تبسيط خلية مفردة تكر العزلة وتوليد نواقل فيروسات النسخ العكسي في المختبر و في فيفو التعبير لتكرس البشرية

Summary

يجمع البروتوكول الحالي خلية مفردة إقران البشرية تكر ألفا وبيتا سلسلة التسلسل مع تبسيط جيل نواقل النسخ العكسي متوافقة مع التعبير تكر في المختبر و في فيفو .

Abstract

على الرغم من ذلك، تم تطوير العديد من الأساليب لتسلسل سلاسل ألفا وبيتا مستقبلات (تكر) إقران تي خلية من خلايا تي واحد، وحتى الآن لم يكن أي تفضي إلى المصب في فيفو التحليل الوظيفي تكر هيتيروديميرس. لقد وضعنا بروتوكولا محسنة استناداً خطوتين متداخلة متعدد بكر، الذي ينتج منتج PCR تمتد عبر مناطق متغير بأكملها من السلاسل البشرية تكر ألفا وبيتا. بتحديد مواقع قيود فريدة من نوعها وإدماجها في كبسولة تفجير بكر، قدمنا المنتج بكر متوافقة مع مباشرة دون استنساخ داخل قالب المتجهة للفيروسات الرجعية. بناء النسخ العكسي الناتجة بترميز تشيميريك الإنسان/ماوس تكر مع مجال ماوس داخل الخلايا، والتي وظيفية في الخلايا الماوس أو في فيفو نماذج الماوس. عموما، البروتوكول هو موضح هنا يجمع بين خلية بشرية واحدة إقران تكر ألفا وبيتا سلسلة الهوية مع الجيل مبسطة من نواقل فيروسات النسخ العكسي القابلة للتكييف وفقا لتعبير تكر في المختبر و في فيفو . الفيديو والمواد المصاحبة مصممة لإعطاء وصف مفصلة للغاية لخلية مفردة بكر، حتى تكون الخطوات الحاسمة المزالق المحتملة ويتبع تجنبها. بالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لاستنساخ الخطوات الضرورية لإنشاء ناقل التعبير. وبمجرد أن يتقن، يمكن أداء الإجراء بأكمله من خلية مفردة الفرز للتعبير تكر في فترة أسبوعين قصيرة.

Introduction

ويملي مستقبلات خلية تي (تكر) خلية T مصير قرار أثناء وضع وحالة مستقرة/التوازن والتحفيز مستضدي في هامش^1،،من²³. التوسع الأخير في أعماق تسلسلها على تكنولوجيات كشفت عن تنوع تكر التقدير سابقا ضمن استجابات محددة T الخلية مستضد. التنوع تكر يوحي بإمكانية لاستجابات واسعة وظيفيا T الخلية. بغية إدماج تحليل مرجع تسلسل تكر مع الاختبارات الوظيفية تكر، نهج التسلسل ينبغي أن تصمم لتكون متوافقة مع النظم التجريبية و في فيفو النماذج المستخدمة لتحليل وظيفي اللاحقة لتحديد تكرس. ولدينا وضع نهج فعال لعزل تسلسل تكر البشرية وتبسيط الاستنساخ الفرعي في تشيميريك الإنسان/ماوس تكر ناقل قالب متوافق مع التعبير تكر في الفئران أنسنة هلا⁴. يتطلب عزلة سلاسل ألفا وبيتا المقابلة من هيتيروديميريك تكرس التضخيم بكر كلا سلاسل من خلية واحدة. وعلى الرغم من عدة بروتوكولات الاستنساخ تكر خلية واحدة تم تطويرها واستخدامها، حتى الآن لم بسهولة متوافق مع الفائق مبسطة مباشرة استنساخ غير معروف Vα/Vβ "تكرس" إلى نواقل فيروسات النسخ العكسي اللازمة لإعادة التعبير الحية ^4،5،،من⁶⁷. وقد استخدمت الدراسات السابقة نهجين رئيسيين، أما بشكل انتقائي تضخيم جزء محدود من تكر كافية لاستقراء التسلسل، أو لتضخيم أكمله تكر تسلسل^{4،5،6 , 7}-التحليل الوظيفي المصب تكر تسلسلات التي تم الحصول عليها عن طريق النهج الأول يتطلب مكلفة في السيليكون الجمعية و حيثياته بناء تكر. بينما يوفر النهج الثاني تكر التسلسل الكامل، منطقة ثابتة البشرية غير متوافق مع التعبير في فيفو لتكرس المستنسخة في نماذج الماوس. نهجنا مصممة خصيصا لتكون متوافقة مع فيفو التحليل الوظيفي لتكرس في نماذج الماوس. قمنا بتطوير خلية واحدة فعالة ومبسطة [بكر] بروتوكول يسمح بمباشرة دون استنساخ PCR الشظايا في ناقلات التعبير قالب.

ويستخدم نهجنا حساسة للغاية متداخلة متعدد بكر رد فعل الذي يتم تنفيذه في خطوتين. في أول رد فعل متعدد خطوة تجمع 40 كبسولة تفجير محددة لجميع سلاسل بيتا الخامس وبركة 44 كبسولة تفجير محددة لكافة سلاسل ألفا الخامس تستخدم لتضخيم تكر-ألفا أو بيتا تكر دون علم مسبق بالتسلسل (الجدول 1). التمهيدي إلى الأمام بتسلسل محول، التي أدمجت في 5 ' المنتج PCR. وتستند التمهيدي عكس المنطقة المستمر من تكر. وقد حددنا مواقع القيود الفريدة التي غائبة عن متغير البشرية أو مناطق تقاطع تكر، وأدرجت هذه إلى إعادة تصميمها حديثا TCRα و TCRβ الإشعال (الشكل 1). في رد فعل متداخلة الثانية، تستخدم تمهيدي محددة لتسلسل محول وتمهيدي عكس متداخلة داخل المنطقة المستمر كذلك تضخيم سلاسل تكر مع زيادة خصوصية (الجدول 1، الشكل 1). بعد عزل خلية مفردة، تقريب اثنين من بكر (الرد الأول مع مجموعة الإشعال Vα و Vβ، والثانية مع محول الإشعال) يؤدي إلى منتج PCR التي يمكن أن تكون مباشرة دون استنساخ داخل قالب المتجهة للفيروسات الرجعية. سوف ترميز بناء تكر النهائية، في إطار واحد قراءة مفتوحة (ORF)، المناطق متغير البشرية جنبا إلى جنب مع المناطق الماوس ثابتة متصلة بواسطة تسلسل البروتين 'كليافينج الذاتي'، P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)⁸. التسلسل P2A قد استخدمت في نظم متعددة، وقد تم اختبارها على نطاق واسع على وجه التحديد للتعبير عن تكرس^8،9،،من¹⁰¹¹. وعلى الرغم من بعد ترجمة معظم بقايا تسلسل P2A يعلق على ج-المحطة ألفا سلسلة متصلة بواسطة رابط مرنة، في حين تتابع الإشارات سلسلة بيتا برولين إضافية، هذا التعديل ليس له أي تأثير ضار على وظيفة تكر. يستخدم منطقة الماوس ثابتة في البناء بدلاً من الإنسان لتجنب التفاعلات المتغيرة المحتملة مع مكونات مما يشير إلى المصب عند إعادة المعرب عنها في الخلايا الماوس. ORF واحد سيؤدي إلى المقايسة التعبير منفصلة من ألفا وبيتا سلاسل^9،11. البروتوكول الحالي يستند إلى الكواشف والنهج التي تتوفر على نطاق واسع، وهي مصممة على أن يتم بطريقة مبسطة وفعالة. على الرغم من أن التحديد أننا استخدمنا هذا الأسلوب للاعتداء تكرس من خلايا تي ذاتية التفاعل المتورطين في مرض السكري المناعة الذاتية، ونحن نتوقع أن هذا البروتوكول يمكن أن تطبق على نطاق واسع لتحديد وتقييم وظيفي محدد للبشرية تكرس المناعة الذاتية [ابيتوبس] أو [ابيتوبس] سرطان أو الردود على مسببات الأمراض واللقاحات.

Protocol

1-تحديد السكان خلية T للفائدة-

ملاحظة: مستضد الانتشار محددة في تركيبة مع صبغ انقسام الخلية (مثل كاربوكسيفلوريسسين سوكسينيميديل إستر، كفسي) يمكن استخدامها لعزل خلايا تي استناداً إلى انتشارها في الاستجابة للتحفيز مستضدي. إذا بدءاً من ببمكس، توسع في 7 أيام في المختبر يجب أن تكون كافية لتحديد مستضد محدد كفسي سكانية منخفضة ¹²-

1. ببمكس ميكس 1:1 مع الخلايا المطابقة MHC علبة التغذية بالورق، والتسمية مع 5 ميكرومتر كفسي انقسام الخلية صبغ.
الثقافة
2. لوحة 2-2.5 × 10 ⁵ خلايا كل بئر في جولة 96-جيدا-قاع اللوحة في 200 ميليلتر 10% FCS كاملة ربمي الإعلام.
   ملاحظة: يتضمن ربمي كاملة ل مم 2-الجلوتامين، بيروفات صوديوم 1 مم، 100 ميكرومتر ذاكرة غير الأساسية الأحماض الأمينية، 5 مم هيبيس، 5.5 × 10 ^{− 5} وحدات من 2-mercaptoethanol، 100 ش مل ^{− 1} البنسلين و 100 ميكروغرام مل ^{− 1} ستربتوميسين-
3. تحفز الخلايا مع 25 ميكرومتر الببتيد مستضد.
4. في اليوم الرابع للثقافة، بعناية إزالة واستبدال 100 ميليلتر من وسائل الإعلام-
   ملاحظة: نهجاً أكثر أمثل لتحديد الخلية تي محددة مستضد هو استخدام الببتيد-هلا tetramers ¹³. تلوين تيترامير تسمح بتقييم المتزامن لخصوصية مستضد، فضلا عن تقييد هلا.

2. قم بإعداد نوع خلية مفردة.

1. إجراء كافة الإجراءات في غطاء أو مجال معين مجاناً قالب تضخيم. الكوة الكواشف لتفادي التلوث، تنظيف جميع أسطح العمل، وإذا كان ذلك ممكناً، المعدات مع 10 ٪ التبييض قبل الإعداد PCR. استخدام تصفية نصائح والكاشفات الحرة رناسي والدناز والبلاستيك في كل بكر وناقل الاستنساخ الخطوات. ويمكن الاطلاع على الكواشف الرئيسية في الجدول للمواد-
   ملاحظة: رد فعل PCR متعدد حساسة للغاية، ويمكن أن يؤدي انخفاض مستويات التلوث في تضخيم المنتج.
2. توليد مزيج الرئيسي النسخ العكسي عن طريق الجمع بين 10 × RT رد فعل المخزن المؤقت، دنتبس X 25، 9 RT يو الإنزيم، 0.01 ٪ تريتون العاشر، 0.7 "رناسي ش" المانع، و 383 نيوتن متر لكل التمهيدي RT-تكر (المدرجة في الجدول 1) في خزان بيبيتينج عقيمة. لكل لوحة 96-جيدا، وتشكل ما يكفي المزيج الرئيسي لردود فعل إضافية 10 (مجموع 106)، للتعويض عن فقدان السائل أثناء بيبيتينج. انظر الجدول 2 لتفاعل المكونات والمبالغ لكل بئر.
لوحة
3. تحضير مجموعة بكر 96-جيدا للخلية الفرز حسب بيبيتينج ميليلتر 6 من مزيج الرئيسي النسخ العكسي كل جيدا مع ماصة متعددة القنوات. تبقى لوحة على الجليد أو في كتلة باردة.
4. تسمية الخلايا مع الأجسام المضادة الخلايا علامات السطحية (مثل خلايا CD4 و CD3، أو CD8 و CD3، كل منهما في 2 ميكروغرام/مل، في تركيبة مع صبغ انقسام الخلية أو تلطيخ تيترامير)-
5. "تي فرز" الخلايا في أحد الخلية الواحدة جيدا، تخطي في الصف الثاني عشر، الذي سيكون بمثابة عنصر تحكم سلبية.
   ملاحظة: كفاءة هذا النوع يعتمد على جمع الدقيق لوحة المحاذاة ضمن حامل لوحة، فضلا عن الحفاظ على الخلايا ولوحات عند درجة حرارة منخفضة قبل رد الفعل كدنا. ينبغي إبقاء مجموعة لوحات على الجليد في جميع الأوقات، فيما عدا أثناء الفرز، وعندما كانت ثابتة داخل لوحة التبريد. وفارزات ليست جميعها مجهزة بحامل لوحة تنظيم درجة حرارة؛ ومع ذلك، ينصح بشدة باستخدام إحدى. منذ الفرز وعادة ما يأخذ حوالي 10-15 دقيقة للوحة الواحدة، هناك زيادة احتمال تدهور الجيش الملكي النيبالي في حالة عدم الاحتفاظ باللوحة عند درجة حرارة منخفضة.
6. كعنصر إيجابي، إضافة عدد أكبر من الخلايا (خلايا 100) يدوياً مع ماصة لأحد الآبار في هذه المرحلة. بدلاً من ذلك، عزلت سابقا الجيش الملكي النيبالي من الخلايا المجمعة يمكن استخدامها كعنصر إيجابي في 10 نانوغرام كل بئر-
   ملاحظة: "الماصة؛" مراقبة تنقية الحمض النووي الريبي بالدقة والعناية لتفادي التلوث عبر الآبار والنتائج الإيجابية الكاذبة الأخرى.
7. ختم اللوحة مع الفيلم لاصقة، وتدور إلى أسفل في 1000 غ س لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
8. فورا نسخ الحمض النووي الريبي لكدنا التي تفرخ لوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، و 85 درجة مئوية للحد الأدنى 10
   ملاحظة: لضمان كفاءة PCR تفاعل، من المستحسن إجراء PCR أول رد فعل في نفس اليوم. بدلاً من ذلك، يمكن الاحتفاظ لوحات يدون في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.

3. أداء متعدد-متداخلة بكر

ملاحظة: إعداد جميع يمزج الرئيسي في منطقة نظيفة خالية من القالب لتجنب التلوث.

1. إعادة كل متغير المنطقة التمهيدي إلى 100 ميكرومتر مع الدناز ورناسي الحرة H ₂ o. بعد ذلك، ضم 20 ميليلتر من كل من الإشعال 44 لإنشاء تجمع التمهيدي الخامس-ألفا. لتوليد الخامس-بيتا ضم تجمع التمهيدي 20 ميليلتر من كل من الإشعال الخامس-بيتا 40 بالإضافة إلى 80 ميليلتر من الدناز ورناسي مجاناً ح ₂ التمهيدي سين تسلسل المدرجة في الجدول 1. بمجرد تجميع، هو تركيز كل التمهيدي في المزيج ميكرومتر 2.3.
2. إعادة تشكيل الإشعال المنطقة المستمر إلى 100 ميكرومتر حل الأسهم مع الدناز ورناسي مجاناً ح ₂ ديلوت O. الإشعال المنطقة المستمر إلى 10 ميكرون العامل الحل وقاسمه للاستخدام-
3. إعداد يمزج رئيسية منفصلة اثنين تكر-ألفا وبيتا تكر التضخيم. توليد يمزج الرئيسي عن طريق الجمع بين 5 X المخزن المؤقت، 80 ميكرومتر دنتبس، 3% [دمس]، 2 ميكرومتر تجمع التمهيدي (التركيز النهائي من 46 شمال البحر الأبيض المتوسط لكل التمهيدي)، 200 نانومتر تكر ثابت المنطقة عكس التمهيدي و 1 "يو دنا" بوليميريز الدناز ورناسي مجاناً ح ₂ س (الجدول 2 < /قوي >). لكل لوحة 96-جيدا، وتشكل ما يكفي المزيج الرئيسي لردود فعل إضافية 10 (مجموع 106)، بغية التعويض عن فقدان السائل أثناء بيبيتينج.
   ملاحظة: تستند الحسابات النهائية حجم بكر 25 ميليلتر الواحد جيدا، حيث هو 22.5 ميليلتر مزيج PCR الرئيسية جنبا إلى جنب مع قالب كدنا ميليلتر 2.5.
4. تبقى اللوحة مع كدنا على الجليد أو في كتلة باردة. استخدام القنوات المتعددة إلى "الماصة؛" ميليلتر 22.5 من رد فعل تكر-بيتا في لوحة بكر 96-بئر جديدة. ثم استخدم القنوات المتعددة لتحويل 2.5 ميليلتر من كدنا إلى لوحة بكر.
5. استخدام القنوات المتعددة إلى "الماصة؛" ميليلتر 22.5 ألفا تكر رد الفعل مباشرة إلى اللوحة التي تحتوي على ما تبقى من كدنا.
6. ختم اللوحات مع مادة لاصقة ودوامه بلطف وتدور إلى أسفل في 1000 غ س لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
7. تشغيل تفاعل PCR متعدد مع دورات التالية: 5 دقيقة عند 95 درجة مئوية تليها دورات 34 من 20 s عند 95 درجة مئوية، 30 s في 54 ° C، و 1 دقيقة في 72 درجة مئوية، تليها 7 دقيقة في 72 درجة مئوية.
8. القيام برد فعل PCR متداخلة بحجم نهائي في 25 ميليلتر، استخدام 2.5 ميليلتر من خليط PCR متعدد كقالب.
   1. إعادة تشكيل الإشعال الداخلية ومحول إلى 100 ميكرومتر مع الدناز ورناسي مجاناً ح ₂ O. جعل 10 ميكرون مختبرين للأسهم العامل.
   2. إعداد يمزج رئيسية منفصلة اثنين ampl تكر-ألفا وبيتا تكرإيفيكيشن. مزيج 5 × المخزن المؤقت، 25 X DNTP، 3% [دمس]، شمال البحر الأبيض المتوسط 200 محول إلى الأمام التمهيدي، 200 نانومتر عكس التمهيدي متداخلة، 1 "ش دنا" بوليميريز، وبوليميراز الدنا وخالية من نوكلياسي ح ₂ س لوحدة تخزين نهائي من 22.5 ميليلتر (الجدول 2). لكل لوحة 96-جيدا، وتشكل ما يكفي المزيج الرئيسي لردود فعل إضافية 10 (مجموع 106)، للتعويض عن فقدان السائل أثناء بيبيتينج.
      ملاحظة: باستخدام تفاعل PCR الثانية 5 X PCR المخزن المؤقت التي تحتوي على صبغ التحميل لتيسير [اغروس] هلام تحميل.
   3. باستخدام القنوات المتعددة، "الماصة؛" يمزج الرئيسي لردود فعل تكر-ألفا وبيتا تكر في ميليلتر 22.5 كل بئر في لوحات بكر 96-بئر جديدة اثنين.
   4. إضافة قالب تفاعل PCR متعدد في ميليلتر 2.5 كل بئر-
      ملاحظة: تبقى بكر أول رد فعل ينبغي مختومة، وتخزينها في-20 درجة مئوية لتكون بمثابة مصدر لقالب إضافية، إذا كان ذلك ضروريا (انظر الخطوة ملاحظة 4.3).
   5. ختم لوحات، بلطف ودوامه، وتدور إلى أسفل في ز 1000 x لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
   6. تشغيل تفاعل PCR متداخلة مع دورات التالية: 5 دقيقة عند 95 درجة مئوية تليها دورات 34 من 20 s عند 95 درجة مئوية، 30 s في 56 درجة مئوية، و 1 دقيقة في 72 درجة مئوية، تليها 7 دقيقة في 72 درجة مئوية.
   7. تشغيل 5 ميليلتر من رد النهائي بها على 1% [اغروس] هلام المحتوية على اثيديوم بروميد (بما في ذلك الآبار المراقبة السلبية والإيجابية).
      ملاحظة: يجب تشغيل الفرقة المتوقعة في حوالي 500 bp الحجم. فعل سبيل مثال يظهر في الشكل 2-
   8. تطهير ما تبقى من رد الفعل الثاني (20 ميليلتر) استخدام تنسيق 96-بئر بكر تنقية طقم الوتي مع 15 ميليلتر من 70 درجة مئوية ح ₂ س كل بئر وأداء سانغر التسلسل. استخدام المناسبة تكر-ألفا أو بيتا تكر محول إلى الأمام التمهيدي للتسلسل (الجدول 1).
      ملاحظة: يمكن تحليل تسلسل مع البرمجيات immunogenetics متاح على شبكة الإنترنت-

4. دون استنساخ سلاسل PCR ألفا وبيتا-

ملاحظة: مجموعة الإشعال إلى الأمام التي استخدمت في أول رد فعل، والإشعال عكس في تفاعل PCR الثانية تستخدم لإدراج مواقع التقييد. ولذلك، منتجات PCR سلسلة ألفا وبيتا التي يتم الحصول عليها على استعداد ليكون التسلسل الفرعي المستنسخة داخل قالب المتجهة للفيروسات الرجعية ( الشكل 1).

منتجات

1. دايجست بكر المنقي من بيتا متداخلة التفاعل مع بستبي ومفيي (الجدول 3)-
   ملاحظة: لا تتجاوز 5 ميكروغرام إدراج.
2. في نفس الوقت، هضم ناقل القالب مع بستبي ومفيي (الجدول 3). استخدام 1-2 ميكروغرام ناقل القالب الواحد تكر. تشغيل ناقلات هضمها على [اغروس] هلام، وعزل الفرقة أكبر (~ 7500 bp). تنقية الموجه مع هلام طقم تنقية الحمض النووي-
   ملاحظة: أثناء هضم إنزيم التقييد، منطقة قالب متغير تكر-بيتا مورين إزالة، والسماح لإضافة منطقة متغير البشرية تكر-بيتا-
3. تنقية منتجات PCR هضمها باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR.
   ملاحظة: التحقق من قدرة تنقية الحمض النووي من الأعمدة المضمنة في المجموعة؛ استخدام عدة أعمدة إذا لزم الأمر. الحد الأدنى لإدراج المنقاة اللازمة لرد فعل ربط نجاح هو 50 نانوغرام في تركيز الحد أدنى من 10 نانوغرام/ميليلتر. إذا لم يكن إدراج المنقي الكمية كافية لربط نجاح، يمكن أن تتكرر تفاعل PCR الثانية-
4. علاج ناقل القالب مع إنزيم CIP يو 10 ح 1 في 37 درجة مئوية لمنع ربط الذاتي، تليها المنظمة الحرارة لمدة 10 دقائق في 75 ° جيم تنقية الحمض النووي مع مجموعة تنقية بكر (الجدول 3)-
5. ليجت تكر-بيتا إدراج ومتجهة باستخدام الحمض النووي ليجاسى في إجمالي 20 ميليلتر في 6 الزائدة المولى للإدراج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
   ملاحظة: في المجموع، رد فعل ربط ينبغي أن تتضمن حوالي 150 نانوغرام من الحمض النووي (الجدول 3)-
6. للتحولات، مزيج ميليلتر 8 من رد فعل ربط مع ميليلتر 80 المختصة كيميائيا الخلايا DH5α القولونية (جدول المواد) واحتضان على الجليد للحد الأدنى 30 صدمتها الحرارة 42 درجة مئوية ميليلتر إضافة 500 س. 45 سوبر مرق الأمثل مع المتوسطة قمع (S.O.C.) كاتابوليتي ويهز ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية.
7. لوحة من 250 ميليلتر من ثقافة البكتيرية على الأمبيسلّين التي تحتوي على لوحة أجار ليسوجيني مرق (رطل). احتضان لوحة بين عشية وضحاها (ح ~ 16) في 37 درجة مئوية.
8. في اليوم التالي اختيار المستعمرات البكتيرية، ويكبر في المتوسط 3 مل رطل تتضمن الأمبيسلّين بين عشية وضحاها. عزل الحمض النووي بلازميد استخدام أدوات تنقية بلازميد الحمض النووي-
تأكيد
9. الإدراج الناجح للسلسلة بيتا بخلاصة التجارب صغيرة مع تقييد الإنزيمات بستبي ومفيي. في وحدة تخزين 12 رد فعل مجموع ميليلتر، الجمع بين 200-500 ميكروغرام بلازميد الحمض النووي وميليلتر 0.25 لكل إنزيم 10 X إنزيم العازلة (الجدول 3). تشغيل رد فعل الخروج على 1% [اغروس] هلام يحتوي على اثيديوم بروميد لتأكيد حجم الفرقة إدراج (~ 500 bp).
10. بعد تأكيد وجود الإدراج، تسلسل المقطع تكر-بيتا في الموجه استخدام التمهيدي عكس آيريس (الجدول 1).
11. عقب تأكيد تسلسل من إدراج تكر-بيتا، القيام بعملية مماثلة للإدراج إقليم متغير ألفا. هضم منتجات بكر المنقي من رد فعل متداخلة ألفا، وإدراج بيتا تكر الذي تم إنشاؤه حديثا تحتوي على ناقل، مع سنابي وساسيي.
    ملاحظة: أثناء هضم إنزيم التقييد، منطقة قالب متغير تكر-ألفا موريني إزالة، والسماح لإضافة منطقة متغير تكر-ألفا البشري-
ألفا
12. ليجاتي إدراج في ناقلات تكر ترميز المطابق بيتا متغير المنطقة استخدام الحمض النووي ليجاسى في إجمالي 20 ميليلتر في فائض المولى 6 الإدراج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
    ملاحظة: في المجموع، رد فعل ربط ينبغي أن تتضمن حوالي 150 نانوغرام من الحمض النووي (الجدول 3)-
13. للتحولات، مزيج ميليلتر 8 من رد فعل ربط مع ميليلتر 80 المختصة كيميائيا الخلايا DH5α القولونية (جدول المواد) واحتضان على الجليد للحد الأدنى 30 صدمتها الحرارة 42 درجة مئوية عن 45 س. إضافة 500 ميليلتر S.O.C. المتوسطة ويهز ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية.
14. لوحة من 250 ميليلتر من ثقافة البكتيرية على الأمبيسلّين التي تحتوي على لوحة أجار ليسوجيني مرق (رطل). احتضان لوحة بين عشية وضحاها (ح ~ 16) في 37 درجة مئوية.
15. في اليوم التالي اختيار المستعمرات البكتيرية، ويكبر في المتوسط 3 مل رطل تتضمن الأمبيسلّين بين عشية وضحاها. عزل الحمض النووي بلازميد استخدام أدوات تنقية بلازميد الحمض النووي-
تأكيد
16. الإدراج الناجح لسلسلة ألفا بخلاصة التجارب صغيرة مع إنزيمات التقييد سنابي وساسيي. في وحدة تخزين إجمالي رد فعل ميليلتر 12 الجمع بين 200-500 ميكروغرام بلازميد الحمض النووي وميليلتر 0.25 لكل إنزيم 10 x إنزيم العازلة (الجدول 3). تشغيل رد فعل الخروج على 1% [اغروس] هلام يحتوي على اثيديوم بروميد لتأكيد حجم الفرقة إدراج (~ 500 bp).
17. بعد تأكيد وجود الإدراج، تسلسل المقطع تكر-ألفا في الموجه استخدام التمهيدي MSCV2 إلى الأمام (الجدول 1).
18. بمجرد التحقق من صحة تسلسل السلسلة ألفا، من التحقق من إدراج تكر كاملة بالتسلسل مع تكر-بيتا-عكس وعكس IRES التمهيدي (الجدول 1).

5. تحقق من تكر الخلية السطحية التعبير وخصوصية.

ملاحظة: يتم استخدام الخلايا HEK293T لاختبار نجاح تكر سلسلة باريالحرس الوطني وخلية سطح التعبير ( الشكل 3A) ⁸. الببتيد-MHC تيترامير تلطيخ يمكن أيضا إجراؤها على transfected الخلايا HEK293T لاختبار للاحتفاظ بخصوصية مستضدي وظيفة تكر عزل الجينات ( الشكل 3B).

°

1. صفيحة من الخلايا HEK293T في لوحات زراعة الأنسجة 12-جيدا في 1 × 10 ⁵ خلايا كل بئر في 1 مل كاملة دميم وسائل الإعلام التي تحتوي على 5 ٪ السفح، والثقافة بين عشية وضحاها في 37 لوحة جيم إلى خلايا كافية عينت آبار منفصلة لكل تكر جديدة ، التحكم التحكم قالب تكر ناقل، وناقل CD3 فقط، تكر ناقل فقط، وغير transfected جيدا.
   ملاحظة: تعداء بالكامل ماوس قالب تكر المتجهات (نظام مراقبة تكنولوجيا القذائف-بميا) في تركيبة مع mCD3εγδζ-بميج ناقل، وناقل نظام مراقبة تكنولوجيا القذائف بميا وحدها، وناقلات mCD3εγδζ-بميج وحدها تستخدم كعناصر إيجابية وأخرى سلبية.
   ملاحظة: دميم كاملة تحتوي على 2 مم ل الجلوتامين، 1 مم بيروفات صوديوم، 100 ميكرومتر الأحماض الأمينية الأساسية عدم، 5 ملم حبيس المخزن المؤقت، 5.5 × 10 ^-5 وحدات من 2-mercaptoethanol، 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين-
2. في اليوم التالي، ترانسفيكت الخلايا مع 1 ميكروغرام تشيميريك ح/نظام مراقبة تكنولوجيا القذائف-بميا متجه، 1 ميكروغرام الماوس CD3εγδζ-بمسكفيي-التجارة والنقل (بميج) ناقلات وكاشف تعداء المستندة إلى الحويصلية اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
3. لكل تكر، إضافة كاشف تعداء ميليلتر 6 إلى 100 ميليلتر درجة حرارة الغرفة، دميم خالية من المصل. باختصار من دوامة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل 15 دقيقة
4. منفصل 1.5 مل أنابيب الجمع بين 1 ميكروغرام من ناقلات بميا تكر 1 ميكروغرام الماوس ناقل CD3εγδζ-بمسكفي-التجارة والنقل (بميج)، أو 1 ميكروغرام لكل ناقل منفصلة لعناصر التحكم.
إضافة
5. دروبويسي، حل الكاشف/دميم تعداء للأنابيب التي تحتوي على ناقل الحمض النووي. احتضان في درجة حرارة الغرفة ل 15 دقيقة
إضافة
6. دروبويسي، حل الكاشف/دميم/الحمض النووي تعداء الخلايا HEK293T. اضغط برفق لوحة لمزيج. احتضان في 37 درجة مئوية ل 24 h.
7. ح بعد 24 استبدال وسائط الإعلام، وإبقاء الخلايا في ثقافة إضافية 24 حاء
8. إزالة خلايا من اللوحة بواسطة بيبيتينج قوية، ووصمة عار الخلايا مع الماوس المضادة CD3 جسم (2.5 ميكروغرام/مل) التحقق من سطح التعبير عن تشيميريك-تكر بالتدفق الخلوي-
بوابة
9. من أجل مقارنة التعبير CD3 بين الخلايا التي تم transfected إلى مستوى مماثل، تحليل الخلايا معربا عن مستوى عال مماثلة من جزيئات مراسل الفلورسنت (التجارة والنقل ل CD3 المعقدة، وأميتريني لناقلات التعبير تكر). على الوجه الأمثل، ينبغي أن بوابات التحليل على بروتينات فلورية خضراء + أميتريني + الخلايا ضمن 10 ⁴ إلى 10 ⁵ الفلورسنت كثافة ( الشكل 3A).
   ملاحظة: يجب أن يكون مستوى التعبير CD3 في الخلايا transfected مع بناء تشيميريك قابلة للمقارنة لناقل التحكم الماوس (القالب الأصلي) ( الشكل 3A). ناقلات تكر الفيروسات التراجعية التي تم إنشاؤها متوافقة مع نظم في فيفو التعبير كما هو موضح سابقا ⁴-

النتائج

يتم فحص كفاءة تفاعل PCR متعدد-متداخلة في خطوة 3.2.7 (الشكل 2) قبل نفاد 5µL رد الفعل الثاني على [اغروس] هلام. متوسط كفاءة التضخيم تكر-بيتا من المتوقع بنحو 80 في المائة، بينما فعالية رد فعل تكر-ألفا عادة ما تكون أقل، في حوالي 50%⁴. يمكن أن تستخدم فقط إقران س...

Discussion

في البروتوكول الحالي، يصف لنا طريقة فعالة لخلية مفردة تكر التضخيم واللاحقة دون استنساخ تكر إقران سلاسل ألفا وبيتا في ناقل للفيروسات التراجعية تعبير قالب. على الرغم من ذلك، وقد وضعت عدة بروتوكولات بكر خلية مفردة، وحتى الآن لم يكن أي متوافقة مع فورا دون استنساخ إلى متجه تعبير. في معظم الحال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CFSE	eBioscience	65-0850-84	5 mM
anti-human CD4 (OKT4) BV421	Biolegend	317433	2 mg/mL
anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5	Biolegend	317336	2 mg/mL
anti-mouse CD3 AF647	Biolegend	100322	2.5 mg/mL
Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU	VWR	97068-158	0.7 U
Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit	Invirtogen	4368814	9 U (RT enzyme)
NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL	Invirtogen	AM9932
Gotaq DNA polymerase 2500U	VWR	PAM3008	1 U
96 Well Half Skirt PCR Plate	Phenix	MPX-96M2
MicroAmp Clear Adhesive Film	ThermoFisher	4306311
UltraPure Agarose	Invirtogen	15510-027
SnaBI	New England Biolabs	R0130	15 U (insert) 30 U (vector)
SacII	New England Biolabs	R0157	40 U (insert) 80 U (vector)
MfeI	New England Biolabs	R3589S	40 U (insert) 80 U (vector)
BstBI	New England Biolabs	R0519	40 U (insert) 80 U (vector)
Calf Intestinal Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	10 U
Quick ligase	New England Biolabs	M2200S
Wizard Plus minipreps DNA purification systems	Promega	A1460
Wizard Plus midipreps DNA purification systems	Promega	A7640
DNA clean & concentrator-25 kit	Genesee Scientific	11-304C
ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit	Genesee Scientific	11-306A
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28704
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells	ThermoFisher	18265017
Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent)	Mirus	MIR2300
BD FACS Aria II (sorter)	BD
BD Fortessa (flow cytometer)	BD