Menschliche Lunge Dendritische Zellen: Räumliche Verteilung und phänotypische Identifizierung in Endobronchial Biopsien mittels Immunhistochemie und Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Zusammenfassung

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Einleitung

Die Lungen sind in ständigem Kontakt mit der äußeren Umgebung und sind an beiden unschädliche Teilchen und Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Krankheit zu verursachen stark ausgesetzt. Daher ist es von entscheidender Bedeutung für das Immunsystem wirksamer Immunreaktionen gegen eindringende Pathogene zu montieren, aber es ist ebenso wichtig, Toleranz gegenüber inhalierten Antigenen zu erhalten, die nicht Krankheit verursachen kann. Bereitzustellen potent Immunüberwachung wird das Atmungssystem mit einem Netzwerk von Immunzellen ausgekleidet, einschließlich dendritischen Zellen (DCs). DCs sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die mit der einzigartigen Fähigkeit naive T-Zellen zu aktivieren. In menschlichen Lungen auftreten resident DCs ein Antigen und dann verarbeiten und transportieren sie in die Lunge-drainierenden Lymphknoten zur Präsentation an und Aktivierung von T - Zellen ^{1, 2, 3.}

Im menschlichen Immunsystem kann DCs in mehrere Untergruppen unterteilt werden, mit Distinct aber überlappende Funktionen: CD1c ⁺ und CD141 ⁺ myeloider DCs (MDC) und CD123 ⁺ plasmazytoiden DCs (PDCs) ^{4, 5.} Während die meisten detailliertes Wissen über die menschliche DCs aus Studien in Blut stammt, ist nun klar , dass die menschliche Lunge ⁹ auch seltene Populationen von DC Untergruppen mit T-Zell - stimulierende Kapazität ^{6, 7, 8,} Hafen. Allerdings zeigen anfallenden Daten , dass Immunzellen, einschließlich DCs, unterscheiden sich in ihrer Frequenz, Phänotyp und Funktion in Abhängigkeit von ihrer anatomischen Lage ^10. Somit ist es wichtig, Immunzellen aus dem relevanten Gewebe zu studieren ihren Beitrag zur lokalen Immunität und Toleranz zu verstehen. Zusammengenommen unterstreicht dies die Notwendigkeit, Lungenresidenten DCs zu studieren, wenn Lungenerkrankungen Adressierung trotz Blut DCs mehr ist leicht verfügbar und zugänglich in Menschen.

Die ersten Studien , die Lungenresidenten DCs beim Menschen in erster Linie untersucht verließ sich auf die Morphologie und die Expression einzelner Marker, wie HLA-DR und CD11c, in Gewebeschnitten mittels Immunhistochemie ^{11, 12, 13.} Im Gegensatz dazu haben neuere Studien der Regel auf durchflusszytometrischen verlassen analysiert verschiedene Immunzelluntergruppen zu untersuchen. Da es jedoch schwierig ist, einen einzelnen Zelloberflächenmarker zu finden, die eindeutig einen bestimmten DC Subset identifiziert, ist die potentielle Begrenzung der Studien Anwendung nur Vierfarben-Durchflusszytometrie das Risiko Zellpopulationen mit ähnlichen phänotypischen Marker wie DCs von einschließlich. Zum Beispiel CD11c wird auf allen myeloiden DCs und die überwiegende Mehrzahl der Monozyten exprimiert. Auf der anderen Seite, in Studien fortgeschritteneren Durchflusszytometrie Platten, nicht-kanzerösen Lungengewebe von chirurgische Resektionen von Patienten Anwendung wurden typischerweise verwendet,xref "> ^{10, 14, 15, 16,} obwohl es ist unklar , ob diese seltenen Populationen von DCs in gesunden Probanden wirklich repräsentativ sind. Insgesamt sind im Wesentlichen auf die Tatsache Studien begrenzt , dass chirurgisch entfernt oder ganze menschliche Lungengewebe ist knapp.

Um einige dieser Einschränkungen zu überwinden, beschreibt diese Arbeit, wie eine detaillierte Analyse der räumlichen Verteilung und einer phänotypischen Identifizierung von DCs in der Schleimhaut endobronchiale Biopsien von gesunden Freiwilligen erhalten auszuführen, die eine Bronchoskopie unterziehen. Mehrere kleine Biopsien können von jedem einzelnen gesammelt werden und anschließend eingebettet werden kann für das Schneiden und Analyse Immunhistochemie oder enzymatisch für fortgeschrittene durchflusszytometrische Analyse verdaut. Verwendung von Lungengewebe in Form von endobronchialen Biopsien von Bronchoskopie erhalten verleiht den Vorteil, dass es möglich, die st auszuführenudy an gesunden Freiwilligen, im Gegensatz zu einer offenen Operation der Lunge, die aus offensichtlichen Gründen ist, beschränkt sich auf Patienten, die Thoraxchirurgie erfordern. Weiterhin das Gewebe, das während einer Bronchoskopie von gesunden Freiwilligen abgetastet ist physiologisch normal, im Gegensatz zu einem nicht-betroffenen Bereich von Lungengewebe bei Patienten mit einer Lungenkrankheit. Auf der anderen Seite sind die Biopsien klein und die Anzahl der Zellen wiedergewonnen, selbst wenn mehrere Biopsien Bündelung begrenzt den Typ von Analyse, die durchgeführt werden können.

Während die vorliegende Arbeit auf DCs konzentriert sich die beschriebenen Methoden direkt erweitert werden kann, um andere (Immun-) Zellen von Interesse, die in der menschlichen Schleimhaut Lungengewebe befinden umfassen. Darüber hinaus sind die Protokolle auch direkt anwendbar auf Proben von Patienten erhalten von Lungenerkrankungen leiden, wo Bronchoskopie Teil der Feststellung der Diagnose, wie zB chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), Sarkoidose oder Lungenkrebs ist.

Protokoll

HINWEIS: Diese Arbeit wurde von der regionalen Ethical Review Board in Umeå, Schweden genehmigt wurde.

1. Bronchoskopie zur Probenahme Endobronchial Biopsien von Human Subjects

1. Erhalten Sie informierte Zustimmung aller Beteiligten.
2. Behandeln Sie Patienten mit oralem Midazolam (4-8 mg) und intravenöse Glycopyrroniums (0,2-04 mg) 30 Minuten vor der Bronchoskopie. Bewerben Lokalanästhesie mit Lidocain in den Larynx und der Bronchien. Lassen Sie das Thema Gurgeln mit ~ 3 ml Lidocain 4% und gelten 3 ml auf die Zungengrund und in den Larynx über eine Larynx Spritze. Optimieren Sie die Lokalanästhesie mit 8-10 Dosen von Lidocain-Spray. Führen Sie diesen Schritt mit dem Thema Sitzen.
3. Legen Sie eine flexible Video-Bronchoskop durch den Mund über ein Mundstück aus Kunststoff mit dem Thema in der Rückenlage. Verwenden Sie einen speziell angefertigten Spritz Katheter die Lokalanästhesie der distalen Trachea und der Bronchien über das Bronchoskop zu vervollständigen. Hier verwenden, um eine Dosis von ungefähr5-10 ml Lidocain 2%.
4. Nehmen Sie 6-9 endobronchiale Schleimhaut - Biopsien von der Haupt carina und die wichtigsten bronchiale Divisionen mit Fenstern versehenen Zange (Abbildung 1). Im Anschluss an die Bronchoskopie und vor dem Verlassen des Krankenhauses, lassen Sie den Gegenstand Rest für 2-4 Stunden und ihm / ihr mit einer leichten Mahlzeit.

2. Die Einbettung der Biopsien in Glycol Methylacrylat (GMA) Harz

HINWEIS: Die GMA Immunofärbungsprotokoll ursprünglich an der Universität Southampton, Histochemie Research Unit ¹⁷ entwickelt wurde.

1. Befestigung: Für die Immunhistochemie, die Biopsien aus der Zange entfernen und legen Sie sie direkt in Fläschchen Glas mit 3 ml eiskaltem dehydriert Aceton und Protease-Inhibitoren (Phenylmethylsulfonylfluorid (35 mg / 100 ml Aceton) und Iodacetamid (370 mg / 100 ml Aceton )). Befestigen Sie das Gewebe über Nacht bei -20 ° C (Abbildung 2).
   HINWEIS: Die folgenden Schritte perfo werden sollin einem Abzug mit geeigneten Nitrilhandschuhen RMED. Die Einbettung Kit enthält Komponenten, die Sensibilisierung, Reizungen verursachen können, und / oder allergischen Hautreaktionen kommen. Alle Abfälle sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen.
2. Dehydration: Entfernen Sie das Aceton mit Inhibitoren und ersetzen mit frischen dehydriert Aceton (ohne Inhibitoren) für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Entfernen Sie das Aceton und ersetzen Sie es mit Benzoesäuremethylester für 15 min.
3. Infiltrations: Vorbereiten einer Verarbeitungslösung von 5% Benzoesäuremethylester Lösung in Glykol Methacrylatmonomer; 10 ml ist für ein Fläschchen ausreichend. Mit Kunststoff-Pasteurpipetten, absaugen der Benzoesäuremethylester Lösung und ersetzen mit 3 ml Verarbeitungslösung. Inkubieren der Biopsien und überschüssige Behandlungslösung bei 4 ° C für 2 h; Pasteur-Pipetten können für alle nachfolgenden Lösung Änderungen verwendet werden, einschließlich Lösung zu integrieren.
4. Tauschen Sie die Verarbeitungslösung alle 2 Stunden (3x 2 h Inkubationen), so dass die gesamte Infiltrationszeit des Biopsies in der Verarbeitungslösung beträgt mindestens 6 Stunden. Legen Sie Papieretiketten in das obere Ende der Einbettung Kapseln die Biopsien zu identifizieren.
5. Vorbereiten eines Einbettungs Lösung von 75 mg Benzoylperoxid in 10 ml Glykol Methacrylatmonomer. Zugabe von 0,25 ml N, N - Dimethylanilin Poly (ethylenoxid) (Beschleuniger) zum Einbettungslösung um die Polymerisationsreaktion zu beginnen. Entfernen Sie die Verarbeitungslösung und legen Sie eine Biopsie in die entsprechende Einbettung Kapsel mit einer Pinzette.
6. Langsam füllen an die Spitze der Einbettung Kapsel mit Lösung Einbetten und die Kappe schließen. Vermeiden Sie die Biopsie zu stören und große Luftblasen zu schaffen. Inkubieren Sie die Kapseln bei 4 ° C, bis das Harz vollständig polymerisiert ist.
7. Speichern der eingebetteten Biopsien bei -20 ° C in einem 50 ml-Röhrchen ca. 5 g Kieselgel enthält.

3. Sectioning von GMA-embedded Endobronchial Biopsien

1. Objektträger-Beschichtung: Waschen Sie die Objektträger in einGeschirrspüler auf einem normalen Zyklus. Decken Sie die Dias und lassen sie an der Luft trocknen.
2. Vorbereitung einer Beschichtungslösung aus 10% Poly-L-Lysin (PLL) Lösung in destilliertem Wasser. Tauchen Sie die Folien in Beschichtungslösung für 5 Minuten, und sie dann an der Luft trocknen lassen. Trocken lagern PLL-beschichteten Folien in der Originalverpackung.
3. Blatt Glasstreifen mit 0,1% Tween 20 in destilliertem Wasser waschen. Spülen Sie das Glas mit 70% Ethanol und mit Papiertüchern trocken. Schneiden Sie Glas Klingen aus dem Glasstreifen mit einem Messermacher verwenden. Lagern Sie die Blätter in einen Behälter, der Bewegung, um sicherzustellen, wird verhindert, dass die Schneidkante nicht beschädigt wird oder gekerbt.
4. Biopsy Besatz: Legen Sie die Biopsie Kapsel in einer Kapselsplitter und fällten jede Seite mit einem Kohlenstoff-Stahl Single-Kante Klinge. Entfernen Sie die GMA-embedded Biopsie und stecken Sie sie fest in einen Schraubstock. Überschüssiges GMA aus der ganzen Biopsie mit Hilfe der Stahlklinge.
5. GMA Schnitte.
   1. Bereiten 0,05% Ammoniaklösung mit destilliertem Wasser. Das Glas Messer und Biopsie in the Mikrotom. Sorgfältig ausrichten Block die Biopsie-Block mit der Klinge den Messerhalter durch die Einstellung und den Winkel der Biopsie, so dass die Klinge gegen die Oberfläche des Blocks flach aufliegt.
   2. Schneiden Sie 2 um dicke Abschnitte das Mikrotom auf eine langsame Schnittgeschwindigkeit und verwenden Zange zu übertragen und Schwimmer aus Abschnitten auf dem Ammoniakwasser. Schwimmer die Abschnitte für 45-90 Sekunden, so dass sanfte Antigen-Retrieval und Entfaltung des Abschnitts.
   3. Pick-up Abschnitte mit Mikroskop-Objektträger. Überprüfen Sie die Biopsie Histologie durch schnell mit Toluidinblaufärbung.
   4. Trocknen Sie die Dias auf einer heißen Platte auf 50 ° C und anwenden 500 ul gefiltert Toluidinblau Fleck auf einen Abschnitt einer Kunststoff Pasteurpipette. Erwärmen Sie den Abschnitt auf der heißen Platte, bis ein grüner Ring am Rand des Flecks zu entstehen beginnt, und dann mit Wasser abwaschen.
   5. Mit einem Lichtmikroskop, überprüfen Sie die Biopsie Histologie. Bereiche für die Immunhistochemie verwendet werden, sollten gute Bereiche unbeschädigter Lamina enthaltenpropria und Epithel, mit möglichst wenigen Drüsen und so wenig wie möglich der glatten Muskulatur.
   6. Wie in Abschnitt 3.4.2, schneiden Abschnitte, die gute Histologie haben und holen sie mit PLL-beschichteten Objektträger für die immunhistochemische Färbung auf. Schneiden mindestens zwei Abschnitte von jeder Biopsie für die Analyse. Trockenobjektträger für mindestens 1 Std. Nach dem Trocknen Abschnitte können in Stanniol und gelagert bei -20 ° C für bis zu 2 Wochen eingewickelt werden oder sie können sofort immunhistochemisch werden.

4. immunhistochemischen Färbung von GMA-embedded Endobronchial Biopsien

HINWEIS: Natriumazid ist giftig. Bereiten Sie die 0,1% Natriumazid-Lösung innerhalb einer Abzugshaube und weg von Säuren. Berührung mit Säure giftige Gase.

1. Zeichnen Sie um Abschnitte einen Diamantstift und die Dias auf eine Färbebank arrangieren.
2. Führen Sie einen Peroxidase-Block. Bereiten einer Peroxidase Block Lösung von 0,3% Wasserstoffperoxid in 0,1% Natriumazid-Lösung. Apply 1 ml der Peroxidase Block Abschnitte und für 30 min inkubieren.
3. Bereiten Sie eine Waschlösung von 0,05 M Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), pH 7,6. Waschen Sie die Folien in TBS, 3x 5 min.
4. Bereiten Sie eine 1% BSA-Block-Lösung in DMEM. Tun Sie dies im Voraus und in großen Mengen aliquotieren und einfrieren, bis sie benötigt. Lassen Sie die Folien und brüten die Abschnitte in Blocklösung für 30 min unspezifische Antikörper zu blockieren Bindung. Wenn unspezifische Bindung immer noch auftritt, umfassen eine 30 min Inkubationsschritt mit 5% Serum Block von der gleichen Spezies wie der sekundäre Antikörper.
5. Verdünnte primärer Antikörper (CD45 oder CD1a) in TBS auf die gewünschte Konzentration (CD45 bei einer Verdünnung von 1: 1000; CD1a bei einer Verdünnung von 1: 1,00) und es auf Folien. Deckglas die Abschnitte und über Nacht bei RT inkubiert.
6. Waschen Dias in TBS dreimal. Verdünnte biotinylierten sekundären Antikörper (gerichtet gegen den primären Antikörper Wirtsspezies, in diesem Fall von Kaninchen - anti-Maus - F (ab _'2)) in TBS auf die gewünschte Konzentration (1:300 Verdünnung) und es auf Folien. Inkubieren für 2 h bei RT.
7. Bereiten Sie eine Streptavidin Biotin-Peroxidase-Komplex mindestens 30 min vor dem Gebrauch. Stellen Sie sicher, dass es genug für alle Folien abzudecken. Waschen Sie die Folien in TBS dreimal. Tragen Sie die Lösung auf die Objektträger und Inkubation für 2 h bei RT.
8. Waschen Sie die Folien in TBS dreimal. Bereiten Sie 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) Peroxidase-Substratlösung (hergestellt pro Anweisungen des Herstellers). Wenden Sie es auf den Schlitten und Inkubation für 20-30 Minuten oder bis die gewünschte Farbintensität entwickelt.
9. Spülen Sie die Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min. Gegenfärbung der Schnitte mit gefilterten Mayers Hämatoxylin-Lösung für 2 min. Waschen Sie die Folien Leitungswasser für 5 Minuten in Laufen.
10. Lassen Sie die Folien und decken die Bereiche mit permanenten wässrigen Eindeckmittel. Trocknen der Objektträger bei 80 ° C in einem Trockenofen. Lassen Sie die Folien, abkühlen lassen und dann montieren sie mit DPX und setzen Sie ein Deckglas.

5. Staining Analyse

1. Analysieren Sie die Abschnitte bei 40-facher Vergrößerung eines Lichtmikroskops mit einer montierten Kamera an einen Computer angeschlossen.
   HINWEIS: Für die Zellanalyse, Graf positiv gefärbt, kernhaltigen Zellen in der bronchialen Lamina propria und intakten Epithels, ohne Bereiche der glatten Muskulatur, Drüsen, große Blutgefäße, und nicht übereinstimmen oder beschädigtes Gewebe.
2. Der Mittelwert der Zellzahlen und korrigieren Sie die durchschnittliche Zellzahl für den Bereich der Lamina propria und der Länge des Epithels. Der Bereich der Lamina propria und die Länge des Epithels kann unter Verwendung eines Bildanalyseprogramm berechnet werden.

6. Die enzymatische Verdauung von Endobronchial Biopsien

1. Waschen Biopsien: Unter Verwendung einer sterilen Pinzette Ort intakten Biopsien in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 10 ml Hanks gepufferte Salzlösung (HBSS) (Abbildung 3). Inkubieren für 5 min bei RT auf einem Schüttler bei 30 Umdrehungen pro Minute. Übertragen Sie die Biopsien in ein steriles dIsh durch den Inhalt des 15-ml-Röhrchen mit HBSS dekantiert.
2. Brechender Schleim mit DVB-T: Ersetzen Sie die HBSS in der Röhre mit 10 ml HBSS, enthaltend 5 mM 1,4-Dithiothreitol (DTT). Übertragen Sie die Biopsien zurück in die 15-ml-Röhrchen mit einer sterilen Pinzette. Inkubieren für 15 min bei RT auf einem Schüttler bei 30 Umdrehungen pro Minute.
3. Mischen Sie den Schlauch vorsichtig für 15 Sekunden. Übertragen Sie die Biopsien auf eine sterile Schale durch den Inhalt des 15-ml-Röhrchen mit HBSS und DTT Umfüllen.
4. Die Übertragung der Biopsien in das Kulturmedium: Ersetzen Sie die HBSS und DTT in dem Röhrchen mit 10 ml RPMI 1640-Kulturmedium. Übertragen Sie die Biopsien zurück in die 15-ml-Röhrchen mit einer sterilen Pinzette. Inkubieren für 10 min bei RT auf einem Schüttler bei 30 Umdrehungen pro Minute.
5. Verdauen Biopsien mit Kollagenase und DNase.
   1. Bereiten Sie eine Aufschlußlösung von Kollagenase II (0,25 mg / ml) und DNase (0,2 mg / ml) in vorgewärmten RPMI mit 1 M HEPES-Lösung. In 500 ul der Aufschlusslösung pro Well in einer 48-Well-Gewebe Kulture Platte.
   2. Platz 1 Biopsie pro Vertiefung in Aufschlußlösung. Inkubieren der Platte auf einer Schüttelplattform 60 Minuten lang bei 37 ° C bei 220 rpm. Pipette nach oben und unten nach 30 Minuten, um die Biopsien wieder zu dispergieren, und nach 60 min vollständig in das Gewebe aufzuschlüsseln.
6. Vorbereiten Einzelzellsuspensionen.
   1. Pool zusammen die verdauten Biopsien aus den Vertiefungen in einen 50-ml-Röhrchen, indem es durch ein 40 & mgr; m Zellsieb verläuft. Sammle die restlichen Zellen durch die Vertiefungen mit eiskaltem FACS-Puffer gewaschen (Phosphate-buffered saline (PBS), enthaltend 2% fötales Rinderserum).
   2. Quetschen das verbleibende Gewebe auf der Zellsieb die Rückseite des Kolbens einer Spritze. Zentrifugiere die verdauten Zellen bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand sorgfältig entfernen und das Pellet in 5 ml eiskaltem FACS-Puffer resuspendieren. Zählen Sie die Zellen manuell ein Hämozytometer und Trypanblau-Färbung mit der Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen.

7. Durchflusszytometrische Analyse von Einzelzellen von Endobronchial Biopsien nach enzymatische Verdauung

1. Resuspendieren des Zellpellets auf etwa 1 x 10 ⁶ Zellen in 200 & mgr; l FACS - Puffer.
2. Fügen Sie eine Lebensfähigkeit der Zellen Farbstoff für tote Zelle Ausschluss gemäß dem Protokoll des Herstellers.
3. In 5 ul FcR-Blockierungsreagenz und Inkubation für 5 min bei 4 ° C.
4. In Zelloberfläche Antikörper gegen CD45 (2 ul), Linie (CD3, CD20, CD56, CD66abce und CD14; 2 ul jeweils), CD16 (0,5 ul), HLA-DR (3 ul), CD11c (5 ul), CD123 (5 ul), CD1c (3 ul) und CD103 (2 ul) und für 15 min bei 4 ° C inkubieren. Details zu Antikörper können in dem Abschnitt Verfahren gefunden werden, aber titrieren und die Antikörper auf die genaue Durchflusszytometer im Einsatz zu optimieren. überschüssige Antikörper mit PBS für 5 min bei 400 x g abzuwaschen. Erwerben Sie die Proben frisch auf einem Durchflusszytometer oder die Zellen in 1% Paraformaldehyd fixieren vor später acquisitIon.
5. Identifizieren menschlichen DCs in Lungenbiopsien unter Verwendung einer Durchflusszytometrie - Assay ¹⁸ (Abbildung 4).
   HINWEIS: eine Durchflusszytometrie-Analyse-Software verwendet wird, werden Immunzellen aus anderen Lungenzellen zeichnen sich durch auf CD45 Gating. Tote Zellen können als Zellen ausgeschlossen werden, dass für die Live / Dead-Farbstoff positiv sind. Von allen Live - CD45 ⁺ Zellen, Linie Zellen (B - Zellen, T - Zellen, NK - Zellen, Neutrophilen und Monozyten) in einem Kanal mit einem Cocktail von Antikörpern gegen CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 und CD16 werden ausgeschlossen. Dem folgend, HLA-DR ⁺ Zellen die Identifizierung aller humanen DCs ermöglichen. MDCs kann von PDCs unterschieden werden basierend auf der Expression von CD11c oder das Fehlen von CD11c, respectively. MDCs können weiter in CD1c ⁺ MDCs oder CD141 ⁺ unterteilt werden.

Ergebnisse

Studien an menschlichen Atmungsgewebe residenten Immunzellen zu charakterisieren, einschließlich DCs, sind begrenzt, vor allem aufgrund der Tatsache, dass chirurgisch entfernt oder ganze menschliche Lungengewebe ist knapp. Hier wird eine weniger invasive Methode der Lungengewebe von endobronchialen Biopsien erhalten (EBB) von gesunden Freiwilligen und entwickelten Protokolle, die Immunzellen in das Gewebe zu studieren Immunhistochemie unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder skizz...

Diskussion

Dieses Dokument beschreibt, wie eine detaillierte räumliche und phänotypischen Charakterisierung von Lungengewebe residenten DCs bei gesunden Menschen zu erzeugen, Immunhistochemie und Zytometrie auf endobronchiale Schleimhaut-Biopsien während der Bronchoskopie gesammelt fließen. In den folgenden Absätzen kritischen Schritte in dem Protokoll werden im Detail diskutiert.

Kritische Schritte mit dem Protokoll

Schneiden und Immunhistochemie: Es ist wichtig, die Bio...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160	Olympus	BF1T160
Light source	Olympus	Exera CV-160
Fenestrated forceps	Olympus	FB21C	Used to take biopsies
Bite Block	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glucose 25%			500 ml intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml			Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o			Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40 mg/ml			Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100 mg/ml spray			Administered to back of throat
Lidocaine 20 mg/ml spray			Administered via bronchoscope to airways
GMA processing and embedding
Glass vials			5 ml
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-1L
Molecular sieves, 4 Å	Alfa Aesar	88120	3-4 mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P-7626	0.035 g/100 ml acetone
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I-6125	0.37 g/100 ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules	TAAB laboratories	C094	500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder	TAAB laboratories	C054	Holds 25 8 mm capsules
JB-4 GMA embedding kit	Polysciences	00226	Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate	Sigma-Aldrich	27614-1L
Silica gel with humidity indicator	Scharlau	GE0043	2.5-6 mm
GMA sectioning
Glass microscope slides	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Capsule splitter	TAAB laboratories	C065
Carbon steel single edge blades	TAAB laboratories	B054
Vice
Ammonia, 25%	VWR	1133.1000	2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%)
Microtome	Leica		Leica RM 2165
Light source	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand	Leica		Leica MZ6
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen	Histolab	5218
Hydrogen peroxide 30% solution	AnalaR Normapur	23619.264
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Sodium chloride	VWR chemicals	27810.295
Bovine serum albumin	Millipore	82-045-2	Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anti-human CD45 antibody	BioLegend	304002	Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody	AbD Serotech	MCA80GA	Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control	Abcam	ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite	Vector Labs	SK-4200
Mayers haematoxylin	HistoLab	01820
Permanent Aqueous Mounting Medium	AbD Serotech	BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution	VWR	360292F
Light microscope	Leica		Leica DMLB
Microscope camera	Leica		Leica DFC 320
Analysis software	Leica		Leica Qwin V3
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Forceps
Platform rocker	Grant instruments	PMR-30
50 ml conical tubes	Falcon	14-432-22
40 µm cell strainer	Falcon	352340
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD	335829
CD56	Biolegend	318332
CD66abce	Miltenyi	130-101-132
HLA-DR	BD	555813
CD14	BD	557831
CD16	Biolegend	302026
CD11c	BD	560369
CD1c	Miltenyi	130-098-009
CD141	Miltenyi	130-090-514
CD103	Biolegend	350212
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
LSR II Flow cytometer	BD		Flow cytometer
FlowJo	FlowJo		Software for analysis