خلايا الإنسان الجذعية الرئة: التوزيع المكاني والمظهري تحديد في داخل القصبة التحليلات عن طريق المناعية والتدفق الخلوي

Summary

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Abstract

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Introduction

الرئتين على اتصال مستمر مع البيئة الخارجية ويتعرضون للغاية لكلا جزيئات غير ضارة والميكروبات مع القدرة على التسبب في المرض. لذلك، من المهم جدا لجهاز المناعة لتركيب الاستجابات المناعية فعالة ضد الجراثيم الغازية، ولكن من المهم أيضا للحفاظ على التسامح لمستضدات استنشاقه التي لا تسبب المرض. لتوفير المراقبة المناعة قوية، واصطف الجهاز التنفسي مع وجود شبكة من الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية (DCS). البلدان النامية هي المهنية الخلايا المقدمة للمستضد مع قدرة فريدة على تنشيط خلايا T ساذجة. في الرئتين الإنسان، البلدان النامية المقيمين تواجه مستضد ومن ثم معالجة ونقل ذلك إلى الغدد الليمفاوية استنزاف الرئة لعرضها على وتنشيط خلايا T ^{1، 2، 3.}

في نظام المناعة البشري، البلدان النامية يمكن تقسيمها إلى عدة مجموعات فرعية، مع ديستانط م ولكن تداخل وظائف: CD1c ⁺ وCD141 ⁺ البلدان النامية الدم النخاعي (MDCs) وCD123 ⁺ البلدان النامية بلازماوية الشكل (PDCS) ^{4، 5.} في حين أن معظم المعرفة التفصيلية على البلدان النامية الإنسان تنبع من الدراسات في الدم، فمن الواضح الآن أن الرئتين الإنسان أيضا تؤوي السكان نادر من مجموعات فرعية العاصمة مع خلايا T قدرة تنشيطية ^{6، 7، 8، 9.} ومع ذلك، تشير البيانات المتراكمة التي الخلايا المناعية، بما في ذلك البلدان النامية، تختلف في تكرارها، النمط الظاهري، وظيفة اعتمادا على الموقع التشريحي من ^10. وبالتالي، فمن المهم دراسة الخلايا المناعية من الأنسجة ذات الصلة لفهم مساهمتها في الحصانة المحلية والتسامح. أخذت معا، وهذا يؤكد الحاجة لدراسة البلدان النامية والرئة المقيمين عند معالجة أمراض الرئة، على الرغم من البلدان النامية الدم يجري أكثر متوفرة بسهولة والوصول إليها في البشر.

أولى الدراسات التي حققت البلدان النامية والرئة المقيمين في البشر تعتمد في المقام الأول على التشكل والتعبير عن علامات واحدة، مثل HLA-DR وCD11c و، في أقسام الأنسجة باستخدام المناعية ^{11، 12، 13.} في المقابل، المزيد من الدراسات الحديثة تعتمد عادة على cytometric تدفق التحليلات لدراسة مختلف مجموعات فرعية الخلايا المناعية. ومع ذلك، نظرا لأنه من الصعب العثور على علامة سطح الخلية واحدة أن يعرف بشكل فريد مجموعة فرعية العاصمة محددة، والحد المحتمل للدراسات تطبق فقط أربعة ألوان قياس التدفق الخلوي هو خطر بما في ذلك سكان الخلية مع علامات المظهرية مماثلة لبلدان النامية. على سبيل المثال، يتم التعبير عن CD11c وعلى كافة DC الدم النخاعي، والغالبية العظمى من وحيدات. من ناحية أخرى، في الدراسات التي تطبق أكثر تقدما لوحات التدفق الخلوي، استخدمت أنسجة الرئة غير سرطانية من استئصال الجراحي للمرضى عادةXREF "> ^{10، 14، 15، 16،} على الرغم من أنه من غير الواضح ما إذا كان هؤلاء السكان نادرة تمثل فعلا البلدان النامية موجودة في الاشخاص الاصحاء. وعموما، هناك دراسات محدودة إلى حد كبير يرجع ذلك إلى حقيقة أن ازالتها جراحيا أو كاملة أنسجة الرئة البشرية الشحيحة.

للتغلب على بعض من هذه القيود، ويصف هذا العمل كيفية إجراء تحليل مفصل لتوزيع المكاني وتحديد المظهري من البلدان النامية في الخزعات ضمن القصبة المخاطية التي تم الحصول عليها من المتطوعين الأصحاء الذين خضعوا لتنظير القصبات. عدة خزعات صغيرة يمكن جمعها من كل فرد، ويمكن بعد ذلك أن جزءا لا يتجزأ من لباجتزاء والتحليل باستخدام المناعية أو إنزيمي هضمها لتحليل تدفق cytometric المتقدمة. باستخدام أنسجة الرئة في شكل خزعات ضمن القصبة تم الحصول عليها من bronchoscopies يمنح ميزة مما يجعل من الممكن لأداء الحاديudy على متطوعين أصحاء، على عكس الجراحة المفتوحة للرئتين، لأسباب واضحة، ويقتصر على المرضى التي تتطلب جراحة الصدر. وعلاوة على ذلك، فإن الأنسجة التي أخذت عينات خلال القصبات من المتطوعين الأصحاء أمر طبيعي من الناحية الفسيولوجية، على النقيض من منطقة غير المتضررة من أنسجة الرئة في المرضى الذين يعانون من مرض رئوي. من ناحية أخرى، الخزعات صغيرة وعدد الخلايا التي تم استردادها، حتى عندما تجمع عدة خزعات، يحد نوع من التحليلات التي يمكن القيام بها.

في حين يركز هذا العمل على البلدان النامية، والأساليب المذكورة يمكن توسيعها مباشرة لتشمل عددا آخر من الخلايا (المناعة) من الفائدة الموجودة في الأنسجة المخاطية رئة الإنسان. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكولات هي أيضا قابلة للتطبيق مباشرة لعينات تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من أمراض رئوية حيث القصبات هي جزء من وضع التشخيص، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، الساركويد، أو سرطان الرئة.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على هذا البحث من قبل مجلس المراجعة الأخلاقية الإقليمي في أوميا، السويد.

1. تنظير القصبات لأخذ العينات ضمن القصبة خزعات من الموضوعات الإنسان

1. الحصول على الموافقة المسبقة من جميع المشاركين.
2. علاج الموضوعات مع ميدازولام عن طريق الفم (4-8 ملغ) وغليكوبيرونيوم الوريد (0،2 حتي 04 ملغ) 30 دقيقة قبل القصبات. تطبيق التخدير الموضعي مع يدوكائين في الحنجرة والقصبات الهوائية. السماح للغرغرة الموضوع مع ~ 3 مل من يدوكائين 4٪ وتطبيق 3 مل إلى قاعدة اللسان وفي الحنجرة عن طريق حقنة الحنجرة. تحسين التخدير الموضعي مع 8-10 جرعة من رذاذ يدوكائين. تنفيذ هذه الخطوة مع الجلوس الموضوع.
3. إدراج المنظار الفيديو مرنة من خلال الفم عن طريق لسان حال البلاستيك مع هذا الموضوع في موقف ضعيف. استخدام رذاذ القسطرة من صنع هدف لاستكمال التخدير الموضعي من القصبة الهوائية والشعب الهوائية البعيدة عن طريق المنظار. هنا، استخدام جرعة من حوالي5-10 مل من يدوكائين 2٪.
4. يستغرق 6-9 خزعات المخاطية داخل القصبة من كارينا الرئيسي والانقسامات الشعب الهوائية الرئيسية باستخدام ملقط منوفذة (الشكل 1). بعد القصبات وقبل خروجه من المستشفى، والسماح للبقية الموضوع لمدة 2-4 ساعة وتقدم له / لها مع وجبة خفيفة.

2. تضمين الخزعات في جلايكول Methylacrylate (GMA) الراتنج

ملاحظة: تم وضع بروتوكول المناعية GMA أصلا في جامعة ساوثهامبتون، وحدة بحوث كيمياء أنسجة ^17.

1. تثبيت: لالمناعية، وإزالة خزعات من ملقط ووضعها مباشرة في قارورة زجاجية تحتوي على 3 مل من المجففة الأسيتون ومثبطات الأنزيم البروتيني المثلج (phenylmethylsulfonyl فلوريد (35 ملغ / 100 مل الأسيتون) وiodoacetamide (370 ملغ / 100 مل الأسيتون )). إصلاح الأنسجة بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية (الشكل 2).
   ملاحظة: يجب PERFO الخطوات التاليةrmed في غطاء الدخان مع قفازات النتريل المناسبة. طقم التضمين تحتوي على المكونات التي يمكن أن تسبب ردود فعل الحساسية، وتهيج، و / أو حساسية الجلد. يجب التخلص من جميع النفايات من نفايات خطرة.
2. الجفاف: إزالة الأسيتون مع مثبطات واستبدالها مع الأسيتون المجففة الطازجة (بدون مثبطات) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). إزالة الأسيتون واستبدالها بنزوات الميثيل لمدة 15 دقيقة.
3. تسلل: إعداد محلول معالجة 5٪ حل بنزوات الميثيل في مونومر غليكول ميتاكريليت. 10 مل كافية لقنينة واحدة. استخدام ماصات باستور البلاستيك، مص قبالة حل بنزوات الميثيل واستبدالها مع 3 مل من محلول معالجة. احتضان الخزعات وحل معالجة الزائد عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. الماصات باستور يمكن استخدامها لجميع التغييرات حل لاحقة، بما في ذلك تضمين حل.
4. تبادل حل معالجة كل 2 ساعة (3X 2 حضانات ساعة)، وبالتالي فإن مجموع الوقت تسلل الحيويةpsies في حل معالجة هو لا يقل عن 6 ساعة. إدراج ملصقات ورقية في نهاية العلوي من الكبسولات تضمين لتحديد الخزعات.
5. يعد حل التضمين من 75 ملغ البنزويل بيروكسايد في 10 مل من مونومر غليكول ميتاكريليت. إضافة 0.25 مل من N، N بولي -dimethylaniline (أكسيد الاثيلين) (التسريع) إلى حل التضمين لبدء رد فعل البلمرة. إزالة حل معالجة ووضع خزعة واحدة في كبسولة التضمين ذات الصلة باستخدام ملقط.
6. ببطء ملء الكبسولة تضمين إلى الأعلى مع تضمين حل وأغلق الغطاء. تجنب إزعاج خزعة وخلق فقاعات الهواء الكبيرة. احتضان الكبسولات في 4 درجات مئوية حتى بلمرة الراتنج تماما.
7. تخزين الخزعات جزءا لا يتجزأ في -20 درجة مئوية في أنبوب 50 مل تحتوي على ما يقرب من 5 غ من هلام السيليكا.

3. باجتزاء من التحليلات ضمن القصبة جزءا لا يتجزأ من GMA-

1. طلاء شريحة المجهر: تغسل الشرائح المجهر فيغسالة الصحون في دورة عادية. تغطية الشرائح والسماح لهم الهواء الجاف.
2. يعد حل طلاء من 10٪ بولي-L-ليسين (PLL) حل في الماء المقطر. غمر الشرائح في حل الطلاء لمدة 5 دقائق، ثم السماح لهم الهواء الجاف. تخزين جافة الشرائح المغلفة PLL في صناديق الأصلية.
3. تغسل شرائح الزجاج ورقة مع 0.1٪ توين 20 في الماء المقطر. شطف الزجاج مع الايثانول 70٪ والجافة مع المناشف الورقية. قطع ريش الزجاج من قطاع الزجاج باستخدام صانع سكين. تخزين شفرات في حاوية يمنع الحركة لضمان طليعة لا يحصل تلف أو رصدت.
4. خزعة تقليم: ضع الكبسولة خزعة في التقسيم كبسولة وخفض كل جانب باستخدام الكربون الصلب حافة شفرة واحدة. إزالة خزعة جزءا لا يتجزأ من GMA-ووضعه بقوة في الرذيلة. تقليم الزائد GMA من جميع أنحاء الخزعة باستخدام شفرة الفولاذ.
5. GMA باجتزاء.
   1. إعداد 0.05٪ محلول الأمونيا مع الماء المقطر. ضع السكين والزجاج، وخزعة في الالبريد مشراح. بعناية محاذاة كتلة خزعة مع شفرة عن طريق ضبط حامل سكين وزاوية كتلة خزعة بحيث تقع شفرة مسطحة ضد سطح الكتلة.
   2. قطع 2 ميكرون أبواب سميكة باستخدام مشراح على سرعة القطع بطيئة واستخدام ملقط لنقل وتطفو من المقاطع على الماء والأمونيا. تطفو على أقسام لل45-90 ثانية، مما يسمح لطيف استرجاع مستضد وتتكشف من هذا الباب.
   3. التقاط المقاطع مع شريحة المجهر. فحص الأنسجة خزعة من تلطيخ بسرعة مع طولويدين الأزرق.
   4. تجفيف الشرائح على مجموعة لوحة الساخن إلى 50 درجة مئوية، وتطبيق 500 ميكرولتر من طولويدين تصفيتها وصمة عار الزرقاء إلى قسم باستخدام ماصة باستير البلاستيك. تدفئة القسم على صفيحة ساخنة حتى تبدأ حلقة الخضراء في الظهور على حافة وصمة عار، ثم غسله بالماء.
   5. باستخدام المجهر الضوئي، والتحقق من الأنسجة الخزعة. أقسام المستخدمة لالمناعية يجب أن يحتوي على مناطق جيدة من الصفيحة التالفةالمخصوصة وظهارة، مع عدد قليل من الغدد وكما تذكر العضلات الملساء وقت ممكن.
   6. كما هو الحال في القسم 3.4.2، وقطع الفروع التي لديها الأنسجة جيدة واعتقالهما مع شرائح المجهر المغلفة PLL لتلطيخ المناعى. قطع اثنين على الأقل مقاطع من كل خزعة للتحليل. الشرائح الجافة لا يقل عن 1 ساعة. بعد التجفيف، وأقسام يمكن أن تكون ملفوفة في احباط القصدير وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع، أو أنها يمكن immunostained على الفور.

4. المناعى تلطيخ من التحليلات ضمن القصبة جزءا لا يتجزأ من GMA-

ملاحظة: أزيد الصوديوم السامة. تحضير 0.1٪ محلول أزيد الصوديوم داخل غطاء الدخان وبعيدا عن الأحماض. الاتصال مع الأحماض يحرر غاز سام.

1. رسم حول المقاطع باستخدام قلم الماس ذات الرؤوس وترتيب الشرائح على رف تلطيخ.
2. أداء كتلة البيروكسيد. يعد حل كتلة البيروكسيديز من 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين في 0.1٪ محلول أزيد الصوديوم. تطبيق ورقةذ 1 مل من كتلة البيروكسيديز إلى أقسام واحتضان لمدة 30 دقيقة.
3. إعداد محلول غسل 0.05 مخزنة المالحة تريس-M (TBS)، ودرجة الحموضة 7.6. تغسل الشرائح في TBS، 3X 5 دقائق.
4. يعد حل كتلة BSA 1٪ في DMEM. القيام بذلك في وقت مبكر وبكميات كبيرة، قسامة وتجميده لحين الحاجة إليها. استنزاف الشرائح واحتضان المقاطع في حل كتلة لمدة 30 دقيقة لمنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة. إذا غير محددة ملزمة لا يزال يحدث، وتشمل حضانة خطوة 30 دقيقة مع كتلة المصل 5٪ من نفس النوع كما الأجسام المضادة الثانوية.
5. تمييع الأجسام المضادة الأولية (CD45 أو CD1a) في TBS إلى تركيز المطلوب (CD45 المخفف في 1: 1000، CD1a المخفف في 1: 1،00) وتطبيقه على الشرائح. ساترة الأقسام واحتضان بين عشية وضحاها في RT.
6. غسل الشرائح في TBS ثلاث مرات. تمييع الضد الثانوية المعقدة البيروكسيديز (موجهة ضد الأنواع المضيفة الأجسام المضادة الأولية، في هذه الحالة أرنب لمكافحة فأر F (أ ب _"2)) في TBS إلى تركيز المطلوب (1:300 تمييع) وتطبيقه على الشرائح. احتضان لمدة 2 ساعة على RT.
7. إعداد معقدة لا يقل عن 30 دقيقة البيوتين البيروكسيديز streptavidin قبل الاستخدام. ضمان وجود ما يكفي لتغطية كافة الشرائح. تغسل الشرائح في TBS ثلاث مرات. تطبيق الحل على الشرائح واحتضان لمدة 2 ساعة على RT.
8. تغسل الشرائح في TBS ثلاث مرات. إعداد 3-أمينو-9-ethylcarbazole (AEC) حل البيروكسيديز الركيزة (صنع في تعليمات الشركة الصانعة). تطبيقه على الشرائح واحتضان لمدة 20-30 دقيقة أو حتى شدة وصمة عار المطلوب يتطور.
9. شطف الشرائح في ادارة مياه الصنبور لمدة 5 دقائق. مباين الأقسام مع حل haematoxylin تصفيتها ماير لمدة 2 دقيقة. تغسل الشرائح في ادارة مياه الصنبور لمدة 5 دقائق.
10. استنزاف الشرائح وتغطية أقسام المتوسطة مع تصاعد مائي دائم. تجفيف الشرائح في 80 درجة مئوية في فرن التجفيف. السماح للشرائح حتى يبرد، ومن ثم تحميل لهم DPX ووضع ساترة.

5. القديستحليل aining

1. تحليل الأقسام في 40X التكبير باستخدام المجهر الضوئي مع كاميرا محمولة متصلة بجهاز كمبيوتر.
   ملاحظة: للحصول على تحليل الخلوي، العد الملون بشكل إيجابي، وخلايا الأنوية داخل الصفيحة المخصوصة القصبي وظهارة سليمة، باستثناء مناطق العضلات الملساء والغدد والأوعية الدموية الكبيرة، والأنسجة غير متطابقة أو التالفة.
2. متوسط ​​عدد الخلايا وتصحيح متوسط ​​عدد خلايا لمنطقة الصفيحة المخصوصة وطول ظهارة. ويمكن حساب منطقة الصفيحة المخصوصة وطول ظهارة باستخدام برنامج تحليل الصور.

6. الأنزيمية الهضم من ضمن القصبة الخزعات

1. الخزعات غسل: استخدام ملقط معقم، مكان الخزعات سليمة في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل من محلول ملحي مخزنة هانك (HBSS) (الشكل 3). احتضان لمدة 5 دقائق على RT على منصة هزاز في 30 دورة في الدقيقة. نقل الخزعات إلى د معقمإيش من قبل الصب محتوى أنبوب 15 مل مع HBSS.
2. تعطيل المخاط مع DTT: استبدال HBSS في أنبوب مع 10 مل من HBSS تحتوي على 5 ملم 1،4-dithiothreitol (DTT). نقل الخزعات مرة أخرى في أنبوب 15 مل باستخدام ملقط معقم. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT على منصة هزاز في 30 دورة في الدقيقة.
3. دوامة أنبوب بلطف لمدة 15 ثانية. نقل الخزعات على طبق العقيمة التي كتبها الصب محتوى أنبوب 15 مل مع HBSS والتلفزيون الرقمي الأرضي.
4. نقل الخزعات إلى ثقافة المتوسط: استبدال HBSS والتلفزيون الرقمي الأرضي في الأنبوب مع 10 مل من RPMI 1640 مستنبت. نقل الخزعات مرة أخرى في أنبوب 15 مل باستخدام ملقط معقم. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT على منصة هزاز في 30 دورة في الدقيقة.
5. هضم الخزعات مع كولاجيناز والدناز.
   1. يعد حل هضم كولاجيناز الثاني (0.25 ملغ / مل)، والدناز (0.2 ملغ / مل) في درجة حرارة ما قبل RPMI تحتوي على 1 حل M HEPES. إضافة 500 ميكرولتر من محلول الهضم لكل بئر في عبادة الأنسجة 48-جيدا لوحة لدى عودتهم.
   2. ضع 1 خزعة لكل بئر في حل الهضم. احتضان لوحة على منصة تهتز لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 220 دورة في الدقيقة. ماصة صعودا وهبوطا بعد 30 دقيقة لإعادة تفريق الخزعات، وبعد 60 دقيقة، لتفصيل تماما الأنسجة.
6. إعداد تعليق خلية واحدة.
   1. تجمع معا الخزعات هضمها من الآبار في أنبوب 50 مل بتمريرها من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون. جمع الخلايا المتبقية عن طريق غسل الآبار مع العازلة FACS المثلج (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني).
   2. ضغط على الأنسجة المتبقية على مصفاة الخلية باستخدام الجزء الخلفي من المكبس من حقنة. الطرد المركزي الخلايا هضمها في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة بعناية طاف و resuspend بيليه في 5 مل من FACS العازلة الجليد الباردة. عد الخلايا يدويا باستخدام عدادة الكريات والتريبان وصمة عار الزرقاء لتقييم جدوى من الخلايا.

= "jove_title"> 7. تدفق تحليل Cytometric من الخلايا واحدة من ضمن القصبة الخزعات بعد الأنزيمية الهضم

1. Resuspend وبيليه الخلية إلى ما يقرب من 1 × 10 ⁶ خلايا في 200 ميكرولتر من FACS العازلة.
2. إضافة صبغة بقاء الخلية لاستبعاد خلية ميتة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
3. إضافة 5 ميكرولتر من FCR حجب كاشف واحتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
4. إضافة الأجسام المضادة سطح الخلية ضد CD45 (2 ميكرولتر)، النسب (CD3، CD20، CD56، CD66abce، وCD14، 2 ميكرولتر لكل منهما)، CD16 (0.5 ميكرولتر)، HLA-DR (3 ميكرولتر)، CD11c و(5 ميكرولتر)، CD123 (5 ميكرولتر)، CD1c (3 ميكرولتر)، وCD103 (2 ميكرولتر) واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. تفاصيل عن الأجسام المضادة يمكن العثور عليها في قسم الطرق، ولكن عاير وتحسين الأجسام المضادة لتدفق الدقيق الكريات في الاستخدام. يغسل الأجسام المضادة الزائدة مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في 400 ز س. الحصول على عينات جديدة على قياس التدفق الخلوي أو إصلاح الخلايا في 1٪ امتصاص العرق قبل acquisit في وقت لاحقأيون.
5. تحديد البلدان النامية الإنسان في الخزعات الرئة باستخدام التدفق الخلوي مقايسة ¹⁸ (الشكل 4).
   ملاحظة: استخدام التدفق الخلوي برامج التحليل، وتتميز الخلايا المناعية من خلايا الرئة الأخرى التي تبوب على CD45. يمكن استبعاد الخلايا الميتة كما الخلايا التي هي ايجابية لايف / صبغ الميت. جميع CD45 ⁺ الحية الخلايا، والخلايا النسب (خلايا B وخلايا T، الخلايا القاتلة الطبيعية، العدلات، وحيدات) يمكن استبعاد باستخدام مزيج من الأجسام المضادة ضد CD20، CD3، CD56، CD66abce، CD14، CD16 وفي قناة واحدة. وبعد ذلك، HLA-DR ⁺ خلايا سيسمح بتحديد كافة DC الإنسان. MDCs يمكن تمييزها عن PDCS على أساس التعبير عن CD11c وأو عدم وجود CD11c و، على التوالي. MDCs يمكن تقسيمها الى مزيد من CD1c ⁺ MDCs أو CD141 ^+.

النتائج

الدراسات التي تميز الجهاز التنفسي الخلايا المناعية الأنسجة المقيمين الإنسان، بما في ذلك البلدان النامية، محدودة، يرجع إلى حد كبير إلى حقيقة أن ازالتها جراحيا أو كاملة أنسجة الرئة البشرية الشحيحة. هنا، والخطوط العريضة لطريقة أقل الغازية للحصول عل?...

Discussion

وتصف هذه الورقة كيفية إنشاء توصيف المكاني وphenotypical مفصل من الرئة البلدان النامية الأنسجة المقيمين في البشر صحية باستخدام المناعية والتدفق الخلوي على خزعات المخاطية داخل القصبة التي تم جمعها خلال تنظير القصبات. في الفقرات التالية تناقش الخطوات الحاسمة في البروتوكول...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160	Olympus	BF1T160
Light source	Olympus	Exera CV-160
Fenestrated forceps	Olympus	FB21C	Used to take biopsies
Bite Block	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glucose 25%			500 ml intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml			Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o			Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40 mg/ml			Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100 mg/ml spray			Administered to back of throat
Lidocaine 20 mg/ml spray			Administered via bronchoscope to airways
GMA processing and embedding
Glass vials			5 ml
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-1L
Molecular sieves, 4 Å	Alfa Aesar	88120	3-4 mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P-7626	0.035 g/100 ml acetone
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I-6125	0.37 g/100 ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules	TAAB laboratories	C094	500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder	TAAB laboratories	C054	Holds 25 8 mm capsules
JB-4 GMA embedding kit	Polysciences	00226	Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate	Sigma-Aldrich	27614-1L
Silica gel with humidity indicator	Scharlau	GE0043	2.5-6 mm
GMA sectioning
Glass microscope slides	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Capsule splitter	TAAB laboratories	C065
Carbon steel single edge blades	TAAB laboratories	B054
Vice
Ammonia, 25%	VWR	1133.1000	2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%)
Microtome	Leica		Leica RM 2165
Light source	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand	Leica		Leica MZ6
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen	Histolab	5218
Hydrogen peroxide 30% solution	AnalaR Normapur	23619.264
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Sodium chloride	VWR chemicals	27810.295
Bovine serum albumin	Millipore	82-045-2	Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anti-human CD45 antibody	BioLegend	304002	Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody	AbD Serotech	MCA80GA	Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control	Abcam	ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite	Vector Labs	SK-4200
Mayers haematoxylin	HistoLab	01820
Permanent Aqueous Mounting Medium	AbD Serotech	BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution	VWR	360292F
Light microscope	Leica		Leica DMLB
Microscope camera	Leica		Leica DFC 320
Analysis software	Leica		Leica Qwin V3
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Forceps
Platform rocker	Grant instruments	PMR-30
50 ml conical tubes	Falcon	14-432-22
40 µm cell strainer	Falcon	352340
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD	335829
CD56	Biolegend	318332
CD66abce	Miltenyi	130-101-132
HLA-DR	BD	555813
CD14	BD	557831
CD16	Biolegend	302026
CD11c	BD	560369
CD1c	Miltenyi	130-098-009
CD141	Miltenyi	130-090-514
CD103	Biolegend	350212
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
LSR II Flow cytometer	BD		Flow cytometer
FlowJo	FlowJo		Software for analysis