İmünohistokimya ve Akım Sitometri Kullanımı Endobronşiyal Biyopsilerinde Mekansal Dağılımı ve Fenotipik Kimlik: İnsan Akciğer dendritik hücrelerin

Özet

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Özet

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Giriş

Akciğerler dış çevre ile sürekli temas halindeyiz ve çok hastalığa neden kapasitesine sahip hem zararsız parçacıkların ve mikropların maruz kalmaktadır. Bu nedenle, işgalci patojenlere karşı güçlü bir bağışıklık tepkisini monte bağışıklık sistemi için çok önemlidir, ancak hastalığa neden olmayan inhale edilen antijenler tolerans sağlamak için eşit derecede önemlidir. güçlü bir bağışıklık gözetim sağlamak için, solunum sistemi, dendritik hücreler (DC) da dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri, bir ağ ile astarlanmıştır. DH'ler naif T hücrelerini aktive etmek özgü kapasiteli profesyonel antijen sunan hücrelerdir. İnsan akciğerlerde, yerleşik DH'ler bir antijen ve sonra işlemi karşılaşırsanız ve T hücreleri ^{1, 2, 3} tanıtımı ve aktivasyonu için akciğer lenf düğümlerine taşıyın.

insan bağışıklık sisteminde, DCler Distin ile birkaç alt takımından ayrılabilirct ama örtüşen fonksiyonları: CD1c ⁺ ve CD141 ⁺ miyeloid DH'ler (MDC) ve CD123 ⁺ plazmositoid DC'ler (PDC) ^{4, 5.} Insan DC'lerde en detaylı bilgi kanda çalışmalardan kaynaklanıyor olsa da, insan akciğerleri de T-hücre uyarıcı kapasitesi ^{6, 7, 8, 9} DC alt gruplarının nadir popülasyonları liman artık açıktır. Ancak, biriken veri DC'lere dahil bağışıklık hücreleri, onların anatomik konumu ¹⁰ bağlı frekans, fenotip ve fonksiyon açısından farklılık göstermektedir. Nedenle, yerel bağışıklık ve hoşgörü katkılarını anlamak için, ilgili dokudan bağışıklık hücrelerini incelemek için önemlidir. Birlikte ele alındığında, bu kan DC'ler daha kolay kullanılabilir ve erişilebilir olmasına rağmen, akciğer hastalıkları ele alırken akciğer yerleşik DC'ler incelemek gerektiğinin altını çizen İnsanlarda.

Insanlarda akciğer yerleşik DH'lerin inceleyen ilk çalışmalar öncelikle immünohistokimya ^{11, 12, 13} kullanılarak doku kesitlerinde, morfoloji ve HLA-DR ve CD11c'nin olarak tek belirteçler, ifadesi dayanmıştır. Buna karşılık, genellikle akış sitometrik dayanıyordu daha yeni çalışmalar, farklı immün hücre alt grupları incelemek için analiz eder. bu benzersiz belirli bir DC alt kümesini tanımlayan tek bir hücre-yüzey işaretleyici bulmak zor olduğundan Ancak, çalışmaların potansiyel sınırlama sadece dört renkli akım sitometri uygulayarak DC'ler benzer fenotipik işaretleri ile hücre popülasyonlarının dahil riskidir. Örneğin, CD11c, tüm miyeloid DC'lerin ve monositlerin büyük çoğunluğu üzerinde ifade edilir. Öte yandan, çalışmalarda daha ileri akış sitometri panelleri uygulanması, hastanın cerrahi rezeksiyon ile ilgili kanserli olmayan akciğer dokusu tipik olarak kullanılanxref "> ^{10, 14, 15, 16,} nadir popülasyonları sağlıklı kişilerde DC'ler mevcut gerçekten temsilcisi olmadığı belirsizdir rağmen. Genel olarak, çalışmalar nedeniyle cerrahi olarak çıkarılırlar veya tüm insan akciğer dokusu kıt olmasından büyük ölçüde sınırlıdır.

Bu sınırlamalar bazılarının üstesinden gelmek için, bu iş mekansal dağılımı ve bronkoskopi geçmesi sağlıklı gönüllülerden elde edilen mukozal endobronşiyal biyopsi DC'lerin bir fenotipik tanımlama ayrıntılı bir analizini gerçekleştirmek açıklamaktadır. Birkaç küçük biyopsiler her birey alınabilir ve daha sonra kesit ve analiz gelişmiş akım sitometri analizi için sindirilmiş enzimatik immünhistokimya veya kullanmak için gömülü olabilir. bronkoskopi elde endobronfliyal biyopsi şeklinde akciğer dokusu kullanılarak mümkün st gerçekleştirmek için yapma avantajı kazandıranudy sağlıklı gönüllü üzerinde, akciğer açık cerrahi aksine bilinen nedenlerle, göğüs cerrahi gerektiren hastalar ile sınırlıdır, o. Ayrıca, sağlıklı gönüllülerden bir bronkoskopi sırasında örneklenir doku akciğer hastalığı olan hastalarda akciğer dokusunda olmayan bir etkilenen bölgeye aksine, fizyolojik olarak normaldir. Öte yandan, biyopsiler, küçük ve birden fazla biyopsileri havuzu da alınan hücrelerin sayısı, gerçekleştirilebilir analizlerin sınırlar.

Bu çalışma DC'ler odaklanırken, doğrudan genişletilebilir açıklanan yöntemler, insan mukozal akciğer dokusunda bulunan diğer ilgi (bağışıklık) hücreleri dahil etmek. Ayrıca, protokoller aynı zamanda bronkoskopi, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), sarkoidoz, ya da akciğer kanseri gibi tanı oluşturulması parçası olan pulmoner hastalıklardan muzdarip hastalardan elde edilen örneklerde için direkt olarak uygulanabilir.

Protokol

Not: Bu araştırma Umea, İsveç'te bölgesel Etik Değerlendirme Kurulu tarafından onaylandı.

İnsan Deneklerin Örnekleme Endobronşiyal Biyopsilerinde 1. Bronkoskopi

1. Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onam edinin.
2. Oral midazolam (4-8 mg) ve intravenöz glikopirronyum (0,2-04 mg) bronkoskopi önce 30 dk konuları davranın. gırtlak ve bronşlarda lidokain topikal anestezi uygulayın. lidokain% 4 ~ 3 ml konu gargara edelim ve dil kökünde ve bir gırtlak şırıngayla gırtlak içine 3 ml uygulanır. lidokain sprey 8-10 dozları ile topikal anestezi optimize edin. Konu oturma ile bu adımı yürütmek.
3. yatar pozisyonda konu ile plastik ağızlık yoluyla ağız yoluyla bir esnek video bronkoskop yerleştirin. bronkoskop aracılığıyla uzak trakea ve bronşların topikal anestezi tamamlamak için bir amaç yapımı sprey kateter kullanın. Burada yaklaşık bir doz kullanmaklidokain% 2 5-10 ml.
4. 6-9 ana karina endobronşiyal mukozal biyopsi ve Fenestralı forseps kullanarak ana bronş bölünmeler (Şekil 1) atın. bronkoskopi ardından ve hastaneden ayrılmadan önce, 2-4 saat boyunca söz konusu dinlensin ve hafif bir yemek ile onu / onu sağlamak.

2. Glikol Metil (GMA) reçine içinde Biyopsisi katıştırma

NOT: GMA immün protokol başlangıçta Southampton Üniversitesi, Histokimyası Araştırma Birimi ¹⁷ geliştirildi.

1. Sabitleme: İmmünohistokimya için, forseps biyopsi çıkarın ve (buz soğukluğunda susuz aseton ve proteaz inhibitörlerinin 3 ml içeren cam şişelere doğrudan fenilmetilsülfonil florid (35 mg / 100 mi aseton) yerleştirmek ve iyodoasetamid (370 mg / 100 mi aseton )). -20 ° C (Şekil 2) gece boyunca doku sabitleyin.
   Not: Aşağıdaki adımlar perfo edilmelidirUygun nitril eldiven ile davlumbaz rmed. gömme kiti hassasiyeti, tahriş ve / veya alerjik reaksiyonlara neden olabilir bileşenleri içerir. Tüm atık tehlikeli atık olarak bertaraf edilmelidir.
2. Dehidrasyon: inhibitörleri ile aseton alınır ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (RT) (inhibitörsüz), taze susuz aseton ile değiştirin. aseton çıkarın ve 15 dakika boyunca metil benzoat ile değiştirin.
3. Sızma: glikol metakrilat monomer içinde% 5 metil benzoat çözeltisi bir işleme çözeltisi hazırlanması; 10 mi, bir vial için yeterlidir. metil benzoat çözeltisi kapalı plastik pastör pipet, emme kullanılarak ve işleme çözeltisinin 3 ml'si ile değiştirin. biyopsileri ve 2 saat boyunca 4 ° C de aşırı işlem çözeltisinin inkübe; Pasteur pipet çözeltisi gömme dahil olmak üzere tüm müteakip çözeltisi değişiklikler için de kullanılabilir.
4. işleme çözüme her 2 saat (3x 2 saat inkubasyon), yani biyo toplam sızma süresini alışverişiişlem çözelti içinde psies en az 6 saattir. biyopsi tanımlamak için gömme kapsüllerin üst ucunu kağıt etiketleri yerleştirin.
5. glikol metakrilat monomer, 10 ml, 75 mg benzoil peroksit bir gömme çözeltisi hazırlayın. Polimerizasyon reaksiyonunu başlatmak için gömme çözeltisine, N, N -dimethylaniline poli (etilen oksit), 0.25 ml (gaz) ekleyin. işleme çözüm çıkarın ve forseps kullanarak ilgili gömme kapsül içine bir biyopsi yerleştirin.
6. Yavaşça çözüm gömme ile üst gömme kapsülünü dolduracak ve kapağını kapatın. biyopsi rahatsız ve büyük hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Reçine tamamen polimerize kadar 4 ° C 'de kapsüller inkübe edin.
7. silika jel, yaklaşık 5 g ihtiva eden bir 50 ml tüp içinde -20 ° C de gömülü biyopsi saklayın.

GMA gömülü Endobronşiyal Biyopsilerinde 3. Kesit

1. Mikroskop lamı kaplama: bir mikroskop slaytlar yıkayınNormal döngüsünde bulaşık makinesi. slaytlar Kapak ve havada kurumaya onlara izin.
2. damıtılmış su içinde% 10 poli-L-lisin (PLL) çözeltisi bir kaplama çözeltisi hazırlandı. 5 dakika boyunca kaplama solüsyonu slaytlar Batmak, ve daha sonra onlara hava kurumaya bırakın. kendi orijinal kutularında kuru PLL kaplı slaytlar saklayın.
3. damıtılmış su içinde% 0.1 Tween 20 düz cam şeridi yıkayın. kağıt havlu ile% 70 etanol ve kuru ile cam durulayın. Bir bıçak yapımcısı kullanarak cam şerit cam kanatları kesin. kesme kenarı hasarlı veya yakalattıracak olmadığından emin olmak için hareketi engelleyen bir kap içinde bıçakları saklayın.
4. Biyopsi kırparak: Bir kapsül ayırıcı biyopsi kapsülü yerleştirin ve bir karbon-çelik tek kenar bıçak kullanılarak her tarafı aşağı kesti. GMA gömülü biyopsi çıkarın ve bir mengeneye sıkıca yerleştirin. çelik bıçak kullanarak biyopsi etrafında aşırı GMA Trim.
5. GMA bölümleme.
   1. damıtılmış su ile% 0.05 amonyak çözeltisi hazırlayın. th cam bıçak ve biyopsi yerleştirine mikrotom. Dikkatle bıçak bloğunun yüzeyine düz duracak şekilde bıçak tutucu ve biyopsi bloğunun açısını ayarlayarak bıçak ile biyopsi bloğunu aynı hizaya getirin.
   2. Yavaş kesim hızı mikrotom kullanılarak 2 mikron kalınlığında bölümleri kesmek ve aktarmak ve amonyak su bölümleri yüzer forseps kullanabilir. nazik antijen alımı sağlayan ve bölümün açılımı, 45-90 saniye boyunca bölümleri yüzer.
   3. mikroskop lamı ile bölümleri toplayın. hızla toluidin mavisi ile boyanarak biyopsi histoloji kontrol edin.
   4. 50 ° C'ye kadar bir sıcak plaka kümesi slaytlar kurutun ve plastik bir Pasteur pipeti kullanılarak bir bölüme süzüldü toluidin mavi leke 500 ul uygulanır. yeşil bir halka leke kenarında ortaya çıkmaya başlayana kadar sıcak plaka bölümüne ısıtın ve daha sonra su ile iyice yıkayın.
   5. Bir ışık mikroskobu kullanılarak, biyopsi histoloji kontrol edin. immünohistokimya için kullanılan Bölümler hasarsız lamina iyi alanlarını içermelidiraz sayıda bezleri ve mümkün olduğu kadar az düz kas propriya ve epitel.
   6. bölüm 3.4.2 olduğu gibi, iyi histoloji sahip bölümleri kesmek ve immünohistokimyasal için PLL kaplı mikroskop lamı ile onları almak. Analiz için biyopsisinden gelen en az iki bölüm kesilir. en az 1 saat için kuru kayar. Kurutma işleminden sonra, bölümler kalay folyo içine de sarılabilir ve en fazla 2 hafta boyunca -20 ° C'de saklandı veya hemen boyanmış olabilir.

GMA gömülü Endobronşiyal Biyopsilerinde 4. İmmünohistokimyasal Boyama

NOT: Sodyum azid zehirli. Davlumbaz içinde% 0,1 sodyum azid çözeltisi hazırlayın ve uzak asitlerden. Asitlerle temasında toksik gaz çıkarır.

1. Bir elmas uçlu kalem kullanarak bölümleri etrafında çizin ve bir boyama raf üzerine slaytları düzenlemek.
2. Bir Peroksidaz bloğu gerçekleştirin. % 0.1 sodyum azid çözeltisi içinde% 0.3 bir hidrojen peroksit peroksidazı bloke çözeltisi hazırlayın. ApplY1 bölümlere peroksidazı bloke ml ve 30 dakika boyunca inkübe edin.
3. 0.05 M Tris-tamponlu tuzlu su (TBS), pH 7.6 bir yıkama çözeltisi hazırlayın. , TBS içinde 3x 5 dakika slaytlar yıkayın.
4. DMEM içinde% 1 BSA blok çözeltisi hazırlayın. peşin ve büyük hacimler, kısım bu yapın ve gerektiğinde kadar dondurmak. slaytları süzün ve özgül olmayan bağlanma antikorun bloke etme 30 dakika blok çözeltisi içinde bölümleri inkübe edin. özgül olmayan bağlanma devam ederse, ikinci antikor olarak aynı türden% 5 serum bloğu ile bir 30 dakika inkübasyon aşamasını içerir.
5. (:; CD1a 1 oranında sulandırılmış 1000: 1,00 1 seyreltilmiş CD45) ve slaytlar uygulamak istenen konsantrasyona TBS birincil antikor (CD45 veya CD1a) seyreltin. bölümler lamel ve oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir.
6. TBS içinde üç kez slaytlar yıkayın. (TBS içinde istenen konsantrasyona ₍₂₎ bu durumda tavşan anti-fare F (ab 'primer antikor konak türlerinden karşı), 1:30 biyotinlenmiş sekonder antikor seyreltilir0 seyreltme) ve slaytlar için geçerlidir. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin.
7. Kullanmadan önce streptavidin-biyotin peroksidaz kompleksi en az 30 dakika hazırlayın. Tüm slaytları karşılamak için yeterli olduğundan emin olun. TBS içinde üç kez slaytlar yıkayın. slaytlar solüsyonu uygulanır ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin.
8. TBS içinde üç kez slaytlar yıkayın. 3-amino-9-etilkarbazol (üretici talimatlarına göre yapılmıştır) (AEC) peroksidaz substrat çözeltisi hazırlayın. slaytlara uygulamak ve 20-30 dakika süreyle ya da istenen leke yoğunluğu gelişene kadar kuluçkaya yatmaktadır.
9. 5 dakika boyunca musluk suyu slaytlar durulayın. 2 dakika süreyle süzülmüş Mayer hematoksilin çözeltisi ile bölümleri counterstain. 5 dakika boyunca musluk suyu slaytlar yıkayın.
10. slaytlar boşaltın ve kalıcı sulu montaj ortamı ile bölümleri kapsamaktadır. bir kurutma fırınında 80 ° C'de slaytlar kurutun. slaytlar soğutun ve daha sonra DPX ile monte ve bir lamel yapmasına izin ver.

5. StTahliye Analiz

1. Bir bilgisayara bağlı bir monte edilmiş bir kamera ile bir ışık mikroskobu kullanılarak 40X büyütmede bölümleri analiz edin.
   Not: Hücresel analiz için, pozitif düz kas, bezler, büyük kan damarları ve uyumsuz veya zarar görmüş dokuların alanlar hariç, bronşiyal lamina propria ve bozulmamış epitel içinde, çekirdekli hücreler boyanmış sayısı.
2. hücre sayımı ortalama ve lamina propria alanı ve epitel uzunluğu ortalama hücre sayısını düzeltin. ve lamina propriya epitel uzunluğunun alanı bir görüntü analiz programı kullanarak hesaplanabilir.

Endobronşiyal Biyopsilerinde 6. Enzimatik sindirimi

1. Yıkama biyopsileri: Hank tamponlu salin solüsyonu (HBSS) (Şekil 3), 10 ml içeren 15 ml'lik konik bir tüp içinde steril forseps yer sağlam biyopsileri kullanılması. 30 rpm'de sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. steril d biyopsileri aktarınHBSS ile 15 ml tüp içeriğini boşaltılarak ish.
2. DTT ile mukus bozmak: 5 mM 1,4-ditiyotreitol (DTT) içeren HBSS, 10 ml bir tüp HBSS değiştirin. Steril forseps kullanarak 15 ml tüp içine geri biyopsi aktarın. 30 rpm'de sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
3. 15 sn için tüp hafifçe karıştırın. HBSS ve DTT ile 15 ml tüp içeriğini boşaltılarak steril kabı üzerine biyopsi aktarın.
4. Kültür ortamına biyopsileri aktarma: RPMI 1640 kültür ortamında, 10 ml bir tüp içinde HBSS ve DTT değiştirin. Steril forseps kullanarak 15 ml tüp içine geri biyopsi aktarın. 30 rpm'de sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
5. kolajenaz ve DNaz ile biyopsi sindirilmesi.
   1. 1 M HEPES çözeltisi içeren, önceden ısıtılmış RPMI kolajenaz II (0.25 mg / ml) ve DNase (0.2 mg / ml) 'in bir sindirim çözeltisi hazırlayın. 48-çukurlu bir doku kült 500 uL oyuk başına sindirim çözeltisi ekleyinure plakası.
   2. Sindirim solüsyonu içinde oyuk başına 1 biyopsi yerleştirin. 220 rpm'de 37 ° C'de 60 dakika boyunca bir çalkalama platformu üzerinde plaka inkübe edin. Pipet yukarı ve 30 dakika biyopsi yeniden dağıtmak için sonra aşağı ve 60 dakika sonra tamamen doku ayrıştırmak.
6. tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması.
   1. birlikte yüzme 40 mikron hücre süzgecinden geçirilerek bir 50 ml tüp içine kuyu sindirilmiş biyopsileri. buz gibi soğuk FACS tampon maddesi (fosfat tamponlu tuz (PBS) ihtiva eden% 2 fetal sığır serumu) ile yıkanmasından kalan hücreler toplanır.
   2. Bir şırınga pistonu arkasını kullanarak hücre süzgecinden kalan doku sıkın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de sindirilmiş hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve buz gibi soğuk FACS tampon maddesi 5 ml pelletini. elle hücrelerin canlılığını değerlendirmek için bir hemasitometre ve Tripan mavisi leke kullanarak hücreleri saymak.

7. Enzimatik Sindirim sonra Endobronşiyal Biyopsilerinde Tek Hücre Akış Sitometrik Analizi

1. FACS tampon 200 ul, yaklaşık 1 x 10 ⁶ hücre hücre pelletini.
2. üreticinin protokolüne uygun olarak, ölü hücre çıkarılması için, bir hücre canlılığı boya ekleyin.
3. FcR bloke edici ayıracı 5 ul ilave edin ve 4 ° C'de 5 dakika inkübe edilir.
4. , CD16 (0.5 ul), HLA-DR (3 ul), CD11c (5 ul), CD123, CD45 (2 ul), soy (2 ul, her CD3, CD20, CD56, CD66abce ve CD14) karşı hücre yüzeyi antikor ekleyin (5 ul), CD1c (3 ul) ve CD103 (2 ul) ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. antikorlar ile ilgili ayrıntılar yöntemleri bölümünde bulunan, ancak kullanımda sitometre kesin akışına antikorlar titre ve optimize edilebilir. 400 x g'de 5 dakika boyunca PBS ile aşırı antikorların yıkayın. bir akış sitometresinde taze örnekleri Edinme veya daha sonra acquisit öncesinde% 1 paraformaldehid hücreleri saptamakiyon.
5. Tahlil ¹⁸ (Şekil 4) sitometri bir akış kullanılarak akciğer biyopsilerinde insan DC'ler belirleyin.
   Not: Analiz yazılımı sitometri akışı ile, bağışıklık hücreleri CD45 üzerinde kapılama diğer akciğer hücrelerinden ayırt edilir. Ölü hücreler CANLI / DEAD boya için pozitif hücreler olarak devre dışı bırakılabilir. Tüm canlı CD45 ⁺ hücreleri, soy hücrelerinin (B hücreleri, T hücreleri, NK hücreleri, nötrofiller ve monositler) bir kanal CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 ve CD16 karşı antikorların bir kokteyl ile devre dışı bırakılabilir. HLA-DR ⁺ hücrelerinin insan DH'lerinin kimlik sağlayacak sonra. MDC CD11c sentezlenmesi sırasında veya CD11c eksikliği göre PDC ayırt edilebilir. MDC daha CD1c ⁺ MDC veya CD141 ⁺ ayrılabilir.

Sonuçlar

DC'lere dahil olmak üzere insan solunum doku yerleşik bağışıklık hücrelerini, karakterize Çalışmalar, büyük oranda cerrahi olarak çıkarılırlar veya tüm insan akciğer dokusu kıt olması nedeniyle sınırlıdır. Burada, sitometri immünhistokimya kullanarak dokuda bağışıklık hücreleri incelemek veya akış sağlıklı gönüllülerde ve gelişmiş protokollerin endobronşiyal biyopsi (EBB) akciğer dokusunu elde etme az invazif bir yöntem özetlenmiştir.

Tartışmalar

Bu kağıt immünohistokimya kullanılarak sağlıklı insanlarda akciğer dokusu yerleşik DC'lerin detaylı mekansal ve fenotipik karakterizasyonu üretmek ve bronkoskopi sırasında toplanan endobronşiyal mukozal biyopsi üzerinde flow sitometri açıklamaktadır. Aşağıdaki paragraflarda protokol kritik adımlar ayrıntılı olarak ele alınmaktadır.

Protokol Kritik adımlar

Kesit ve immünhistokimya: Onlara (adım 2.5) kullanmadığınız zamanlarda -20...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160	Olympus	BF1T160
Light source	Olympus	Exera CV-160
Fenestrated forceps	Olympus	FB21C	Used to take biopsies
Bite Block	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glucose 25%			500 ml intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml			Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o			Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40 mg/ml			Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100 mg/ml spray			Administered to back of throat
Lidocaine 20 mg/ml spray			Administered via bronchoscope to airways
GMA processing and embedding
Glass vials			5 ml
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-1L
Molecular sieves, 4 Å	Alfa Aesar	88120	3-4 mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P-7626	0.035 g/100 ml acetone
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I-6125	0.37 g/100 ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules	TAAB laboratories	C094	500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder	TAAB laboratories	C054	Holds 25 8 mm capsules
JB-4 GMA embedding kit	Polysciences	00226	Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate	Sigma-Aldrich	27614-1L
Silica gel with humidity indicator	Scharlau	GE0043	2.5-6 mm
GMA sectioning
Glass microscope slides	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Capsule splitter	TAAB laboratories	C065
Carbon steel single edge blades	TAAB laboratories	B054
Vice
Ammonia, 25%	VWR	1133.1000	2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%)
Microtome	Leica		Leica RM 2165
Light source	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand	Leica		Leica MZ6
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen	Histolab	5218
Hydrogen peroxide 30% solution	AnalaR Normapur	23619.264
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Sodium chloride	VWR chemicals	27810.295
Bovine serum albumin	Millipore	82-045-2	Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anti-human CD45 antibody	BioLegend	304002	Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody	AbD Serotech	MCA80GA	Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control	Abcam	ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite	Vector Labs	SK-4200
Mayers haematoxylin	HistoLab	01820
Permanent Aqueous Mounting Medium	AbD Serotech	BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution	VWR	360292F
Light microscope	Leica		Leica DMLB
Microscope camera	Leica		Leica DFC 320
Analysis software	Leica		Leica Qwin V3
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Forceps
Platform rocker	Grant instruments	PMR-30
50 ml conical tubes	Falcon	14-432-22
40 µm cell strainer	Falcon	352340
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD	335829
CD56	Biolegend	318332
CD66abce	Miltenyi	130-101-132
HLA-DR	BD	555813
CD14	BD	557831
CD16	Biolegend	302026
CD11c	BD	560369
CD1c	Miltenyi	130-098-009
CD141	Miltenyi	130-090-514
CD103	Biolegend	350212
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
LSR II Flow cytometer	BD		Flow cytometer
FlowJo	FlowJo		Software for analysis