Targeted Plasma Membrane Livraison d'un Hydrophobe Cargo encapsulé dans un cristal liquide Nanoparticules Transporteur

Résumé

Un cristal liquide nanoparticule (LCNP) nanocarrier est exploitée en tant que véhicule pour la libération contrôlée d'une cargaison hydrophobe à la membrane plasmique de cellules vivantes.

Résumé

La libération contrôlée d'agents de médicament / d'imagerie vers les cellules est critique pour le développement de thérapies et pour l'étude des processus de signalisation cellulaire. Récemment, des nanoparticules (NP) ont montré prometteur dans le développement de ces systèmes de livraison. Ici, un NP (LCNP), système de délivrance à base de cristaux liquides a été utilisé pour la distribution contrôlée d'un colorant insoluble dans l'eau, le 3,3'-perchlorate dioctadecyloxacarbocyanine (DIO), à l'intérieur du noyau NP dans la région hydrophobe d'un plasma bicouche membranaire. Lors de la synthèse des PN, le colorant est efficacement incorporé dans le coeur de LCNP hydrophobe, tel que confirmé par analyse spectroscopique multiples. Conjugaison d'un dérivé du cholestérol pégylé à la surface NP (DiO LCNP-PEG-Chol) a permis la liaison du PN chargées de colorant sur la membrane plasmatique dans des cellules HEK 293T / 17 cellules. Résolue en temps laser microscopie confocale et Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) imagerie a confirmé le passageive efflux de DiO du noyau LCNP et son insertion dans la bicouche de la membrane plasmique. Enfin, la livraison de DiO comme LCNP-PEG-Chol atténué la cytotoxicité de DiO; la forme NP de DiO présentait ~ 30-40% moins de toxicité par rapport à DiO _libre délivré de solution en vrac. Cette approche démontre l'utilité de la plate-forme LCNP comme modalité efficace pour la prestation spécifique à membrane et la modulation des cargaisons moléculaires hydrophobes.

Introduction

Depuis l'avènement de l'interfaçage nanomatériaux (matériaux ≤100 nm dans au moins une dimension) avec des cellules vivantes, un objectif constant a été de tirer parti des propriétés de taille dépendant uniques des nanoparticules (NPs) pour diverses applications. Ces applications comprennent l' étiquetage cellulaire et tissulaire / imagerie (in vitro et in vivo), la détection en temps réel, et la livraison contrôlée de médicaments et d' autres cargaisons ^1. Des exemples de ces propriétés NP pertinents comprennent l'émission dépendant de la taille des nanocristaux semi-conducteurs (quantum dots, QD); les propriétés photothermiques de nanoparticules d'or; la grande capacité de chargement du coeur aqueux des liposomes; et la conductivité balistique des allotropes de carbone, tels que les nanotubes de carbone à paroi unique et graphène.

Plus récemment, un intérêt significatif a été soulevée dans l'utilisation des IP pour la modulation contrôlée de médicaments et d'autres cargaisons, tels que le contraste / imagerie d'ungents. Ici, la raison d'être est d'améliorer de manière significative / optimiser la solubilité dans l'ensemble, la dose administrée, le temps de circulation, et la clairance éventuelle de la cargaison de drogue en le remettant en formulation NP. Ceci est venu à être connu comme la délivrance de médicaments NP-médiée (NMDD), et il y a actuellement sept formulations de médicaments NP approuvés par la FDA pour une utilisation dans la clinique pour traiter divers cancers et des centaines d'autres à divers stades d'essais cliniques. En substance, l'objectif est de «faire plus avec moins;" qui est, d'utiliser le NP comme un échafaudage pour offrir plus de médicament avec moins administrations de dosage en tirant parti de la grande surface: volume (par exemple, des particules dures, telles que QDs et oxydes métalliques) de NPs ou de leur grand volume intérieur pour le chargement grandes charges utiles de marchandises (par exemple, des liposomes ou micelles). Le but ici est de réduire la nécessité de multiples schémas posologiques systématiquement livrés en même temps la promotion de la stabilité aqueuse et la circulation améliorée, en particulier pourcargaisons de médicaments hydrophobes difficiles qui, bien que très efficace, peu solubles dans les milieux aqueux.

Ainsi, l'objectif du travail décrit ici était de déterminer la viabilité de l'utilisation d'un roman NP échafaudage pour la livraison spécifique et contrôlée de cargaisons hydrophobes à la lipophile bicouche de la membrane plasmique. La motivation pour le travail était la solubilité limitée inhérente et de la difficulté dans la fourniture de molécules hydrophobes à des cellules de milieux aqueux. Typiquement, la livraison de ces molécules hydrophobes nécessite l'utilisation de solvants organiques (par exemple, DMSO) ou des tensioactifs amphiphiles (par exemple, poloxamères), qui peuvent être toxiques et de compromis cellulaire et tissulaire viabilité ^2, ou des supports de micelles, ce qui peut avoir limité le chargement interne capacités. Le transporteur NP choisi ici est un cristal liquide NP (LCNP) formulation nouvelle développée précédemment ³ et qui avait été montré précédemment pour atteindre un facteur 40 ~ l' amélioration de l'efficacité du médicament anticancéreux doxorubicine dans des cellules cultivées ^4.

Dans le travail décrit ici, la cargaison représentant choisi était le potentiométrique colorant membranaire, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DIO). DiO est un colorant insoluble dans l'eau qui a été utilisée pour antérograde et rétrograde traçage dans les neurones vivants et fixes, les mesures du potentiel de membrane, et la membrane générale étiquetage ^{5, 6, 7, 8, 9.} En raison de sa nature hydrophobe, DiO est typiquement ajouté directement aux monocouches cellulaires ou des tissus sous une forme cristalline ^10, ou elle est incubée à des concentrations très élevées (~ 1-20 uM) après dilution à partir d' une solution de concentration d'actions ^{11, 12.}

content "> Ici, l'approche est l'utilisation de la plate-forme LCNP, un NP multifonctionnel dont le noyau intérieur est totalement hydrophobe et dont la surface est simultanément hydrophile et prête à bioconjugaison, comme un véhicule de livraison pour DiO. DiO est incorporé dans le noyau LCNP lors de la synthèse , et la surface NP est alors fonctionnalisé avec une fraction de cholestérol pégylé pour promouvoir la liaison de la DiO-LCNP ensemble à la membrane plasmique membrane. Cette approche a abouti à un système de distribution qui partage la DiO dans la membrane du plasma avec une plus grande fidélité et la résidence de la membrane temps que la forme libre de DiO délivré de solution en vrac (DIO _libre). en outre, ce procédé a montré que la fourniture de LCNP à médiation par la DIO module et entraîne le taux de séparation spécifique du colorant dans la lipophile bicouche de la membrane plasmique de manière substantielle. Ceci est réalisé tout en réduisant en même temps que la cytotoxicité du médicament libre par ~ 40% en délivrant comme une formulation LCNP.

Il est prévu que la méthodologie décrite ici sera une technique permettant puissant pour les chercheurs dont le travail implique ou exige la livraison cellulaire de cargaisons fortement hydrophobes qui sont peu solubles ou totalement insoluble en solution aqueuse.

Protocole

1. Préparation de DiO-LCNP et DiO-LCNP-PEG-Chol

1. Dissoudre le diacrylate de cristaux liquides agent de réticulation (DACTP11, 45 mg), de 3,3'-perchlorate dioctadecyloxacarbocyanine (DIO, 2 mg), et d'un initiateur de radicaux libres (azobisisobutyronitrile, 1 mg) pendant la polymérisation dans 2 ml de chloroforme. Ajouter à une solution aqueuse d'agent tensio-actif à fonctions acrylate (AC10COONa, 13 mg dans 7 ml).
2. On agite le mélange pendant 1 heure et soniquer à 80% d'amplitude pendant 5 minutes pour produire une mini-émulsion comprenant des gouttelettes de la matière organique, entourée d'agent tensio-actif polymérisable dans l'eau.
3. Chauffer le mélange à 64 ° C dans un bain d'huile pour initier la polymérisation à la fois de l'agent tensio-actif et de reticulation comme le chloroforme, évapore lentement, en laissant une suspension contenant DiO NP qui est stabilisé par l'agent tensio-actif.
4. Filtrer la suspension NP (3 fois) à travers un filtre à seringue de 0,2 um pour éliminer toute agrégation. Store la solution NP filtrée à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
5. Conjugaison du PEG-Chol à DiO-LCNP par couplage EDC.
   1. Dissoudre Chol-PEG-NH ₂ .HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) dans du tampon HEPES 25 mM (pH 7,0).
   2. Préparer une solution de travail contenant un sel de N - hydroxy-sulfosuccinimide sodium (SHN, 40 mM) et de 1-éthyl-3- (3- (diméthylamino) propyl) carbodiimide (EDC, 400 mM) dans un tampon HEPES à partir de solutions mères concentrées.
   3. Immédiatement ajouter 20 pi de la solution de travail fraîchement préparée de NHSS / EDC à 1,0 ml de DiO-LCNP dans un tampon HEPES et remuer pendant 5 min.
   4. Ajouter 20 pi de solution mère de Chol-PEG-NH ₂ · HCl à ce mélange et remuer pendant 2 heures.
   5. Centrifuger brièvement le mélange réactionnel à la vitesse maximale (~ 2 000 x g) pendant 30 secondes en utilisant une mini - centrifugeuse de paillasse et passer le surnageant à travers une colonne de chromatographie d'exclusion PD-10 équilibrée avec la taille ¹³un tampon phosphate salin de Dulbecco (DPBS, 0,1x).

2. Caractérisation des DiO-LCNP et DiO-LCNP-PEG-Chol

1. Confirmer la conjugaison covalente réussie de PEG-Chol à la surface DiO LCNP par électrophorèse sur gel.
   1. Dissoudre 0,5 g d'agarose dans 50 ml (1x) de tris-borate électrophorèse (TBE; Tris 89 (pH 7,6), l'acide borique 89 mM et EDTA 2 mM) tampon. Chauffer la solution dans un four à micro-ondes pour dissoudre l'agarose. Laisser la solution refroidir légèrement et verser le contenu dans une plaque de gel dans la zone d'électrophorèse. Insérez un peigne de gel pour créer des puits d'échantillon.
   2. Une fois que le gel est solidifié, ajouter la quantité requise (assez pour immerger le gel dans la chambre) de TBE courir tampon à la chambre.
   3. Ajouter 35 pi d'échantillon DiO LCNP (modifié avec du glycérol, 5% v / v) dans les puits du gel et de tourner pendant 20 min sous une tension de 110 V.
   4. L'image du gel en utilisant une connexion du système d'imagerie de geld'excitation et de filtres d'émission e à 488 nm et 500-550 nm, respectivement.
2. Évaluer la taille des particules et la distribution par diffusion dynamique de la lumière (DLS) en diluant la solution DiO-LCNP (dilution ~ 200 fois) dans du PBS (pH ~ 8, 0,1x) et de mesure sur un instrument de DLS ^14. Mesurer le potentiel zêta de la DIO-LCNPs en utilisant un instrument potentiel zeta approprié de mesure.

3. Préparation de cellules Vaisselle Culture pour les expériences de livraison et d'imagerie

REMARQUE: l' étiquetage DiO LCNP est effectuée sur des cellules HEK 293T / 17 cellules rénales embryonnaires humaines (entre les passages 5 et 15) qui sont mises en culture comme décrit précédemment ^4. Effectuer les expériences de livraison et l'imagerie cellulaire ultérieure, comme décrit ci-dessous.

1. Préparer des plats de culture de tissus de diamètre 35 mm (équipés de 14 mm inserts n ° 1 lamelle) en les enduisant de fibronectine bovine (~ 100 ul à une concentration de 20 pg/ Ml) dans du DPBS pendant 2 heures à 37 ° C.
2. Retirer la solution de revêtement de fibronectine à partir de la boîte de culture. Récolte HEK 293 T1 / 7 cellules provenant du flacon T-25 de premier lavage de la monocouche cellulaire avec 3 ml de DPBS, puis en ajoutant 2 ml de trypsine-EDTA (0,5% de trypsine-0,25% d'EDTA).
3. Incuber le ballon à 37 ° C pendant ~ 3 min. Retirez la trypsine-EDTA et retourner le ballon à l'incubateur. Une fois que les cellules sont détachées du flacon, neutraliser la trypsine en ajoutant 4 ml de milieu complet (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, DMEM, modifié de manière à contenir 10% de sérum bovin foetal, du pyruvate de sodium à 5% et 5% d'antibiotique / antimycosique) dans la fiole . Déterminer la concentration des cellules dans la suspension par leur comptage dans un compteur de cellules.
4. Ajuster la concentration cellulaire à 8 x 10 ~ ⁴ cellules / ml avec du milieu de croissance. Ajouter 3 ml de la suspension cellulaire à l'antenne et de la culture dans l'incubateur pendant une nuit; le lendemain, les cellules doivent être à ~ 70% de confluence et devraient être prêts à l'emploi. Adéquatla densité cellulaire est essentielle pour le marquage robuste et efficace d'un pourcentage élevé de cellules.

4. Livraison cellulaire de DiO et DiO-LCNPs et imagerie des cellules fixes

1. Préparer 1 ml de solutions DiO, DiO-LCNP et DiO-LCNP-PEG-Chol en milieu de livraison (HEPES-DMEM; DMEM contenant 25 mM HEPES) en diluant des solutions mères de DiO _gratuit et DIO-LCNPs; concentrations DiO appropriés pour l' incubation sur les cellules seront ~ 1-10 uM (exprimé en soit la concentration de DiO _libre ou DiO sous forme de DiO-LCNP).
2. Retirez le milieu des boîtes de culture de croissance à l'aide d'une pipette sérologique et laver les monocouches de cellules (voir l'étape 3) deux fois avec HEPES-DMEM (2 ml à chaque lavage). Effectuer les lavages en ajoutant doucement et retirer HEPES-DMEM à l'aide d'une pipette vers / depuis le bord de la vaisselle.
3. Ajouter 0,2 ml de la DIO solutions de livraison _gratuits ou DiO-LCNP préparés au centre des boîtes de culture et de retourner les plats à l'incubator pendant une période de temps appropriée (typiquement 15 ou 30 minutes, en fonction des besoins de l'expérience). Des durées d'incubation ajouter à l' étiquetage cellulaire plus non spécifique des zones non-membraneux (par exemple, cytosol).
4. Après la période d'incubation, retirer les solutions de livraison à l'aide d'une pipette sérologique. On lave les monocouches de cellules deux fois avec du DPBS (2 ml à chaque lavage). Effectuer les lavages en ajoutant doucement et retirer DPBS vers / depuis le bord du plat.
5. Fixer les monocouches de cellules à l'aide de paraformaldehyde à 4% (préparée dans du DPBS) pendant 15 min à température ambiante.
   ATTENTION: paraformaldéhyde est inflammable, un irritant respiratoire et un cancérogène suspecté.
6. Retirer la solution de paraformaldehyde à l'aide d'une pipette et laver délicatement les cellules 1 fois avec DPBS (2 ml) en ajoutant et supprimant DPBS en utilisant la pipette vers / depuis le bord de la vaisselle.
7. Les cellules fixées sont prêtes à être imagée par la présence d'un signal de fluorescence à l'aide membraneuse à balayage laser confocalmicroscopie (CLSM). Effectuer l'imagerie immédiatement ou, en variante, remplacer le milieu avec du DPBS contenant 0,05% de _NaN3 et stocker les plats à 4 ° C.
   ATTENTION: NaN ₃ est toxique; preuve d'une extrême prudence lorsque vous utilisez _NaN3.
   NOTE: Correction des échantillons stockés de cette manière devraient être imagés dans les 48 heures pour des résultats optimaux.

5. Livraison cellulaire de DiO et DiO-LCNPs et FRET Imaging dans des cellules vivantes

NOTE: Dans cette méthode, les cellules sont colabeled avec 6 pM chacun DiO LCNP-PEG-Chol (où DiO est un donneur FRET) et de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3 ', 3' perchlorate tetramethylindocarbocyanine (DII _libre, où Dil est un accepteur de FRET). La libération de DiO de DiO-LCNP-PEG-Chol et son incorporation dans la membrane plasmique est confirmée par une augmentation observée dans le transfert d'énergie du donneur DiO à l'accepteur Dil.

1. Cellules d'étiquettes séquentiellement avec DiO-LCNP-PEG-Chol et Dil _free selon la méthode décrite à l' étape 4.
2. Après coloration, laver les cellules 1 fois avec DPBS (2 ml) à l'aide d'une pipette sérologique et remplacer le tampon de lavage avec 2 ml de solution d'imagerie des cellules vivantes (SICT).
3. Sur une platine de microscope équipé d'une chambre d'incubation chauffé, l'image de l'échantillon de cellules vivantes à l'aide d'un microscope confocal (objectif 60X) avec une configuration d'imagerie FRET à intervalles de 30 minutes sur une période de 4 heures en excitant le donneur DiO à 488 nm et une collecte complète des émissions les spectres du donneur et l'accepteur DiO Dil 490-700 nm avec un détecteur spectral 32 canaux.
4. NOTE: Pour plus d' informations sur l' imagerie FRET, s'il vous plaît voir la référence ^15.
5. Déterminer l'intensité résolue dans le temps d'émission du donneur et l'accepteur DiO Dil à partir de cellules colorées avec DiO-LCNP-PEG-Chol et DII. Calculer le temps résolu accepteur / donneur FRET rapport (Dil _emi / DiO _emi) pour les images, ce qui augmentera de façon constante et , éventuellement , plaqueau une fois que la quantité de DiO donneur partitionné dans la membrane a atteint un maximum de ^16.

6. Essai de cytotoxicité de DiO et DiO-LCNPs aux HEK 293T / 17 cellules

REMARQUE: La cytotoxicité des matériaux DiO LCNP est évaluée en utilisant un essai de prolifération à base de colorant tétrazolium ^17. Les cellules sont cultivées dans une plaque à puits multiples en présence de concentrations variables des matériaux dans des conditions qui simulent la livraison / l'étiquetage. Les cellules sont ensuite mises en culture pendant 72 heures pour permettre la prolifération. Un colorant (MTS (3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxyméthoxyphényl) -2- (4-sulfophényl) -2H-tétrazolium) est alors ajouté aux puits et métaboliquement actifs les cellules convertissent le colorant en bleu de formazan. la quantité de formation de la couleur est directement proportionnelle au nombre de cellules viables.

1. Récolte HEK 293 T1 / 7 cellules provenant du flacon T-25 en suivant le mode opératoire décrit à l'étape 3.2.SeedHEK 293T / 17 cellules (5.000 cellules / 100 ul / puits) aux puits d'une plaque de 96 puits de culture de tissu traité et de la culture pendant 24 heures.
2. Supprimer complètement les milieux de culture des puits à l' aide d' une micropipette et ajouter 50 ul de HEPES-DMEM contenant DiO _libre, DiO-LCNPs ou DiO-LCNP-PEG-Chol à des concentrations croissantes de reproduire des puits. Incuber sur les cellules à 37 ° C pendant 30 min.
   NOTE: En règle générale, de répétitions fait en triple ou quadruple sont suffisantes pour produire des données statistiquement fiables.
   1. Après incubation, retirer le support de diffusion contenant les matériaux à l'aide d'une micropipette et le remplacer par 100 ul de milieu de croissance. Culture des cellules pendant 72 heures.
3. Ajouter 20 ul de substrat de tétrazolium à chaque puits, le retour de la plaque dans l'incubateur, et permettre la formation de couleur se dérouler à 37 ° C pendant 4 heures. Lire l'absorbance (abs) du produit formazan à 570 nm (minima d'absorption pour les DIO-LCNPs utilisés dans ce study) et 650 nm (pour la soustraction de l'absorbance de fond non spécifique) en utilisant un lecteur de microplaque.
4. Tracer la valeur d'absorption différentielle (abs ₅₇₀ - abs ₆₅₀₎ par rapport à la concentration matériau et présenter les résultats sous forme de pour cent de la prolifération des cellules de contrôle (degré de prolifération des cellules dans un milieu de culture cellulaire seulement).

Analyse 7. Données

1. analyser statistiquement les données à une analyse univariée de la variance (ANOVA). Pour les comparaisons multiples, appliquer test hoc poste de Bonferroni. Fournir toutes les valeurs moyennes de ± erreur type de la moyenne (SEM), sauf mention contraire.
   NOTE: La probabilité acceptable de signification était p <0,05.

Résultats

LCNPs ont été préparées dans lequel le noyau hydrophobe du NP a été chargé avec une sonde membrane-étiquetage représentatif pour démontrer l'utilité du LCNP comme véhicule de livraison efficace pour les cargaisons hydrophobes. A cet effet, la cargaison choisie était le colorant potentiométrique membrane marquage hautement insoluble dans l'eau, DiO. LCNPs chargés DiO (DIO-LCNPs) ont été synthétisés en utilisant une technique de mini-émulsion à deux phases avec les composants chimiques DACTP11...

Discussion

Un souci constant de NMDD est le ciblage contrôlé et la fourniture de formulations de médicaments à des cellules et des tissus, associée à une amélioration simultanée efficacité du médicament. Une classe spécifique de molécules de médicaments pour lesquels cela a posé un défi important est hydrophobes agents médicaments / d'imagerie qui ont peu ou pas de solubilité dans les milieux aqueux. Ce problème a tourmenté la transition des médicaments puissants à partir des systèmes de culture ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA)	ThermoFisher	E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO)	Sigma Aldrich	D4292-20MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride	Nanocs, Inc.	PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter	ThermoFisher	C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	ThermoFisher	14040182	Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma	ThermoFisher	33010018	Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V)	ThermoFisher	28906	Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17)	American Type Culture Collection	ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS)	ThermoFisher	A14291DJ	Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS)	ThermoFisher	24510
Nikon A1si spectral confocal microscope	Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)	ThermoFisher	T10282	mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor	Sonics and Materials Inc	GEX 600-5
Mini Cetntrifuge	Benchmark	Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium	GE Healthcare	17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System	Bio-RAD	76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056