عزل الخلايا البطانية السلف من المتطوعين الأصحاء وإمكاناتهم الكثيرة تأثر عينات المصل بعد جراحة القلب

Summary

الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) تشارك بشكل حاسم في اتساع الأوعية الدموية في الأنسجة الدماغية. يصف هذا الأسلوب عزلة EPCS الإنسان من الدم المحيطي، وكذلك التعرف على إمكانات المهاجرة ضد عينات مصل الدم من المرضى لعمليات جراحية في القلب.

Abstract

ويتم تجنيد الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) من نخاع العظام في ظل ظروف مرضية مثل نقص الأكسجة وتشارك بشكل حاسم في اتساع الأوعية الدموية في الأنسجة الدماغية. الأصل، وتصنيف وتوصيف EPCS معقدة. بالرغم من ذلك، تم إنشاء اثنين من أبرز أنواع فرعية من EPCS: ما يسمى ب "في وقت مبكر" EPCS (يشار لاحقا إلى المبكرة EPCS ع) EPCS وفي وقت متأخر من ثمرة (أواخر EPCS). ويمكن تصنيفها حسب الخصائص البيولوجية، فضلا عن ظهورها في المختبر خلال الثقافة. في حين تظهر EPCS "الأولى" في أقل من أسبوع بعد ثقافة الخلايا وحيدة النواة المشتقة من الدم الطرفية في EC-محددة وسائل الإعلام، EPCS في وقت متأخر من ثمرة يمكن العثور على بعد 2-3 أسابيع. وقد تم الاعتراف EPCS في وقت متأخر من ثمرة أن تشارك مباشرة في اتساع الأوعية الدموية، وذلك أساسا من خلال قدرتها على التمايز إلى خلايا البطانية ناضجة، في حين أن "في وقت مبكر" EPCS تعبر عن العوامل عائية المختلفة وendogenالبضائع الأوس لتعزيز الأوعية الدموية بطريقة نظير الصماوي. خلال عضلة القلب نقص التروية / ضخه (I / R)، عوامل مختلفة تتحكم صاروخ موجه من EPCS إلى مناطق تكوين الأوعية الدموية.

بلعم عامل الهجرة المثبطة (MIF) هو الموالية للالتهابات، وأعرب عن بتواجد مطلق خلوى مثل chemokine وصفت مؤخرا على العمل المنظم الرئيسي اعتبارا من الهجرة EPCS في تركيزات الفسيولوجية ^1. ومن المثير للاهتمام، يتم تخزين MIF في برك داخل الخلايا ويمكن بسرعة أن تطلق في مجرى الدم بعد عدة مؤثرات (مثل احتشاء عضلة القلب).
يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل موثوقة وثقافة المبكر EPCS من البالغين الدم المحيطي البشري استنادا إلى التحديد-CD34 الإيجابي مع الثقافة اللاحقة في المتوسط تحتوي على عوامل النمو البطانية على لوحات فبرونيكتين المغلفة للاستخدام في فحوصات في المختبر الهجرة ضد عينات مصل من المرضى لعمليات جراحية في القلب. علاوة على ذلك،ويتجلى تأثير الهجرة من MIF على الكيميائي من EPCS مقارنة مع السيتوكينات تحفيز الأوعية الدموية الأخرى المعروفة.

Introduction

الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) تنتشر في دم الإنسان ولها القدرة على التمايز إلى خلايا بطانة الأوعية الدموية ^2. يشاركون في تكون الأوعية وقادرون على التقليل من الأضرار الناجمة عن التهاب ونقص التروية / ضخه (I / R) إصابات بطرق مختلفة ^{3، 4.} على سبيل المثال، EPCS تظهر مستويات مرتفعة من الانزيمات المضادة للأكسدة داخل الخلايا مثل الكاتلاز، البيروكسيديز الجلوتاثيون أو سوبر أكسيد ديسميوتاز المنغنيز (MnSOD) ^5. المقاومة مرتفعة ضد الاكسدة تسمح EPCS للعمل في microenvironments مع الأنواع مرتفعة الاكسجين التفاعلية (ROS) بعد الإصابة الدماغية ^6. وأشارت دراسات سابقة إلى أن عدد من EPCS قد تكون مرتبطة إلى إصلاح الأوعية الدموية وانخفاض عدد تعميم EPCS يتوقع وقوع أحداث القلب والأوعية الدموية ^7،الطبقة = "XREF"> 8. ومع ذلك، لم يتم العثور على تعريف واضح لEPC حتى الان. حتى الآن، ليس هناك أية علامة سطح الخلية المحددة أو النمط الظاهري ثابت لEPCS وهذه الخلايا نادرة جدا في الدم المحيطي ^9. وينبغي النظر في EPC الإنسان باعتبارها الخلية تعميم لديهم القدرة على المساهمة في إعادة بناء البطانة الجرحى والهياكل الأوعية الدموية الجديدة.

طريقة واحدة لعزل وتوصيف EPCS هي من خلال الانضمام إلى فبرونيكتين. وبالتالي، يتم استخدام قدرة هذه الخلايا لإظهار التصاق متفوقة على الفيبرونكتين أطباق المغلفة مقارنة الكولاجين من صنف 1، على سبيل المثال ^{3 و 10 و 11.} ومع ذلك، وجد آخرون أن خلايا الطلاء وحيدات النوى على الأطباق المغلفة فبرونيكتين دون أي خطوة تنقية السابقة أو يؤدي إلى مزيد من المستعمرات بما في ذلك الخلايا الاولية الدم النخاعي، وحيدات، والخلايا اللمفية تي ^{12، 13، 14.} وعلاوة على ذلك، في هذه الحالة، قد الصفائح الدموية تلوث الخلية وحيدة النواة (MNC) جزء، وبالتالي نقل البروتينات غشاء البلازما إلى أي خلايا ملتصقة ^15.

وبالاضافة الى توصيف من خلال فحوصات في المختبر الالتصاق، يتم استخدام مزيج من مختلف علامات سطح الخلية لوصف نوع من الخلايا تعتبر الاتفاقية الأوروبية. في هذه الحالة، بعد التصاق بوساطة فبرونيكتين، والخلايا يتم تحليل بشأن سمات مثل البطانية الخاصة بهم. في هذه العملية، وهما البطانية علامات الخلايا المرتبطة، الأسيتيل-البروتين الدهني منخفض الكثافة (acLDL) وعامل النمو البطاني الوعائي مستقبلات 2 (VEGFR-2، KDR)، تلعب دورا في ذلك. وقد تبين أن الخلايا البطانية والبلاعم لاتخاذ خصيصا acLDL في عملية تسمى "طريق خلية زبال" ^16. بروتين آخر علامة هو KDR كما مستقبلات عامل نمو بطانة الاوعية الرئيسي على البطانيةخلايا ^17. لكن، وكما EPCS بشكل عام يتم تربيتها في وسائل الإعلام تستكمل مع عوامل النمو البطانية والجنين مصل العجل، فمن الممكن أن الضامة، والتي قد أيضا تم عزلها عن طريق الخطأ، يحمل ملف تعريف علامة تشبه البطانية. كما هو موضح سابقا، إذا مثقف في المتوسط مكيفة البطانية، الضامة تعبر عن البروتينات "، البطانية محددة" ^(18).

بشكل عام، هناك نوعان من EPCS ضمن أكثر أنواع فرعية، والتي يمكن أن تكون موجودة في الدم أو يكون المثقف في المختبر. تظهر في وقت متأخر من ثمرة EPCS (في وقت متأخر من EPCS) بعد 2-3 أسابيع من الثقافة. يتم دمج هذه الخلايا بشكل أسرع إلى أحادي الطبقة من الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان ويمكن أن تشكل الأنابيب الشعرية ^(19). الى جانب ذلك، ما يسمى ب "المبكر EPCS" تدور في الدم لمدة أسبوع واحد والتصرف بطريقة أكثر سلبية من خلال تقديم الجزيئات عائية، مثل نمو بطانة الأوعية الدمويةعامل (عامل نمو بطانة الاوعية)، أو CXCL8 ^19. المرضى الذين يعانون من مرض الشريان التاجي (CAD) وجود كميات أقل بكثير من EPCS المبكرة مقارنة مع مجموعة السيطرة من دون ²⁰ CAD. ومن المثير للاهتمام، وأظهرت نفس المجموعة كميات أكبر من وقت متأخر من EPCS مقارنة مع مجموعة السيطرة. وأظهرت دراسة أخرى أن المبكر EPCS حماية EPCS متباينة من الخلايا تحت ظروف الأكسدة بطريقة نظير الصماوي ^6. لذلك، EPCS مبكرة قد توفر آثار وقائية ذات الصلة من خلال هجرة الخلايا الأخرى بطريقة صناعة السيارات في أو نظير الصماوي في الدم المحيطي.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لتنقية EPCS المبكرة من خلال عزل لأول مرة PBMC-جزء من الدم المحيطي البشري وبالتالي عزل CD34 ⁺ الخلايا من PBMC-جزء لمسح هذا تعليق خلية من الخلايا غير المرغوبة. CD34 هو علامة، والذي يستخدم لعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الإنسان ⁹ . بعد ذلك، والخلايا CD34 ⁺ يتم تربيتها على الأسطح زراعة الأنسجة المغلفة فبرونيكتين. بعد ثلاثة أيام، يتم تغيير المتوسطة، وبالتالي فقدان كل الخلايا غير ملتصقة. وأخيرا، ملطخة EPCS معزولة للتحقق من امتصاص acLDL وجود KDR كما البطانية خلية علامة باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). كما علامة إضافية، قمنا بتحليل الصفائح الدموية البطانية جزيء التصاق الخلية (PECAM-1، CD31)، والذي يحدث أيضا على الخلايا البطانية.

ترميم الأنسجة عضلة القلب التالفة أو محتشية خلال تعزيز توظيف EPCS ينتمي إلى استراتيجيات العلاج التحقيق بشكل مكثف في أمراض القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك، فإن ترجمة النتائج التجريبية في الممارسة السريرية لا تزال صعبة، نظرا للتفاعل الخلوي تعقيدا في جسم الإنسان خلال مختلف الظروف المرضية. وعلاوة على ذلك، وأنا عضلة القلب / إصابات R تؤدي إلى إفراز مفرط من مختلف السيتوكينات والهرمونات والقوات المسلحة الكونغولية النمو الاختصاصات، التي تسيطر على صاروخ موجه من EPCS إلى مناطق تكوين الأوعية الدموية ^13. كما هو مبين بالفعل، CXCL8، المستمدة الخلايا اللحمية عامل 1α (SDF-1α، CXCL12)، وزيادة عامل نمو بطانة الاوعية والبلاعم الهجرة عامل مثبط (MIF) بشكل كبير في عينات مصل التالية عضلة القلب I / R إصابة ^1. ومن بين هذه العوامل، MIF هو مثل chemokine خلوى عديد المظاهر ذات الخصائص الغالب الموالية للالتهابات. وعلى النقيض من الاسم التاريخي لها، MIF وظائف المؤيدة للهجرة، بوصفها chemokine صحيح على مختلف أنواع الخلايا ^{1 و 21 و 22.} وقد تم ربط عمليات تجنيد خلية MIF بوساطة لمستقبلات chemokine CXCR2 وCXCR4، الذي يربط MIF لوينشط بطريقة غير المشابهة ^21. وتجدر الإشارة، EPCS تعبر عن كل من هذه المستقبلات على سطوحها، والتي أصبحت بالإضافة إلى ذلك يصل ينظم تحت ظروف نقص الأوكسجينالحمار = "XREF"> ^{23، 24.} وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة المتراكمة التي MIF له التأثير الكلي القلب واقية أثناء I / R إصابة القلب ^{22 و 25 و 26.} وفي هذا السياق، فقد تبين أيضا أن MIF قد دعم اتساع الأوعية الدموية أثناء الإجهاد ميتة التي هي ذات أهمية خاصة، عند النظر في آليات استرداد محدودة من عضلة القلب المصاب ^(27). في الدراسات المختبرية والتجارب السابقة في نماذج الماوس ما قبل السريرية قدمت أول دليل حول دور MIF في EPCS توظيف ^4. وتجدر الإشارة، MIF أيضا هو بروتين البضائع بارز من EPCS التي قد يتم الافراج خلال تجنيد EPCS داخل مواقع الدماغية ^28. ومع ذلك، لا تزال الدراسات في المرافق الصحية ولا سيما في مقارنة مع غيرها (عائية) السيتوكينات المصل بعيد المنال.

Protocol

تم الحصول على الدم لعزل EPCS من المتطوعين الأصحاء بعد الموافقة المسبقة وفقا للجنة الأخلاقيات المحلية. تم الحصول على عينات من مصل الدم المستخدمة في المقايسات الهجرة من المرضى الذين خضعوا لجراحة القلب التقليدية مع استخدام المجازة القلبية الرئوية (بروتوكول قرطاجنة). وكانت معايير الاستبعاد عمليات الطوارئ، الحمل المعروفة أو المشتبه بهم، patient`s سن أقل من 18 عاما، وعدم الحصول على الموافقة المسبقة. واستخلصت عينات مصل بالإضافة إلى القياسات الدورية في العيادات (فورا قبل الجراحة ومباشرة بعد ضخه عضلة القلب / افتتاح الأبهر عبر الشبك) وتخزينها بعد ذلك في -80 درجة مئوية حتى التحليل النهائي. وافقت (لجنة الأخلاقيات، جامعة آخن) مجلس المراجعة المؤسسية هذه الدراسة. وأظهر المرضى متوسط ​​أعمارهم 68.6 عاما ومتوسط ​​وزن 81.7 كجم. وتشمل أمراض موجودة من قبل: ارتفاع ضغط الدم (65٪)، وأمراض الرئة المزمنة (19٪)، اعتلال الشرايين القلبية إضافي (16٪)، والخلل الوظيفي الدماغي (6٪)، والذبحة الصدرية غير المستقرة (3٪)، واحتشاء عضلة القلب مؤخرا (28٪ في غضون 90 د)، مرض الكلى المزمن (14٪)، وأمراض الكبد (2٪) والسكري (34٪).

1. طلاء T75 قارورة:

1. إعداد 5 مل من محلول فبرونيكتين (1 ملغ فبرونيكتين الإنسان مخففة في 15 مل من الماء عالى النقاء) في قارورة T75.
2. إضافة الحل إلى قارورة T75 والانتظار حتى يتم تبخر الماء. لتجنب أي انقطاع غير الضرورية أثناء عملية العزلة بسبب التبخر، نفذ هذه العملية في وقت مبكر (على سبيل المثال بين عشية وضحاها) وفي درجة حرارة الغرفة. هذا الحل يعطي 4.44 ميكروغرام فبرونيكتين / سم ^2.
3. إعداد البطانية نمو الخلايا المتوسطة MV2 من خلال استكمال القاعدية MV2 المتوسطة مع الملاحق عامل النمو المقدمة من قبل الشركة المصنعة.

2. عزل الخلايا البطانية السلف (EPCS) من 60 مل الدم:

ملاحظة: كما في-CD34 إيجابي اختيار كوكتيلالثانية هي حبات مغناطيسية المتاحة تجاريا في مجموعة مختارة مجتمعة، لا توجد تركيزات المقدمة من قبل الشركة المصنعة. ومع ذلك، نحو 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة تكفي لمعالجة ما يصل إلى 5 × 10 ⁸ خلايا. والمخفف حبات مغناطيسية في الماء، ديكستران المغلفة وحول 5،000x أصغر مقارنة مع حبات أخرى متاحة تجاريا. لمزيد من المعلومات، راجع تعليمات manufacturer's.

1. خلط الدم (مع أو بدون مضادات التخثر) 1: 1 مع الكالسيوم ²⁺ -Mg ²⁺ خالية من برنامج تلفزيوني.
2. إضافة 15 مل من كثافة حل التدرج في أنبوب 50 مل. لمزيد من المعلومات، راجع تعليمات manufacturer's.
3. طبقة ببطء الدم المخفف على رأس من الحل التدرج الكثافة.
4. عينات الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 30 دقيقة مع تسارع بطيء ودون الكبح.
5. جمع بعناية طبقة معطف الشهباء من كل أنبوب (الشكل 1) باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة ووضعها في أنبوب آخر.تجنب جمع من الحل التدرج الكثافة. العائد PBMC المتوقع هو حوالي 3-4 × 10 ⁶ خلية / مل دم.

الشكل 1: التدرج الكثافة الطرد المركزي من Bbuffy معطف على Ficoll الحل. أظهرت هو نتيجة الطرد المركزي التدرج الكثافة في 2500 x ج لمدة 30 دقيقة على حل التدرج الكثافة. يصور هي كريات الدم الحمراء والمحببة (الحمراء)، وجزء الخلية وحيدة النواة (الطبقة البيضاء)، البلازما (الصفراء)، والحل التدرج الكثافة (بيضاء). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. تمييع الطرفية وحيدة النواة خلايا الدم جزء لا تقل عن 3 مجلدات من برنامج تلفزيوني وتخلط. أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في 200 × ز.
7. كرر الخطوة 2.6 ضعف.
8. نضح طاف و resuspend بيليه خلية في 5 مل MV2 المتوسطة.
9. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD34 البشري (كافية لمعالجة ما يصل إلى 5 × 10 ⁸ خلايا) في استخدام معطف الشهباء وتناوب لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
10. إضافة 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المغلفة ديكستران في استخدام معطف الشهباء وتناوب لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
11. بعد الحضانة، ونقل تعليق لأنابيب FACS بحد أقصى 3 مل في كل أنبوب. سوف كميات أكبر لا يجوز مع المغناطيس.
12. إدراج نظام مراقبة الأصول الميدانية أنبوب (ق) في المغناطيس (ق) والانتظار لمدة 5 دقائق.
13. تجاهل طاف دون سحب أنابيب FACS من المغناطيس.
14. resuspend الخلايا في كل أنبوب FACS مع 3 مل MV2 المتوسطة خارج المغناطيس.
15. كرر الخطوات 2،12-2،14 مرتين.
16. سحب أنابيب FACS من المغناطيس وresuspend الخلايا في 3 مل MV2 المتوسطة.
17. نقل تعليق خلية إلى ما قبل المغلفة T75 وlasks وإضافة 17 مل MV2 المتوسطة في قارورة.
    ملاحظة: يجب تغيير المتوسطة بعد 3 أيام. بعد أسبوع واحد، والخلايا تظهر هياكل مثل مغزل (الشكل 2) وتكون جاهزة للاستخدام. ليتجاهل من العزلة انظر الشكل 3.

الشكل 2: صورة مجهرية من EPCS المعزولة. أظهرت هو صورة ممثل معزولة المبكر EPCS في قارورة T75 قبل مفرزة. الظاهر هو هيكل مثل مغزل من EPCS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): مخطط انسيابي عرض إجراء EPC العزلة. صورت هو مخطط، وتظهرجي الخطوات واحدة من البروتوكول EPC العزلة. لبروتوكول أكثر تفصيلا انظر القسم 2 في قسم البروتوكول.

3. الهجرة الفحص

1. إزالة المتوسطة من EPCS في قارورة T75.
2. يغسل مع 5 مل برنامج تلفزيوني عن طريق هز بعناية.
3. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 5 مل من محلول التجارية خلية مفرزة. انتظر حتى يتم فصل الخلايا (الاختيار تحت المجهر). تسريع مفرزة من خلال استغلال بعناية أسفل القارورة.
4. عندما يتم فصل الخلايا، وبسرعة إضافة 5 مل من MV2 المتوسطة كاملة ونقل تعليق الخلية في أنبوب آخر.
5. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
6. و resuspend الخلايا في 5-10 مل برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
7. كرر الخطوة 3.6.
8. resuspend الكرية خلية في MV2 المتوسطة المتعطشة (50،000 الخلايا في هناك حاجة إلى 75 ميكرولتر لكل بئر التهجير).
   ملاحظة: أي نظام الهجرة هناك حاجة تعتمد على نوع من الخلايا والفحص. هناك فرق بأقطار erent المسام والأحجام لوحة (عدد الآبار). لEPCS حجم المسام من 5 ميكرون في 96 نظام جيد هو الأمثل.
9. إعداد لوحة الهجرة وذلك بإضافة 235 ميكرولتر من عينة مصل الدم (المصل المخفف 1: 5 في MV2 تجويع المتوسطة) في مجلس النواب (الشكل 4).

الشكل 4: الهجرة الفحص في غرفة بويدن التعديل. أظهرت هو التصميم العام للغرفة بويدن تعديلها. يشار إلى أن إدراج ثقافة خلية (= الغرفة العليا) في الأزرق الداكن، وإدراجها في مجلس النواب. أسفل (ولكن ليس على الحائط) من هذه إدراج يمثل نظام التصفية بما في ذلك المسام. (أ) يبين الإعداد في نقطة زمنية الصفر. (ب) بعد نقطة زمنية محددة، يتم ترحيل الخلايا من خلال تصفية نحو التحفيز.fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

10. إضافة إدراج قريبا مضيفا قبل حل الخلية.
11. إضافة 75 ميكرولتر من محلول الخلية (= 50،000 الخلايا) في مجلس الشيوخ.
12. دع EPCS الهجرة لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية، وثاني أكسيد الكربون 5٪ ₂ (وقت الهجرة يعتمد على نوع من الخلايا والنظام).
    1. لتجنب المصل المصنوعات اليدوية لصناعة السيارات في مضان، تحديد خلايا هاجر من التقاط الصور من البئر تحت المجهر وعدد الخلايا باستخدام برنامج شبه الآلي "يماغيج".
13. إزالة الغرفة العليا (التي تحتوي على جميع الخلايا غير ترحيلها).
14. إضافة 70 ميكرولتر 3.6٪ محلول امتصاص العرق، بما في ذلك هويشت صبغ (المخفف 1: 1000). ويمكن تخزين لوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ بين عشية وضحاها.
15. أجهزة الطرد المركزي لوحة قريبا للحصول على كل الخلايا في المستوى البؤري نفسها في 2000 x ج لمدة 1-2 دقيقة.
16. تأخذ 5 صور في ثالذراع (الشكلان 5 و 6) مع التكبير 100X.

الرقم 5: مخطط عرض الموقف من التقاط الصور. مخطط يصور الموقف من الصور التي التقطت خمسة، والتي هي بحاجة لتحديد خلايا هاجر، فيما يتعلق أيضا. تؤخذ الصور لعدد الخلايا وحساب متوسط ​​قيمة لكل جيدا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: صورة مجهرية لالكمي الخلية. أظهرت هو صورة تمثيلية، الذي اتخذ الكمي الخلية. كانت ملطخة الخلايا وثابتة باليودنانوغرام هويشت صبغ في 3.6٪ امتصاص العرق. النقاط تمثل ثابتة وملطخة الخلايا الاولية البطانية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

17. عد الخلايا هاجر باستخدام البرمجيات الآلي شبه "يماغيج" من قبل المعهد الوطني للصحة.

النتائج

توصيف عزل الخلايا البطانية السلف

أولا، تم التحقق من امتصاص acLDL، وكذلك التعبير عن KDR، وCD31 على سطح السكان خلية معزولة. كما يظهر 7A الشكل، أظهرت 85.1٪ من EPCS معزولة على امتصاص acLDL وأعرب CD31. ا...

Discussion

وتضمن الجزء الأول من هذه الدراسة عزل EPCS الإنسان من الدم المحيطي من المتطوعين الأصحاء لتمكين من إجراء تقييم شامل من دم مرضى جراحة القلب. لذلك، تم إجراء الطرد المركزي التدرج الكثافة لفصل جزء PBMC من البلازما، والمحببة وكريات الدم الحمراء. لإزالة معظم الصفائح الدموية تلو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin	Biochrom AG	L7117	Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia	Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2	Promo Cell	C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix	Promo Cell	C-39226
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit	Stemcell Technologies	18056	Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet	Stemcell Technologies	18000
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports	Sigma-Aldrich	CLS3387-8EA	Migration system
Hoechst solution	ThermoFisher	33342	Staining of migrated cells
ImageJ	National institutes of health	xxx	Counting of migrated cells