo NP alla regione idrofobica di un plasma doppio strato di membrana. Durante la sintesi delle nanoparticelle, il colorante è stato efficacemente incorporato nel nucleo LCNP idrofobico, come confermato da analisi spettroscopica multiple. Coniugazione di un colesterolo derivato PEGylated alla superficie NP (Dio-LCNP-PEG-Chol) ha consentito il legame delle NP dye-caricato alla membrana plasmatica in HEK 293T / 17 cellule. Risolta in tempo scansione laser confocale microscopia e Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) di imaging ha confermato il passaggioive efflusso di DiO dal nucleo LCNP e il suo inserimento nel doppio strato membrana plasmatica. Infine, la consegna della DIO come LCNP-PEG-Chol attenuato la citotossicità della DIO; la forma NP della DIO esposto ~ 30-40% in meno tossicità rispetto al DiO _gratuito consegnato dalla soluzione di massa. Questo approccio dimostra l'utilità della piattaforma LCNP come una modalità efficace per la fornitura specifica membrana e modulazione dei carichi molecolari idrofobiche.

Introduzione

Dal momento che l'avvento di interfacciarsi nanomateriali (materiali ≤100 nm in almeno una dimensione) con cellule viventi, un obiettivo costante è stato quello di sfruttare le proprietà uniche dipendenti dalle dimensioni delle nanoparticelle (NPS) per varie applicazioni. Queste applicazioni comprendono cellule e tessuti etichettatura / immagini (sia in vitro che in vivo), rilevamento in tempo reale, e l'erogazione controllata di farmaci e altri carichi ^1. Esempi di tali importanti proprietà NP includono l'emissione dipendente dalle dimensioni dei nanocristalli semiconduttori (punti quantici, QD); le proprietà fototermiche di nanoparticelle d'oro; la grande capacità di carico del nucleo acquosa di liposomi; e la conduttività balistica allotropi di carbonio, come nanotubi di carbonio a parete singola e grafene.

Più recentemente, notevole interesse è sorto nell'uso delle NP per la modulazione controllato di farmaci e altri carichi, come contrasto / dell'imaging unsignori. Qui, la logica è quella di migliorare in modo significativo / ottimizzare la solubilità generale, la dose erogata, tempo di circolazione, e la clearance eventuale del carico di droga consegnandola come una formulazione NP. Questo è venuto per essere conosciuta come la somministrazione di farmaci NP-mediata (NMDD), e ci sono attualmente sette approvati dalla FDA NP formulazioni farmaceutiche per l'uso in clinica per il trattamento di vari tipi di cancro e di altre centinaia in varie fasi di sperimentazione clinica. In sostanza, l'obiettivo è quello di "ottenere di più con meno;" cioè, di utilizzare la NP come impalcatura per fornire più farmaci con minori amministrazioni dosaggio sfruttando la grande superficie: volume (per esempio, particelle dure, come QD e ossidi metallici) di NP o loro grande volume interno di carico grandi payload carico (ad esempio, liposomi o micelle). Lo scopo è quello di ridurre la necessità di diversi regimi di dosaggio sistemicamente consegnati mentre allo stesso tempo promuovere stabilità acquosa e una maggiore circolazione, in particolare perimpegnativi carichi di droga idrofobiche che, pur altamente efficace, sono moderatamente solubile in ambiente acquoso.

Pertanto, l'obiettivo del lavoro qui descritto era di determinare la possibilità di utilizzare un nuovo NP scaffold per l'erogazione specifica e controllata di carichi idrofobi al doppio strato membrana plasmatica lipofilo. La motivazione per il lavoro era la limitata solubilità intrinseca e difficoltà nella consegna di molecole idrofobe alle cellule da mezzi acquosi. Tipicamente, la consegna di tali molecole idrofobe richiede l'uso di solventi organici (ad esempio, DMSO) o tensioattivi anfifilici (ad esempio, poloxamers), che possono essere di cellule e tessuti redditività tossici e di compromesso ^2, o portatori di micella, che può hanno limitato carico interno capacità. Il vettore NP scelta qui è stato un cristallo liquido NP (LCNP) formulazione romanzo sviluppato in precedenza ³ e che era stato mostrato in precedenza per ottenere un ~ 40 volte miglioramento nell'efficacia della antitumorale doxorubicina farmaco in cellule coltivate ^4.

Nel lavoro qui descritto, il carico rappresentante scelto era il colorante membrana potenziometrico, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO). DiO è un colorante insolubile in acqua che è stata utilizzata per anterograda e tracciatura retrograda nel potenziale di membrana misurazioni neuroni fissi vita e, e per membrane generale etichettatura ^{5, 6, 7, 8, 9.} Grazie alla sua natura idrofoba, DiO è tipicamente aggiunto direttamente monostrati di cellule o tessuti in una forma cristallina ^10, oppure viene incubata a concentrazioni molto elevate (~ 1-20 micron) dopo la diluizione da una soluzione di concentrazione magazzino ^{11, 12.}

content "> uso Qui, l'approccio è stato alla piattaforma LCNP, un NP multifunzionale il cui nucleo interno è completamente idrofobico e la cui superficie è simultaneamente idrofila e suscettibili di bioconjugation, come veicolo di consegna per DiO. DiO è incorporato nel nucleo LCNP durante la sintesi , e la superficie NP viene funzionalizzato con un colesterolo frazione PEGylated promuovere la membrana vincolante dell'insieme DiO-LCNP alla membrana plasmatica. Questo approccio ha portato a un sistema di erogazione che partizionato DIO nella membrana plasmatica con maggiore fedeltà e residenza membrana volta che la forma libera della DIO consegnato dalla soluzione di massa (DIO _gratuito). Inoltre, questo metodo ha dimostrato che la consegna LCNP-mediata della DIO modula in modo sostanziale e spinge il tasso di specifica partizionamento del colorante nel doppio strato membrana plasmatica lipofila. questo è raggiunto mentre contemporaneamente riducendo la citotossicità del farmaco libero da ~ 40% consegnandola come una formulazione LCNP.

Si prevede che la metodologia qui descritta sarà una potente tecnica che consente ai ricercatori il cui lavoro comporta o richiede la consegna cellulare di carichi altamente idrofobici che sono poco solubili o insolubili completamente in soluzione acquosa.

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Protocollo

1. Preparazione di Dio-LCNP e Dio-LCNP-PEG-Chol

1. Sciogliere liquido diacrilato cristallina agente reticolante (DACTP11, 45 mg), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO, 2 mg), e un iniziatore radicale libero (azobisisobutirronitrile, 1 mg) per la polimerizzazione in 2 ml di cloroformio. Aggiungere questo ad una soluzione acquosa di tensioattivo acrilato-funzionalizzato (AC10COONa, 13 mg in 7 ml).
2. Mescolare la miscela per 1 ora e sonicare all'80% ampiezza per 5 minuti per produrre una miniemulsion composto di piccole goccioline di materiale organico circondato da tensioattivo polimerizzabile in acqua.
3. Riscaldare la miscela a 64 ° C in un bagno d'olio di avviare la polimerizzazione sia l'agente tensioattivo e reticolazione come cloroformio evapora lentamente, lasciando una sospensione NP DiO contenente che viene stabilizzato dal tensioattivo.
4. Filtrare la sospensione NP (3 volte) attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron per rimuovere eventuali aggregazione. Store la soluzione NP filtrata a 4 ° C fino all'utilizzo.
5. Coniugazione del PEG-Chol a DIO-LCNP tramite accoppiamento EDC.
   1. Sciogliere Chol-PEG-NH ₂ · HCl (PEG-Chol, 0.9 mM) in 25 mM tampone HEPES (pH 7,0).
   2. Preparare una soluzione di lavoro contenente N-idrossi-sulfosuccinimide sale sodico (NHSs, 40 mm) e 1-etil-3- (3- (dimetilammino) propil) carbodiimmide cloridrato (EDC, 400 mm) in tampone HEPES da soluzioni di riserva concentrate.
   3. Aggiungere immediatamente 20 ml di soluzione di lavoro preparata al momento di NHSs / EDC a 1,0 ml di Dio-LCNP in tampone HEPES e mescolare per 5 min.
   4. Aggiungere 20 ml di soluzione madre di Chol-PEG-NH ₂ · HCl a questa miscela e mescolare per 2 ore.
   5. Centrifugare brevemente la miscela di reazione alla massima velocità (~ 2.000 xg) per 30 secondi usando un mini centrifuga da tavolo e passare il surnatante con una PD-10 dimensione di colonna cromatografia di esclusione ¹³ equilibrata conPBS Dulbecco (DPBS, 0.1x).

2. Caratterizzazione di Dio-LCNP e Dio-LCNP-PEG-Chol

1. Confermare il covalente coniugazione di successo di PEG-Chol alla superficie DIO-LCNP mediante elettroforesi su gel.
   1. Sciogliere 0.5 g di agarosio in 50 ml (1x) di tris-borato elettroforesi (TBE, 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM di acido borico, e 2 mM EDTA) buffer. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde per sciogliere l'agarosio. Lasciare che la soluzione per raffreddare leggermente e versare il contenuto in una piastra di gel nella casella di elettroforesi. Inserire un pettine gel per creare pozzetti dei campioni.
   2. Una volta che il gel è solidificato, aggiungere la quantità necessaria (basta immergere il gel nella camera) di TBE tampone di corsa alla camera.
   3. Aggiungere 35 ml di campione DiO-LCNP (modificato con glicerolo, 5% v / v) ai pozzetti del gel e correre per 20 minuti a una tensione di 110 V.
   4. Immagine il gel utilizzando una connessione Wi sistema di imaging geleccitazione ed emissione filtri th a 488 nm e 500-550 nm, rispettivamente.
2. Valutare la dimensione delle particelle e la distribuzione dalla dispersione della luce dinamica (DLS) diluendo la soluzione di Dio-LCNP (diluizione ~ 200 volte) in PBS (pH ~ 8, 0.1x) e misurare su uno strumento DLS ^14. Misurare la zeta-potenziale del Dio-LCNPs utilizzando un potenziale strumento di misura zeta adeguato.

3. Preparazione di colture cellulari piatti per gli esperimenti di consegna e imaging

NOTA: etichettatura DIO-LCNP viene eseguita su HEK 293T / 17 cellule renali di embrioni umani (tra i passaggi 5 e 15), che sono coltivate come descritto in precedenza ^4. Eseguire gli esperimenti di consegna e l'imaging cellulare successiva come descritto di seguito.

1. Preparare 35 mm piastre di coltura tissutale diametro (dotati di inserti No. 1 vetrose 14 mm) mediante rivestimento con fibronectina bovina (~ 100 microlitri ad una concentrazione di 20 ug/ Ml) in DPBS per 2 ore a 37 ° C.
2. Rimuovere la soluzione di rivestimento fibronectina dal piatto cultura. Harvest HEK 293 T1 / 7 cellule dal matraccio T-25 di primo lavaggio il monostrato cellulare con 3 ml di DPBS e poi aggiungendo 2 ml di tripsina-EDTA (0,5% tripsina-EDTA 0,25%).
3. Incubare la beuta a 37 ° C per ~ 3 min. Rimuovere la tripsina-EDTA e riportare il pallone al incubatore. Una volta che le cellule vengono staccate dal pallone, neutralizzare la tripsina aggiungendo 4 ml di mezzo completo (Dulbecco Modified Eagle Medium; DMEM, modificato per contenere il 10% di siero fetale bovino, 5% sodio piruvato, e 5% di antibiotico / antimicotico) al pallone . Determinare la concentrazione cellulare nella sospensione da essi contando in un contaglobuli.
4. Regolare la concentrazione cellulare a ~ 8 x 10 ⁴ cellule / ml con terreno di coltura. Aggiungere 3 ml di sospensione cellulare al piatto e alla cultura in incubatrice durante la notte; Il giorno successivo, le cellule devono essere a ~ 70% di confluenza e dovrebbe essere pronto per l'uso. Adeguatodensità delle cellule è critico per l'etichettatura robusto ed efficiente di una elevata percentuale di cellule.

4. Consegna cellulare della DIO e DIO-LCNPs e imaging di cellule fissate

1. Preparare 1 ml di soluzioni della DIO, DIO-LCNP, e Dio-LCNP-PEG-Chol a mezzo di consegna (HEPES-DMEM; DMEM contenente 25 mM HEPES) diluendo soluzioni di riserva della DIO _gratuito e DIO-LCNPs; adeguate concentrazioni di DIO per l'incubazione di cellule saranno ~ 1-10 micron (espresso come sia la concentrazione di DiO _libero o DiO in forma di Dio-LCNP).
2. Rimuovere il terreno di crescita dalle piastre di coltura con una pipetta sierologica e lavare i monostrati cellulari (vedi punto 3) due volte con HEPES-DMEM (2 ml ogni lavaggio). Eseguire i lavaggi aggiungendo delicatamente e rimuovere HEPES-DMEM con una pipetta a / da bordo dei piatti.
3. Aggiungere 0,2 ml delle soluzioni preparate _la consegna _gratuita o DIO-LCNP DIO al centro dei piatti della cultura e restituire i piatti per l'incubator per un congruo periodo di tempo (tipicamente 15 o 30 minuti, a seconda delle esigenze dell'esperimento). Tempi di incubazione più lunghi aggiungono all'etichettatura cellulare più non specifico di aree non membranose (ad esempio, citoplasma).
4. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le soluzioni di consegna con una pipetta sierologica. Lavare i monostrati cellulari due volte con DPBS (2 ml ogni lavaggio). Eseguire i lavaggi aggiungendo delicatamente e rimuovere DPBS al / dal bordo del piatto.
5. Fissare i monostrati cellulari utilizzando 4% paraformaldeide (preparato in DPBS) per 15 min a temperatura ambiente.
   ATTENZIONE: Paraformaldeide è infiammabile, irritante delle vie respiratorie, e un sospetto cancerogeno.
6. Rimuovere la soluzione paraformaldeide con una pipetta e lavare delicatamente le cellule 1 volta con DPBS (2 ml) con l'aggiunta e la rimozione di DPBS usando pipetta da / per il bordo dei piatti.
7. Le cellule fissate sono pronte per essere ripreso per la presenza di un segnale di fluorescenza membranosa usando scansione laser confocalemicroscopia (CLSM). Eseguire imaging immediatamente o, in alternativa, sostituire il mezzo con DPBS contenente 0,05% NaN ₃ e memorizzare i piatti a 4 ° C.
   ATTENZIONE: NaN ₃ è tossico; prestare la massima attenzione quando si usano NaN _3.
   NOTA: fisso campioni conservati in questo modo devono essere esposte entro 48 ore per ottenere risultati ottimali.

5. Consegna cellulare della DIO e DIO-LCNPs e FRET imaging in cellule vive

NOTA: In questo metodo, le cellule sono colabeled con 6 micron ogni Dio-LCNP-PEG-Chol (dove DiO è un donatore FRET) e 1,1'-diottadecil-3,3,3 ', 3'-perclorato tetramethylindocarbocyanine (DII _libero, dove DII è un accettore FRET). Il rilascio della DIO da Dio-LCNP-PEG-Chol e la sua integrazione nella membrana plasmatica è confermata da un incremento osservato nel trasferimento di energia dal donatore DiO al accettore DII.

1. Cellule Label sequenzialmente con Dio-LCNP-PEG-Chol e DII _free con il metodo descritto al punto 4.
2. Dopo la colorazione, lavare le cellule 1 volta con DPBS (2 ml) con una pipetta sierologica e sostituire il tampone di lavaggio con 2 ml di soluzione di imaging cellulare dal vivo (LCI).
3. Su un palco microscopio dotato di una camera di incubazione riscaldata, immagine campione cellulare diretta utilizzando un microscopio confocale (obiettivo 60X) con una configurazione di imaging FRET ad intervalli di 30 min per un periodo di 4 ore eccitando donatore DiO a 488 nm e la raccolta di emissione completa spettri del donatore DiO e l'accettore DII dal 490-700 nm con un rivelatore spettrale a 32 canali.
4. NOTA: Per ulteriori informazioni sulle immagini FRET, vedere riferimento ^15.
5. Determinare l'intensità di emissione risolta in tempo del donatore DiO e l'accettore DII da cellule colorate con Dio-LCNP-PEG-Chol e DII. Calcolare il tempo-risolta accettore / donatore FRET rapporto (DII _emi / DIO _EMI) per le immagini, che sarà in costante aumento e, infine, piattoau volta la quantità di DiO donatore partizionato nella membrana ha raggiunto un massimo ^16.

6. citotossicità Assay della DIO e DIO-LCNPs alle HEK 293T / 17 celle

NOTA: la citotossicità dei materiali Dio-LCNP è valutato attraverso un saggio di proliferazione a base dye tetrazolio ^17. Le cellule sono coltivate in una piastra multipozzetto in presenza di concentrazioni variabili di materiali in condizioni che emulano consegna / etichettatura. Le cellule vengono quindi coltivate per 72 ore per permettere la proliferazione. Un colorante (MTS, (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-solfofenil) -2H-tetrazolio) viene poi aggiunto ai pozzetti e metabolicamente attiva cellule convertono il colorante in un prodotto formazano blu. la quantità di formazione di colore è direttamente proporzionale al numero di cellule vitali.

1. Harvest HEK 293 T1 / 7 cellule dal pallone T-25 seguendo la procedura descritta nella fase 3.2.SeedHEK 293T / 17 celle (5.000 cellule / 100 pl / pozzetto) ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti tessuto cultura coltura trattata e per 24 ore.
2. Rimuovere completamente il terreno di coltura dai pozzi usando una micropipetta e aggiungere 50 ml di HEPES-DMEM contenenti DiO _libera, Dio-LCNPs, o Dio-LCNP-PEG-Chol a concentrazioni crescenti di replicare i pozzi. Incubare le cellule a 37 ° C per 30 min.
   NOTA: in genere, di repliche fatto in triplice copia o quadruplicato sono sufficienti per produrre dati statisticamente attendibili.
   1. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno consegna contenente i materiali utilizzando una micropipetta e sostituirlo con 100 ml di mezzo di crescita. Coltivare le cellule per 72 ore.
3. Aggiungere 20 ml di substrato tetrazolio in ogni pozzetto, riportare la piastra per l'incubatore e consentire la formazione di colore di procedere a 37 ° C per 4 ore. Leggere l'assorbanza (ABS) del prodotto formazano a 570 nm (minimi assorbimento per la DIO-LCNPs utilizzati in questo study) e 650 nm (per sottrazione di fondo non specifica assorbanza) utilizzando un lettore di micropiastre.
4. Tracciare il valore della differenza di assorbanza (ass ₅₇₀ - abs ₆₅₀₎ in funzione della concentrazione di materiale e riferire i risultati come percentuale della proliferazione delle cellule di controllo (grado di proliferazione delle cellule in terreno di coltura cellulare solo).

Analisi 7. I dati

1. Statisticamente analizzare i dati con un'analisi univariata della varianza (ANOVA). Per confronti multipli, applicare prova hoc posto del Bonferroni. Fornire tutti i valori medi ± errore standard della media (SEM), se non diversamente indicato.
   NOTA: La probabilità accettabile per significato era p <0.05.

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Risultati

LCNPs sono stati preparati in cui il nucleo idrofobico del NP è stato caricato con una sonda membrana etichettatura rappresentante per dimostrare l'utilità del LCNP come veicolo consegna efficiente per carichi idrofobiche. A questo scopo, il carico scelto è stato il potenziometrica colorante membrana etichettatura altamente insolubile in acqua, DiO. LCNPs DiO-caricati (DIO-LCNPs) sono stati sintetizzati utilizzando una tecnica mini-emulsione a due fasi con i componenti chimici DACTP11, AC10COONa e DiO, come mostr...

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Discussione

Un obiettivo costante di NMDD è il targeting e l'erogazione controllata di formulazioni di farmaci a cellule e tessuti, in combinazione con contestuale miglioramento della efficacia del farmaco. Una specifica classe di molecole di farmaco per il quale questa ha posto una sfida significativa è idrofobe agenti farmaci / imaging che hanno parsimonia per non solubilità in mezzi acquosi. Questo problema ha afflitto la transizione di potenti farmaci da sistemi di coltura cellulare in vitro per l'i...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA)	ThermoFisher	E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO)	Sigma Aldrich	D4292-20MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride	Nanocs, Inc.	PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter	ThermoFisher	C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	ThermoFisher	14040182	Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma	ThermoFisher	33010018	Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V)	ThermoFisher	28906	Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17)	American Type Culture Collection	ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS)	ThermoFisher	A14291DJ	Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS)	ThermoFisher	24510
Nikon A1si spectral confocal microscope	Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)	ThermoFisher	T10282	mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor	Sonics and Materials Inc	GEX 600-5
Mini Cetntrifuge	Benchmark	Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium	GE Healthcare	17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System	Bio-RAD	76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056