简化的单细胞 TCR 分离和逆转录病毒载体的生成, 用于体外和体内表达人类 TCRs

摘要

当前的协议结合了单细胞配对人类 TCR α和β链测序与与体外和体内TCR 表达相兼容的反转录病毒载体的生成。

摘要

虽然, 有几种方法的排序的配对 t 细胞受体 (TCR) α和β链从单一 t 细胞已经开发, 迄今没有有利于下游体内功能分析的 TCR heterodimers。我们已经开发了一个改进的协议的基础上 two-step 多重嵌套 pcr, 这导致一个 pcr 产品横跨整个可变区域的人类 TCR α和β链。通过确定独特的限制点, 并将它们纳入 pcr 引物, 我们已经使 pcr 产品与直接 sub-cloning 与模板逆转录病毒载体相兼容。由此产生的逆转录病毒构建编码一个嵌合的人/鼠 TCR 与鼠标的细胞内域, 这是功能在鼠标细胞或在体内鼠标模型。总的来说, 这里描述的协议结合了人类单细胞配对 TCR α和β链识别与简化的逆转录病毒载体易于适应体外和体内TCR 表达。视频和伴随的材料被设计为对单细胞 PCR 的高度详细的描述, 因此关键的步可以被跟随和潜在的陷阱避免。此外, 我们还提供了生成表达载体所需的克隆步骤的详细描述。一旦掌握, 从单细胞排序到 TCR 表达的整个过程可以在短短的两周内完成。

引言

t 细胞受体 (TCR) 指示 t 细胞命运决定在发展期间, 稳态/稳态, 和抗原刺激的外围^1,2,3。最近的深度测序技术的扩展揭示了先前未被低估的抗原特异 T 细胞反应中的 TCR 多样性。TCR 多样性表明了功能广泛的 T 细胞反应的潜力。为了将 TCR 序列剧目分析与 TCR 功能分析相结合, 测序方法应设计为与实验系统兼容, 并用于后续的功能性研究的体内模型。TCRs我们已经开发了一个有效的方法, 人类 TCR 序列隔离和简化 sub-cloning 成嵌合体的人/小鼠 TCR 模板载体与 TCR 表达的 HLA-人性化的老鼠⁴。heterodimeric TCRs 的相应α和β链的分离需要从单个细胞中扩增两个链。虽然, 已经开发和利用了几个单细胞的 TCR 克隆协议, 但迄今为止, 没有一个能够很容易地与高通量简化的 Vα/Vβ TCRs 的直接克隆相兼容, 成为重新体内的反转录病毒载体 ^{4、5、6、7}。以前的研究采用了两种主要方法, 要么是有选择地放大 TCR 的有限部分足以推断序列, 要么放大整个 TCR 序列^4,5,6,7. 通过第一种方法获得的 TCR 序列的下游功能分析需要昂贵的在硅片中程序集和de 从头构造 TCR。虽然第二种方法提供完整的 TCR 序列, 但人的恒定区域与在鼠标模型中克隆的 TCRs 的在体内表达不兼容。我们的方法是专门设计为与在体内的功能分析 TCRs 在小鼠模型中兼容。我们开发了一个高效和简化的单细胞 pcr 协议, 允许直接 sub-cloning pcr 片段到模板表达载体。

我们的方法采用了一个高度敏感的多重嵌套 PCR 反应, 这是两个步骤执行。在第一个复用反应步骤中, 所有 v-β链的40引物的池, 以及所有 v 型α链专用的44个引物池, 用于放大 TCR-α或 TCR-beta, 而无需事先了解序列 (表 1)。前引物有一个适配器序列, 这是纳入 PCR 产品的 5 "。反向底漆基于 TCR 的恒定区域。我们已经确定了在人类变量或连接 TCR 区域中不存在的唯一限制站点, 并将它们合并到新重新设计的 TCRα和 TCRβ引物 (图 1) 中。在第二个嵌套反应中, 使用在恒定区域内的适配器序列和嵌套反向底漆的底漆, 用于进一步放大 TCR 链, 增加特异性 (表 1,图 1)。单细胞分离后, 两轮 pcr (第一反应与池的 Vα和 Vβ引物, 第二次与适配器引物) 产生的 pcr 产品, 可以直接 sub-cloned 到模板逆转录病毒载体。最后的 TCR 结构将编码, 在一个单一的开放阅读框架, 人的可变区域结合的小鼠恒定区域连接的 ' self-cleaving ' 蛋白序列, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)⁸。P2A 序列已在多个系统中使用, 并已被广泛测试, 专门用于表达 TCRs^{8、9、10、11}。虽然, 在翻译以后多数 P2A 序列仍然附有由一个灵活的链接器连接的阿尔法链子的 C 末端, 而 beta 链信号序列有另外的脯氨酸, 这种修改对 TCR 作用没有有害作用。在构造中使用鼠标常量区域, 而不是人类, 以避免 re-expressed 在鼠标单元格中时与下游信号组件的潜在改变的交互。单一的, 将导致化学计量独立表达α和β链^9,11。目前的协议是基于广泛可用的试剂和方法, 并且设计为以流线型和高效的方式进行。虽然我们已经明确地使用这项技术来检测 TCRs 从反应 T 细胞牵连自身免疫性糖尿病, 我们预计, 该协议可以广泛适用于识别和功能评估的人 TCRs 具体自身免疫表位, 肿瘤抗原表位, 或对病原体和疫苗的反应。

研究方案

1. 确定感兴趣的 T 细胞群体.

注意: 抗原特异增殖与细胞分裂染料 (如羧基琥珀酰亚胺酯, CFSE) 可用于分离 T 细胞的基础上, 其增殖反应抗原刺激。如果从 PBMCs 开始, 7 天的 体外 扩展应该足以识别抗原特异的 CFSE 低种群 ¹² 。

1. 将 PBMCs 1:1 与 MHC 匹配的进纸单元混合, 并使用5和 #181 的标签; M CFSE 细胞分裂染料.
2. 板 2-2. 5 x 10 ⁵ 每个井在 96-井圆底培养板中的每个单元格200和 #181; L 10% FCS 完整的 RPMI 介质.
   注: 完整的 RPMI 含有2毫米 l-谷氨酰胺, 1 毫米丙酮酸钠, 100 和 #181; M 不必要的氨基酸, 5 毫米 HEPES, 5.5 和 #215; 10 ^{和 #8722; 5} 单位 2-基, 100 U mL ^{和 #8722; 1} 青霉素和100和 #181; g mL ^{和 #8722; 1} 链霉素
3. 用 25 #181; M 肽抗原刺激细胞.
4. 在第四天的文化, 小心删除和更换100和 #181; L 的媒体.
   注: 抗原特异 T 细胞识别的一种更为优化的方法是使用肽 HLA 体 ¹³ 。聚丙烯染色允许同时评估抗原特异性以及 HLA 限制.

2。设置单个单元格排序.

1. 执行引擎盖或指定区域中的所有过程, 没有放大的模板。分的试剂, 以避免污染, 清洁所有的工作表面, 如果可行, 设备与10% 漂白剂之前, PCR 设置。使用过滤提示, 核糖核酸和 dnasei 免费试剂和塑料在所有的 PCR 和载体克隆步骤。关键试剂可以在 材料表 中找到.
   注意: 多重 PCR 反应是高度敏感的, 低水平的污染会导致产品的放大.
2. 通过将 10x rt 反应缓冲、25X DNTPs、9 u rt 酶、0.01% 海卫 x、0.7 u 核糖核酸抑制剂和 383 nM 的每个 rt TCR 底漆 (列于 表 1 ) 中, 在无菌移油藏中生成反向转录主混合。对于每96个井板, 组成足够的主混合10额外的反应 (共 106), 以弥补液体损失在移。请参见 表 2 , 以了解反应组件和每井的金额.
3. 准备一个96孔 PCR 收集板的细胞分类由移6和 #181; L 的反向转录主混合每井与多通道吸管。把盘子放在冰上或放在寒冷的街区.
4. 将带有抗体的细胞标记为细胞表面标志物 (如 CD4 和 CD3, 或 CD8 和 CD3, 分别在2和 #181; g/毫升, 结合细胞分裂染料或聚丙烯染色).
5. 对每个单元格中的 T 单元格进行排序, 跳过第十二行, 这将作为一个负控制.
   注意: 排序的效率将取决于在板持有人的精确收集板对齐, 以及保持在一个较低的温度下的细胞和板块在 cDNA 反应之前。收集板应保持在冰的时刻, 除了在排序, 当他们固定在冷却板。并非所有机都装有温度调节板架;但是, 强烈建议使用一种。由于该类通常需要约 10-15 分钟每盘, 有一个增加的潜力, RNA 退化, 如果该板块不保持在低温.
6. 作为一个正向控制, 在这个阶段用吸管将大量的细胞 (100 细胞) 手动添加到其中的一个井中。另外, 以前分离的 RNA 从汇集的细胞可以使用作为正面控制在 10 ng 每井.
   注: 为了避免其他井的交叉污染和假阳性结果, 移液管精确、小心地纯化了 RNA.
7. 用胶膜封板, 在 1000 x g 处旋转5分钟, 在4和 #176; C.
8. 将 RNA 转录到25和 #176; c 为 10 min、37和 #176; c 为 45 min、85和 #176; c 为 10 min.
   注意: 为了保证有效的 pcr 反应, 建议在同一天进行第一次 pcr 反应。另外, 转录板可以保存在-80 和 #176; C 最多2月.

3。执行多重嵌套 PCR

注意: 准备所有的主混合在一个干净的无模板区, 以避免污染.

1. 将每个可变区域底漆重新重建为100和 #181; M 与 dnasei 和核糖核酸自由 H ₂ O。接下来, 结合20和 #181; L 每个44引物生成 V 型α入门池。生成 v 型β-beta 入门池结合20和 #181; l 每 40 v 型β底漆加上80和 #181; l dnasei 和核糖核酸自由 H ₂ o. 底漆序列在 表 1 中列出。一旦汇集, 每引物的集中在混合是2.3 和 #181; m.
2. 将常量区域底漆重建为100和 #181; m 库存解决方案与 dnasei 和核糖核酸自由 H ₂ o. 将常量区域底漆稀释到10和 #181; m 工作解决方案和分使用.
3. 准备两个单独的主混合 TCR-α和 TCR-β放大。通过合并5X 缓冲区来生成主混合80和 #181; m dNTPs, 3% 亚砜, 2 和 #181; m 底漆池 (每个底漆的最终浓度 46 nm), 200 nm TCR-恒定区域反转底漆, 1 U DNA 聚合酶, dnasei 和核糖核酸自由 H ₂ O ( 表2/强 >)。为每96个井板, 构成足够的主混合为10另外的反应 (共计 106), 为了补偿液体损失在移期间.
   注: 计算依据的是25和 #181 的最终 pcr 量; 每个井, 22.5 和 #181; i. pcr 组合与2.5 和 #181; l cDNA 模板.
4. 在冰上或在冷块中保留该板的 cDNA。使用多通道, 以吸管22.5 和 #181; L TCR β反应到一个新的96井 PCR 板。然后使用多通道传输2.5 和 #181; L cDNA 进入 PCR 板.
5. 使用多通道吸管22.5 和 #181; L TCR α反应直接进入含有其余的 cDNA 的板块.
6. 用粘合剂将板材密封, 轻轻涡旋, 然后在 1000 x g 处旋转5分钟, 在4和 #176; C.
7. 运行多重 PCR 反应与以下周期: 5 分钟在95和 #176; c 和34周期二十年代在95和 #176; c, 三十年代在54和 #176; c, 1 min 在72和 #176; c, 7 min 在72和 #176; c.
8. 在25和 #181 的最终容量中进行嵌套 pcr 反应; 使用2.5 和 #181; 采用多重 pcr 混合的 l 作为模板。
   1. 将内部和适配器的底漆重新制作为100和 #181; m 与 dnasei 和核糖核酸自由 H ₂ o. 10 和 #181; 等分为工作库存.
   2. 准备两个单独的主混合 TCR-α和 TCR-β ampl分类.混合5X 缓冲器, 25X DNTP, 3% 亚砜, 200 nm 前向适配器底漆, 200 nm 反向嵌套底漆, 1 U dna 聚合酶, 和 dna 聚合酶和无核酸的 H ₂ O 为最后的容量22.5 和 #181; L ( 表 2 )。对于每96个井板, 组成足够的主混合10额外的反应 (共 106), 以弥补液体损失在移.
      注: 在第二 pcr 反应中使用 5X pcr 缓冲含有负载染料, 以方便琼脂糖凝胶负载.
   3. 使用多通道, 吸管的主混合为 TCR α和 TCR β反应在22.5 和 #181; L 每井成两个新的 96-井 PCR 板.
   4. 在2.5 和 #181 添加多重 PCR 反应模板; 每井.
      注: 其余第一个 PCR 反应应密封, 并存储在-20 和 #176; C 作为附加模板的源, 如果需要 (请参见 步骤4.3 注意 ).
   5. 密封板, 轻轻涡, 并在 1000 x g 旋转下来5分钟, 在4和 #176; C.
   6. 运行带有以下循环的嵌套 PCR 反应: 5 分钟在95和 #176; c 和34周期二十年代在95和 #176; c, 三十年代在56和 #176; c, 1 min 在72和 #176; c, 7 min 在72和 #176; c.
   7. 运行5和 #181; L 最后的反应, 在1% 琼脂糖凝胶含有溴溴 (包括负和阳性控制井).
      注: 预计波段应运行约 500 bp 大小。 图 2 中显示了一个示例反应.
   8. 纯化第二反应的其余部分 (20 和 #181; l) 使用96井格式 PCR 纯化试剂盒, 洗与15和 #181; l 70 和 #176; C H ₂ O 每井, 并执行桑格测序。使用适当的 TCR-α或 TCR-β适配器前向引物进行测序 ( 表 1 ).
      注意: 可以使用在线免疫软件分析序列.

4。亚克隆α和β PCR 链.

注: 第一反应中使用的正向引物的池, 第二个 PCR 反应中的反向引物用于合并限制部位。因此, 所获得的α和β链 PCR 产品可以按顺序 sub-cloned 到模板反转录病毒载体 ( 图 1 ).

1. 使用 BstbI 和 MfeI ( 表 3 ) 从 beta 嵌套反应中摘录纯化的 PCR 产品.
   注: 请勿超过 5 #181; g 插入.
2. 并行, 用 BstbI 和 MfeI ( 表 3 ) 来消化模板向量。使用1-2 和 #181; g 的模板向量每 TCR。在琼脂糖凝胶上运行的消化载体, 并隔离较大的波段 (〜 7500 bp)。用凝胶 DNA 纯化试剂盒净化载体.
   注: 在限制酶消化期间, 模板小鼠 TCR-β变区被删除, 允许增加人类 TCR-β变量区域.
3. 使用 pcr 纯化试剂盒提纯经消化的 pcr 产物.
   注: 验证套件中所含列的 DNA 纯化能力;必要时使用多个列。成功结扎反应所需的纯化插入物的最小用量为 50 ng, 最低浓度为 10 ng/和 #181;如果纯化的插入量是不足够的成功结扎, 第二个 PCR 反应可以重复.
4. 将模板向量与 10 U CIP 酶用于1小时的37和 #176; c 以防止 self-ligation, 其次是热失活10分钟, 在75和 #176; c. 用 PCR 纯化试剂盒提纯 DNA ( 表 3 ).
5. 结扎 TCR-β插入和向量, 使用 DNA 连接在20和 #181; L 总体积在6摩尔, 超过30分钟的插入物在室温下.
   注: 总的说, 结扎反应应包含约 150 ng 的 DNA ( 表 3 ).
6. 用于转换, 混合8和 #181; 80 和 #181 的结扎反应 l; 具有化学能力的 大肠杆菌 DH5 和 #945; 细胞 (材料的 表 ) 和在冰上孵育30分钟的热休克在42和 #176; C 为四十五年代. 添加500和 #181; 我超级物抑制 (soc) 培养基的最佳肉汤, 在37和 #176 时摇动1.5 小时; C.
7. 将250和 #181; 在含有性汤 (LB) 琼脂板的氨苄西林中培养细菌。在37和 #176 的夜间 (约16小时) 孵育盘; C.
8. 第二天选择细菌菌落, 并在一夜之间在含有氨苄西林的3毫升培养基中生长。用 dna 质粒纯化试剂盒分离质粒 dna.
9. 确认通过 small-scale 测试-摘要成功插入 beta 链, 并使用限制酶 BstbI 和 MfeI。在12和 #181; l 总反应量, 结合200-500 和 #181; g 质粒 DNA, 0.25 和 #181; 每种酶的 l, 和10X 酶缓冲 ( 表 3 )。运行的反应1% 琼脂糖凝胶含有溴溴, 以确认大小的插入带 (〜 500 bp).
10. 在确认插入的存在后, 使用 IRES 反向底漆 ( 表 1 ) 序列化向量的 TCR-beta 部分.
11. TCR-beta 插入的顺序确认后, 执行类似的过程以插入 alpha 变量区域。从α嵌套反应中提炼纯化的 PCR 产物, 以及新生成的 TCR-β插入载体, 其中含有 SnaBI 和 SacII.
    注: 在限制酶消化期间, 模板小鼠 TCR α变区被移除, 允许增加人类的 TCR-α变量区域.
12. 结扎在20和 #181 中使用 DNA 连接对相应的 beta 变量区域进行编码, 并将其插入到 TCR 向量中; 在室温下, 6 摩尔的总体积超过30分钟的插入量.
    注: 总的说, 结扎反应应包含约 150 ng 的 DNA ( 表 3 ).
13. 用于转换, 混合8和 #181; 80 和 #181 的结扎反应 l; 具有化学能力的 大肠杆菌 DH5 和 #945; 细胞 (材料的 表 ) 和在冰上孵育30分钟的热休克在42和 #176; C 四十五年代. 添加500和 #181; 我 soc在37和 #176 时为1.5 小时的介质和抖动; C.
14. 将250和 #181; 在含有性汤 (LB) 琼脂板的氨苄西林中培养细菌。在37和 #176 的夜间 (约16小时) 孵育盘; C.
15. 第二天选择细菌菌落, 并在一夜之间在含有氨苄西林的3毫升培养基中生长。用 dna 质粒纯化试剂盒分离质粒 dna.
16. 确认将α链成功插入的 small-scale 测试摘要与限制酶 SnaBI 和 SacII。在12和 #181; l 总反应容量结合200-500 和 #181; g 质粒 DNA, 0.25 和 #181; 每种酶的 l, 和10x 酶缓冲 ( 表 3 )。运行的反应1% 琼脂糖凝胶含有溴溴, 以确认大小的插入带 (〜 500 bp).
17. 在确认插入的存在后, 使用 MSCV2-forward 入门 ( 表 1 ) 将向量的 TCR-alpha 部分序列化.
18. 一旦验证了 alpha 链序列, 请通过 TCR-β-反转和 IRES 反向底漆 ( 表 1 ) 的顺序验证完整的 TCR 插入.

5。验证 TCR 细胞表面的表达和特异性.

注意: HEK293T 单元用于测试成功的 TCR 链ng 和单元格表面表达式 ( 图 3A ) ⁸ 。多肽 MHC 聚丙烯染色也可以对转染的 HEK293T 细胞进行测试的保留抗原特异性后 TCR 基因分离 ( 图 3B ).

1. 将12个组织培养皿中的 HEK293T 细胞在1毫升的 1 x 10 ⁵ 细胞中, 在5% 和 #176 的完整 DMEM 介质中包含37个 FCS 和区域性; c. 板出足够的细胞为每个新的 TCR 指定单独的井, 控制模板 TCR 矢量, 仅 CD3 向量, 控制 TCR 向量, non-transfected.
   注: 用完整的鼠标模板 TCR 载体转染 (纶) 与 mCD3 和 #949 结合; #947; #948; #950; pMIG 向量, 单纶向量, mCD3 #949; #947; #948; #950;-pMIG 矢量单独被用作正负控制.
   注: 完整的 DMEM 包含2毫米 l-谷氨酰胺, 1 毫米丙酮酸钠, 100 和 #181; M 非必需氨基酸, 5 毫米 HEPES 缓冲, 5.5 x 10 ^-5 单位 2-基, 100 U/毫升青霉素/链霉素.
2. 第二天, 染1和 #181 的单元格; 纶向量、1和 #181; g 鼠标 CD3 和 #949; #947; #948; #950;-pMSCVII-GFP (pMIG) 载体, 和 liposome-based 转染试剂按照制造商的指示.
3. 对于每个 TCR, 添加6和 #181; 将试剂转染为100和 #181; l 室温, 无血清 DMEM。短暂的旋涡, 并在室温下孵育15分钟.
4. 在单独的1.5 毫升管中结合1和 #181; g TCR 纶向量与1和 #181; g 鼠标 CD3 和 #949; #947; #948; #950;-pMSCVII-GFP (pMIG) 矢量, 或1和 #181; 每个矢量的 g 分别用于控件.
5. 滴, 将转染试剂/DMEM 溶液添加到包含矢量 DNA 的管中。室温孵育15分钟.
6. 滴, 将转染试剂/DMEM/DNA 溶液添加到 HEK293T 细胞中。轻轻地轻敲盘子混合。孵育在37和 #176; C 为 24 h.
7. 在24小时后替换媒体, 并将单元格保留为24小时.
8. 通过大力移将细胞从板上移除, 并用 anti-mouse CD3 抗体 (2.5 和 #181; g/毫升) 对细胞进行染色, 以验证流式细胞术对嵌合 TCR 的表面表达.
9. 为了比较被转染为类似水平的单元格之间的 CD3 表达式, 对表达类似高水平荧光报告分子的细胞进行分析 (GFP 为 CD3 复合体, 石为 TCR 表达载体)。优选地, 分析应该在 10 ⁴ 到 10 ⁵ 荧光强度 ( 图 3A ) 内的 GFP + 石 + 细胞上进行封闭.
   注: 在转嵌的细胞中的 CD3 表达水平应与控制鼠标 (原始模板) 矢量 ( 图 3A ) 相媲美。生成的 TCR 反转录病毒载体与先前描述的 ⁴ 中的 在体内 表达式系统兼容。

结果

在步骤 3.2.7 (图 2) 中, 通过在琼脂糖凝胶上5µL 第二反应的运行, 对多重嵌套 PCR 反应的效率进行了检查。平均 TCR-β放大率的效率预计在80% 左右, 而 TCR-α反应的效率通常较低, 约 50%⁴。只有配对的 TCR α和 TCR β链可以用于 TCR 表达;然而, 所有 PCR 产品都可以测序, 以获得 TCR 序列和剧目信息。

讨论

在当前的协议中, 我们描述了一个有效的方法单细胞 TCR 放大和随后的 sub-cloning 配对 TCR α和β链成模板逆转录病毒表达载体。虽然, 已经开发了几个单细胞 PCR 协议, 到目前为止没有与直接 sub-cloning 兼容到表达载体。在大多数情况下, 包含高度可变的 CDR3 区域的部分序列被放大, 具有足够的序列来推断变量区域。这种较小的 pcr 产品尺寸支持更高的 pcr 效率, 但需要de 从头TCR 基因合成功能研究?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CFSE	eBioscience	65-0850-84	5 mM
anti-human CD4 (OKT4) BV421	Biolegend	317433	2 mg/mL
anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5	Biolegend	317336	2 mg/mL
anti-mouse CD3 AF647	Biolegend	100322	2.5 mg/mL
Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU	VWR	97068-158	0.7 U
Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit	Invirtogen	4368814	9 U (RT enzyme)
NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL	Invirtogen	AM9932
Gotaq DNA polymerase 2500U	VWR	PAM3008	1 U
96 Well Half Skirt PCR Plate	Phenix	MPX-96M2
MicroAmp Clear Adhesive Film	ThermoFisher	4306311
UltraPure Agarose	Invirtogen	15510-027
SnaBI	New England Biolabs	R0130	15 U (insert) 30 U (vector)
SacII	New England Biolabs	R0157	40 U (insert) 80 U (vector)
MfeI	New England Biolabs	R3589S	40 U (insert) 80 U (vector)
BstBI	New England Biolabs	R0519	40 U (insert) 80 U (vector)
Calf Intestinal Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	10 U
Quick ligase	New England Biolabs	M2200S
Wizard Plus minipreps DNA purification systems	Promega	A1460
Wizard Plus midipreps DNA purification systems	Promega	A7640
DNA clean & concentrator-25 kit	Genesee Scientific	11-304C
ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit	Genesee Scientific	11-306A
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28704
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells	ThermoFisher	18265017
Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent)	Mirus	MIR2300
BD FACS Aria II (sorter)	BD
BD Fortessa (flow cytometer)	BD