Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Özet

Geçerli protokol birleştiren tek hücre insan TCR alpha ve beta zinciri sıralama ile eşleştirilmiş retroviral vektörler vitro ve in vivo TCR ifade ile uyumlu nesil aerodinamik.

Özet

Sıralama eşleştirilmiş T hücre reseptör (TCR) Alfa ve beta zincirleri tek T hücrelerden için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir rağmen hiçbiri defa TCR heterodimers aşağı akım için elverişli vivo içinde fonksiyonel analiz edilmiştir. Biz neden olan bir insan TCR alpha ve beta zincirleri değişken bölgeleri kapsayan bir PCR ürünü bir iki adım multiplex iç içe PCR, dayalı gelişmiş bir iletişim kuralı geliştirdik. Benzersiz kısıtlama siteleri tanımlama ve onları PCR astar birleşmeyle, PCR ürünü doğrudan şablon retroviral vektör alt klonlama ile uyumlu yaptık. Elde edilen retroviral yapı chimeric insan/fare TCR fare hücreleri veya vivo içinde fare modelleri fonksiyonel bir fare hücre içi etki ile kodlar. Genel olarak, burada açıklanan protokol eşleştirilmiş insan tek hücre TCR alpha ve beta zinciri kimlik retroviral vektörler kolayca uyarlanabilir aerodinamik nesil vitro ve in vivo TCR ifade ile birleştirir. Böylece kritik adımları takip ve potansiyel tuzaklar kaçınılmalıdır olabilir video ve eşlik eden malzeme tek hücre PCR, son derece ayrıntılı bir tanımını vermek için tasarlanmıştır. Ayrıca, biz klonlama ifade vektör oluşturmak için gereken adımları ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Kez hakim, tüm prosedürü tek hücreden TCR ifade için sıralama kısa bir iki haftalık süre içinde gerçekleştirilebilir.

Giriş

T hücre reseptör (TCR) T hücre kaderi karar geliştirme, kararlı duruma/homeostazı ve çevre^1,2,3' te antijenik stimülasyon sırasında belirler. Son teknolojileri sıralama derin genişlemesi antijen belirli T hücre yanıt içinde daha önce değersiz bir TCR çeşitlilik ortaya çıkardı. TCR çeşitlilik işlevsel olarak geniş T hücre yanıt için bir potansiyel göstermektedir. TCR dizi repertuar analizi TCR fonksiyonel deneyleri ile entegrasyon için sıralama yaklaşımlar deneysel sistemleri ve seçin sonraki fonksiyonel analiz için kullanılan vivo içinde modelleri ile uyumlu olacak şekilde tasarlanmış olmalıdır TCRs. Biz insan TCR sıra izolasyonu için etkili bir yaklaşım geliştirdik ve TCR ifade HLA insanlaşmış fareler⁴ile uyumlu bir chimeric insan/fare TCR şablon vektör içine alt klonlama aerodinamik. Heterodimeric TCRs karşılık gelen alpha ve beta zincirleri yalıtımı PCR güçlendirme tek bir hücreden her iki zincirlerinin gerektirir. Rağmen birkaç tek hücreli TCR klonlama protokol geliştirilen ve kullanılan, hiçbiri defa kolayca yüksek üretilen iş kolaylaştırılmış doğrudan bilinmeyen Vα/Vβ TCRs retroviral vektörler yeniden ifade için içinde vivo gerekli içine klonlama ile uyumlu olması ^4,5,6,7. Önceki çalışmalarda iki ana yaklaşım, ya seçerek sıra tahmin veya tüm TCR sıra^4,5,6 yükseltmek için yeterli TCR sınırlı bir bölümünü yükseltmek için kullanılan ^{, 7}. ilk yaklaşım elde edilen TCR sıralarının aşağı akım fonksiyonel analiz gerektirir pahalı silico montaj ve de novo inşaat TCR. İkinci yaklaşım tam TCR sıra sağlamasına karşın, insan sabit bölge fare modellerinde klonlanmış TCRs vivo içinde ifade ile uyumlu değildir. Yaklaşımımız TCRs in vivo fare modelleri fonksiyonel analiz ile uyumlu olacak şekilde özel olarak tasarlanmıştır. Bir verimli ve rahat tek hücre doğrudan PCR parçalarının şablon ifade vektör alt klonlama için sağlar PCR Protokolü geliştirdik.

Bizim yaklaşım iki adımda gerçekleştirilen bir son derece hassas multiplex iç içe PCR reaksiyon kullanır. İlk multiplex tepki adım 40 astar V-beta zincirler için belirli bir havuz ve 44 astar tüm V-Alfa zincirleri TCR-alfa veya TCR-beta (Tablo 1) serisi ön bilgi olmadan yükseltmek için kullanılan belirli bir havuz. İleri astar 5' PCR ürününün dahil bir adaptör sırası vardır. Ters astar TCR sabit bölge üzerinde temel alır. Biz belirledik benzersiz kısıtlama siteleri yok insan değişken veya kavşak TCR bölgeler ve bunlar yeni redesigned TCRα ve TCRβ astar (şekil 1) içine dahil. İkinci iç içe geçmiş tepki olarak bir astar olarak adaptörü sırası için belirli ve sürekli bölgesi içinde iç içe geçmiş bir ters astar daha da artan özgüllük ile (Tablo 1, şekil 1) TCR zincir yükseltmek için kullanılır. Tek hücre izolasyon sonra iki PCR yuvarlar (ilk tepki Vα ve Vβ astar havuzu olan ve ikinci adaptör astar ile) neden doğrudan şablon retroviral vektör alt klonlanmış bir PCR ürünü olup. Son TCR yapı, bir tek açık okuma çerçevesi (ORF), 'kendi kendine sıyırmada' protein sırayla bağlı fare sürekli bölgeleri ile birlikte insan değişken bölgeler içinde kodlar P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)⁸. P2A sırası birden çok sistemlerinde kullanılan ve TCRs^8,9,10,11Ifade özellikle kapsamlı olarak sınanmıştır. Her ne kadar sonra çeviri P2A sıra kalır çoğu bağlı için C-terminus beta zinciri sinyal sıra ek bir prolin, bu değişiklik ise esnek bir bağlayıcı tarafından bağlı Alfa zincirinin TCR işlevi üzerinde zararlı bir etkisi yoktur. Fare sürekli bölgesi insan yerine yapısında sinyal akış yönündeki bileşenlere ile potansiyel değişmiş etkileşimleri önlemek için kullanılır ne zaman fare hücrelerinde yeniden dile getirdi. Tek ORF alpha ve beta zincirleri^9,11stokiometrik ayrı ifade neden olur. Geçerli protokol reaktifler ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar dayanmaktadır ve aerodinamik ve verimli bir şekilde yapılması için tasarlanmıştır. Biz özellikle otoimmün diyabet karıştığı self-reactive T hücrelerden TCRs tahlil için bu tekniği kullanmış olsa da, biz bu protokolü kimlik ve insan TCRs için belirli bir işlevsel değerlendirme için yaygın olarak uygulanabilir olabilir tahmin Otoimmün epitopları, kanser epitopları veya yanıt patojenlerin ve aşılar.

Protokol

1. ilgi T hücre nüfusu tanımlamak.

Not: antijen belirli hücre bölünmesi boya (gibi Carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE) ile birlikte nükleer silahların yayılmasına karşı-ebilmek var olmak kullanılmış-T hücreleri izole etmek için onların nükleer silahların yayılmasına karşı yanıt olarak antijenik stimülasyon dayalı. PBMCs başlayan, 7 günlük vitro genişleme bir antijen belirli CFSE düşük nüfus ¹² tanımlamak için yeterli olmalıdır.

1. Mix PBMCs besleyici MHC eşlemeli hücreleri ve etiket 5 µM CFSE hücre bölünmesi boya ile 1:1.
2. Plaka 2-2,5 x 10 ⁵ hücre başına iyi bir 96-şey yuvarlak-alt plaka 200 µL % 10 FCS tam RPMI medya kültür.
   Not: Tam RPMI içeren 2 mM l-glutamin, 1 mM sodyum pyruvate, 100 µM MEM önemli olmayan amino asitler, 5 mM HEPES, 5.5 × 10 ^{− 5} 2-mercaptoethanol birimleri, 100 U mL ^{− 1} penisilin ve 100 µg mL ^{− 1} streptomisin.
3. Teşvik hücreleri 25 µM peptid antijen ile.
4. Kültür dördüncü gününde dikkatle kaldırın ve medya 100 µL değiştirin.
   Not: Peptit-HLA tetramers ¹³ kullanımı antijen spesifik T hücre kimliği için daha uygun bir yaklaşımdır. Tetramer boyama sağlar antijen özgüllük gibi HLA-kısıtlama eşzamanlı değerlendirilmesi için.

2. Tek hücre sıralama ayarlayın.

1. Perform tüm yordamları bir başlık veya belirlenmiş bir alanda güçlendirilmiş şablon / ücretsiz. Aliquot, kontaminasyon reaktifleri temiz tüm çalışma yüzeyleri ve mümkünse, ekipman % 10 ile çamaşır suyu önce PCR Kur. Filtre ipuçları, RNAse ve Dnaz ücretsiz reaktifler ve plastik PCR ve adımları klonlama vektör kullanın. Anahtar reaktifler Malzemeler tablo bulundu.
   Not: Çoklu PCR reaksiyon son derece duyarlıdır ve kirlenme seviyesinin düşük güçlendirilmiş üründe neden olur.
2. Generate 10 x RT tepki birleştirerek ters transkripsiyon ana mix tampon, 25 X DNTPs, 9 U RT enzim, % 0,01 Triton-X, 0.7 U RNAse inhibitörü ve 383 nM (Tablo 1 ' de listelenen) her RT-TCR astar steril pipetting Reservoir. Pipetting sırasında sıvı kaybı telafi etmek için her 96-şey plaka için 10 ek reaksiyonlar (Toplam 106), için yeterli ana karışımını oluşturur. Reaksiyon bileşenleri ve iyi başına tutarları için bkz: Tablo 2.
3. Hazırlama bir 96-şey PCR koleksiyon plaka hücre başına iyi bir çok kanallı pipet ile ters transkripsiyon ana karışımı pipetting 6 µL sıralama için. Plaka buz veya soğuk bir blok içinde devam.
4. Etiket (örneğin, CD4 ve CD3, veya CD8 ve CD3, her biri 2 µg/mL, hücre bölünmesi boya veya boyama tetramer) yüzey işaretleyicileri hücre için antikorlar içeren hücreleri.
5. Bir sıralama T hücreleri hücre başına iyi, bir negatif kontrol görev yapacak on ikinci satır atlanıyor.
   Not: Sıralama verimliliğini kesin toplama plaka hizalama plaka sahibi gibi hücreleri ve plakaları cDNA reaksiyon önce düşük ısıda muhafaza içinde bağlı olacaktır. Koleksiyon tabakları buz üzerinde her zaman, dışında onlar içinde soğutma plaka tamir ederken, sıralama sırasında tutulmalıdır. Tüm sorters bir sıcaklık düzenlenmiş plaka sahibi ile donatılmıştır; Ancak, bir kullanımı önerilir. Sıralama genellikle yaklaşık 10-15 dk plaka başına alır bu yana, olup olmadığını RNA bozulması için artan bir potansiyel plaka bir düşük sıcaklıkta korunmaz.
6. Pozitif bir denetim olarak hücreleri (100 hücreleri) daha çok sayıda el ile bir pipet ile kuyuları için bu aşamada ekleyin. Alternatif olarak, daha önce izole RNA havuza alınan hücrelerden bir olumlu denetim 10, kullanılabilir ng iyi başına.
   Not: saf denetim RNA hassasiyetle pipet ve Çapraz bulaşma diğer wells ve yanlış pozitif sonuçlar önlemek için dikkat.
7. Yapıştırıcı film ile plaka mühür ve spin aşağı vasıl 1000 x g 5 min için saat 4'te ° C.
8. Hemen uyarlamak RNA cDNA için 25 ° c 10 dk, 37 ° C için 45 dk, plaka kuluçka ve 10 dk. 85 ° C
   Not: verimli PCR reaksiyon emin olmak için ilk PCR reaksiyon aynı gün yapılması önerilir. Alternatif olarak, kopya etmek plakaları-80 ° C'de 2 aya kadar tutulabilir.

3. Multiplex iç içe PCR gerçekleştirmek

Not: tüm ana karıştırır kirlenmesini önlemek için bir temiz ücretsiz şablon alanda hazırlayın.

1. Sulandırmak her değişken bölge astar Dnaz ve RNAse free H ₂ O. ile 100 µM Daha sonra her birinin V-Alfa astar havuzu oluşturmak için 44 astar 20 µL birleştirin. Astar havuzu V-beta oluşturmak için her biri 40 V-beta astar artı 80 µL Dnaz ve RNAse free H ₂ O. dizileri Tablo 1 ' de listelenen astar 20 µL birleştirir. Havuza alınmış bir kez her astar karışımında 2.3 µM bölgedir.
2. Sabit bölge astar Dnaz 100 µM hisse senedi çözüm için sulandırmak ve RNAse free H ₂ O. Dilute 10 µM çalışma çözüm ve aliquot kullanılmak için sabit bölge astar.
3. İki ayrı ana karışımları TCR-Alfa ve TCR-beta amplifikasyon için hazır olun. 5 X birleştirerek ana karışımları oluşturmak tampon, 80 µM dNTPs, % 3 DMSO, 2 µM astar Havuzu (46 son konsantrasyonu nM her astar için), 200 nM TCR-sabit bölge ters astar, 1 U DNA polimeraz ve Dnaz ve RNAse free H ₂ O (Tablo 2 < / strong >). Pipetting sırasında sıvı kaybı telafi etmek için yeterli ana mix 10 ek reaksiyonlar (Toplam 106), için her 96-şey plaka için makyaj.
   Not: Son şey, nerede 22.5 µL ana PCR karışımı 2.5 µL cDNA şablonu ile birleştirilmiştir başına 25 µL PCR hacmi hesaplamaları dayanır.
4. Plaka cDNA buz veya soğuk bir blok ile tutun. Bir çok kanallı TCR-beta tepki yeni bir 96-şey PCR tabak içine 22.5 µL pipet için kullanın. Sonra cDNA 2.5 µL PCR plaka aktarmak için bir çok kanallı kullanın.
5. Bir çok kanallı TCR-Alfa tepki içine doğrudan cDNA kalan içeren plaka 22.5 µL pipet kullanın.
6. Yapıştırıcı, yavaşça girdap ve spin aşağı vasıl 1000 x g 5 min için saat 4'te plakalarının ° C.
7. Multiplex PCR reaksiyon ile aşağıdaki devir çalıştırın: 95 ° C'de 5 dk 20 34 döngüsü tarafından takip s 95 ° c, 30 s 54 ° c ve 1 dk. 72 ° C'de 72 7 dakika izledi ° C.
8. Taşıma 25 son bir hacim içinde iç içe geçmiş PCR reaksiyon dışarı µL, multiplex PCR karışımı 2.5 µL şablon olarak kullanarak.
   1. İle Dnaz ve RNAse free H ₂ O. olun 10 µM aliquots çalışan hisse senedi için 100 µM için iç ve adaptör astar reconstitute.
   2. İki ayrı ana karışımları TCR-Alfa ve TCR-beta ampl için hazırlanın.ification. Mix 5 X arabellek, 25 X DNTP, % 3 DMSO, 200 nM ileri adaptör astar, 200 nM ters iç içe astar, 1 U DNA polimeraz ve DNA polimeraz ve nükleaz ücretsiz H ₂ O 22.5 µL (Tablo 2) son bir birim için. Pipetting sırasında sıvı kaybı telafi etmek için yeterli ana mix 10 ek reaksiyonlar (Toplam 106), için her 96-şey plaka için makyaj.
      Not: ikinci PCR reaksiyon kullanımda 5 X PCR tampon yükleme özel jel kolaylaştırmak için içeren yükleme boya.
   3. Bir çok kanallı, kullanarak ana karışımları iyi başına 22,5 µL adlı TCR-Alfa ve TCR-beta tepkiler iki yeni 96-şey PCR tabak içine pipette.
   4. Şey başına 2.5 µL, multiplex PCR reaksiyon şablonu ekleyin.
      Not: Kalan ilk PCR reaksiyon gereken mühürlü ve gerekli olursa ek şablon, bir kaynağı olarak hizmet için-20 ° C'de depolanan (4.3 Not adım bkz:).
   5. Plakaları, yavaşça girdap ve spin aşağı vasıl 1000 x g 5 min için saat 4'te mühür ° C.
   6. İç içe geçmiş PCR reaksiyon ile aşağıdaki devir çalıştırın: 95 ° C'de 5 dk 20 34 döngüsü tarafından takip s 95 ° c, 30 s 56 ° c ve 1 dk. 72 ° C'de 72 7 dakika izledi ° C.
   7. Çalıştırmak 5 µL % 1 özel olarak tepki son jel içeren etidyum bromür (negatif ve pozitif kontrol wells de dahil olmak üzere).
      Not: Beklenen grup yaklaşık 500 bp boyutunda çalıştırmalısınız. Şekil 2 ' deki bir örnek tepki.
   8. Bir 96-şey biçimi PCR arıtma seti kullanarak ikinci reaksiyon (20 µL) kalan arındırmak, 70 ° C H ₂ O şey başına 15 µL ile elute ve Sanger gerçekleştirmek sıralama. (Tablo 1) sıralama için uygun TCR-alfa veya TCR-beta adaptör ileri astar kullanın.
      Not: Dizileri online kullanılabilir immunogenetics yazılımı ile çözümlenebilir.

4. PCR zincirleri Alfa ve beta alt klonlama.

Not: ilk tepki olarak kullanılan ileri astar ve ikinci PCR reaksiyon geriye doğru astar havuzu kısıtlama siteleri birleştirmek için kullanılır. Bu nedenle, elde edilen alpha ve beta zinciri PCR ürünleri sırayla alt şablon retroviral vektör ( şekil 1) klonlanmış olmaya hazır mısınız.

Belgili tanımlık beta Urun

1. Özet arıtılmış PCR iç içe tepki ile BstbI ve MfeI (Tablo 3).
   Not: 5 µg Ekle aşmamaktadır.
2. Paralel olarak, BstbI ve MfeI (Tablo 3) ile şablon vektör sindirmek. 1-2 µg şablon vektörünün TCR başına kullanın. Üzerinde bir özel jel sindirilir vektör çalıştırmak ve daha büyük grup (~ 7500 bp) yalıtır. Bir jel DNA arıtma kiti ile vektör arındırmak.
   Not: restriksiyon enzimi Özet sırasında şablon fare TCR-beta değişken bölge, insan TCR-beta değişken bölge eklenmesi için izin kaldırılır.
3. Arındırmak PCR arıtma kiti kullanılarak sindirilir PCR ürünleri.
   Not: kit ile birlikte sütunları DNA arıtma kapasitesine doğrulayın; birden fazla sütun kullanın. Arıtılmış ekleme başarılı tüp ligasyonu reaksiyon için gerekli minimum meblağ 50 dır 10 ng/µL en az bir konsantrasyon, ng. Arıtılmış Ekle tutar için başarılı bir ligasyonu yeterli değilse, ikinci PCR reaksiyon tekrar edilebilir.
4. 37 ° C'de ısı inactivation 75 10 dk ardından kendini ligasyonu önlemek için şablon vektör 1 h için 10 U CIP enzim ile tedavi ° C. arındırmak DNA ile bir PCR arıtma Kiti (Tablo 3).
5. Ligate TCR-beta takın ve oda sıcaklığında 30 dk için DNA ligaz 6 molar aşırı ucun 20 µL toplam birimi kullanarak vektör.
   Not: Toplamda, yaklaşık 150 ligasyonu tepki içermelidir ng DNA (Tablo 3).
6. Dönüştürmeleri için ligasyonu tepki 8 µL 80 µL kimyasal olarak yetkili E.coli DH5α hücrelerinin (Malzemeler tablo) ile karıştırın ve 30 dk. 45 s. eklemek 500 µL için 42 ° C'de ısı şok buz üzerinde kuluçkaya Super En iyi suyu Catabolite bastırma (S.O.C.) orta ve sallamak için 1,5 saat 37 ° c
7. Plaka 250 dışarı µL bakteriyel kültür Lysogeny suyu (LB) agar plaka içeren bir Ampisilin üzerinde. Plaka gecede (~ 16 h) 37, kuluçkaya ° C.
8. Ertesi gün bakteri kolonileri almak ve gecede Ampisilin içeren 3 mL LB ortamda büyümek. DNA plazmid arıtma kit kullanarak plazmid DNA izole.
9. Beta zincirinin başarılı ekleme tarafından küçük ölçekli test Özeti enzimleri BstbI ve MfeI ile onaylayın. Bir 12 µL toplam reaksiyon hacminde 200-500 µg plazmid DNA, 0,25 µL her enzim ve 10 X enzim tampon (Tablo 3) oluşur. Reaksiyon dışarı Ekle grup boyutunu onaylamak için etidyum bromür içeren bir % 1'özel jel üzerinde çalıştırmak (~ 500 bp).
10. Ekleme varlığı onayladıktan sonra sıra IRES ters astar (Tablo 1) kullanarak vektör TCR-beta bölümü.
11. Sıra onay TCR-beta ucun takip Alfa değişken bölge ekleme için benzer işlemler gerçekleştirmek. Alfa iç içe tepki ve SnaBI ve SacII ile vektör içeren yeni oluşturulan TCR-beta INSERT arıtılmış PCR Urun sindirmek.
    Not: restriksiyon enzimi Özet sırasında şablon fare TCR-Alfa değişken bölge, insan TCR-Alfa değişken bölge eklenmesi için izin kaldırılır.
12. Ligate Alfa ekler içine oda sıcaklığında 30 dk için DNA ligaz 6 molar aşırı ucun 20 µL toplam birimi kullanarak karşılık beta değişken bölge kodlaması TCR vektörel çizimler.
    Not: Toplamda, yaklaşık 150 ligasyonu tepki içermelidir ng DNA (Tablo 3).
13. Dönüştürmeleri için ligasyonu tepki 8 µL 80 µL kimyasal olarak yetkili E.coli DH5α hücrelerinin (Malzemeler tablo) ile karıştırın ve 30 dk. 45 s. eklemek 500 µL S.O.C. için 42 ° C'de ısı şok buz üzerinde kuluçkaya Orta ve sallamak için 1,5 saat 37 ° c
14. Plaka 250 dışarı µL bakteriyel kültür Lysogeny suyu (LB) agar plaka içeren bir Ampisilin üzerinde. Plaka gecede (~ 16 h) 37, kuluçkaya ° C.
15. Ertesi gün bakteri kolonileri almak ve gecede Ampisilin içeren 3 mL LB ortamda büyümek. DNA plazmid arıtma kit kullanarak plazmid DNA izole.
16. Alfa zinciri başarılı ekleme tarafından küçük ölçekli test Özeti enzimleri SnaBI ve SacII ile onaylayın. 12 µL toplam reaksiyon hacminde 200-500 µg plazmid DNA, 0,25 µL her enzim ve 10 x enzim tampon (Tablo 3) oluşur. Reaksiyon dışarı Ekle grup boyutunu onaylamak için etidyum bromür içeren bir % 1'özel jel üzerinde çalıştırmak (~ 500 bp).
17. Ekleme varlığı onayladıktan sonra sıra MSCV2 ileri astar (Tablo 1) kullanarak vektör TCR-alfa bölümünü.
18. Alfa zinciri sıra doğrulandıktan sonra sıralama ile TCR-beta-ters ve IRES mütedavil astar (Tablo 1) tarafından tam TCR Ekle doğrulayın.

5. TCR hücre yüzey ifade ve özgüllük doğrulayın.

Not: HEK293T hücreleri başarılı TCR zincir PARI sınamak için kullanılırNG ve hücre ifade ( şekil 3A) ⁸ yüzey. Peptid-MHC tetramer boyama da gerçekleştirilebilir antijenik özgüllük yazı TCR gen yalıtımı ( şekil 3B) saklamak için test etmek için transfected HEK293T hücrelerde.

1. Plaka dışarı HEK293T hücreler 12-iyi doku kültürü plakaları, 1 mL tam DMEM medya içeren % 5 FCS kuyuda başına 1 x 10 ⁵ hücre ve kültür gecede at 37 ° C. plaka ayrı wells her yeni TCR için tanımladığınız için yeterince hücre dışarı , denetim şablonu TCR vektör, CD3 vektör sadece, kontrol TCR vektör tek ve bir transfected de.
   Not: Transfection bir şablonla tam olarak fare TCR vektör (mTCR-pMIA) kombinasyonu ile mCD3εγδζ-pMIG vektör, vektör yalnız, mTCR-pMIA ve mCD3εγδζ-pMIG vektör yalnız pozitif ve negatif denetimler kullanılır.
   Not: Tam DMEM 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum Pyruvate, 100 µM içerir Sigara-esansiyel Amino asitler, 5 mM HEPES tampon, 5,5 x 10 ^-5 ünite 2-mercaptoethanol, 100 U/ml penisilin/streptomisin.
2. Ertesi gün 1 µg chimeric h/mTCR-pMIA vektör, 1 µg fare CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vektör ve üretici talimatları lipozom tabanlı transfection reaktif hücrelerle transfect.
3. Her TCR için 6 µL transfection reaktif 100 µL oda sıcaklığına, serum-Alerjik DMEM ekleyin. Kısaca girdap ve 15 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya
4. Ayrı 1,5 mL tüpler TCR-pMIA vektör 1 µg 1 µg fare CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vektör veya denetimler için ayrı her vektör 1 µg birleştirin.
5. Dropwise, vektör DNA içeren tüpler transfection reaktif/DMEM çözüm ekleyin. 15 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya
6. Dropwise, HEK293T hücrelere transfection reaktif/DMEM/DNA çözüm ekleyin. Yavaşça karıştırın için plaka dokunun. 24 h için 37 ° C'de kuluçkaya
7. Sonra 24 h ortamı, değiştirin ve hücreler kültür ek 24 h için tutmak
8. Kaldırmak hücreleri plaka dinç pipetting tarafından ve anti-fare CD3 antikor (2,5 µg/mL) Akış Sitometresi tarafından chimeric TCR yüzey ifade doğrulamak için hücrelerle leke.
CD3 ifade benzer bir seviyeye transfected hücreler arasında karşılaştırmak için
9. kapı hücreleri floresan muhabir molekülleri (CD3 kompleksinin için GFP ve Ametrine TCR ifade vektör için) benzer yüksek düzeyde ifade analiz. En iyi şekilde, analiz geçişli GFP + Ametrine + 10 içindeki hücreleri ⁴ ' e 10 ⁵ floresan yoğunluğu ( şekil 3A).
   Not: Sahip chimeric yapı transfected hücrelerin CD3 ifade düzeyini kontrol fare (özgün şablon) vektör ( şekil 3A) yakın olabilir. Oluşturulan TCR retroviral vektörler vivo içinde ifade sistemleri ile uyumlu yukarıda açıklanan ⁴.

Sonuçlar

Multiplex iç içe PCR reaksiyon verimliliğini adım 3.2.7 (Şekil 2) bir özel jel ikinci reaksiyon 5µL çalıştırarak kontrol edilir. Ortalama TCR-beta amplifikasyon verimliliğini TCR-Alfa tepki verimliliğini yaklaşık %50 genellikle düşük ise yaklaşık % 80, olması bekleniyor⁴. Sadece eşlenmiş zincirleri TCR-Alfa ve TCR-beta-ebilmek var olmak kullanılmış için TCR ifade; Ancak, tüm PCR ürünleri TCR sıra ve reper...

Tartışmalar

Geçerli protokol tek hücre TCR amplifikasyon ve sonraki eşleştirilmiş TCR alpha ve beta zincirleri bir şablon retroviral ifade vektör alt klonlama için verimli bir yöntem açıklanmaktadır. Her ne kadar bazı tek hücre PCR protokollerine geliştirilmiştir, hiçbiri defa hemen bir ifade vektör alt klonlama ile uyumlu olması. Çoğu durumda, son derece değişken CDR3 bölgeleri kapsayan bir kısmi sıra, değişken bölge ulaşmak için yeterli sırası ile güçlendirilmiş. Bu daha küçük PCR ürün boyu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CFSE	eBioscience	65-0850-84	5 mM
anti-human CD4 (OKT4) BV421	Biolegend	317433	2 mg/mL
anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5	Biolegend	317336	2 mg/mL
anti-mouse CD3 AF647	Biolegend	100322	2.5 mg/mL
Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU	VWR	97068-158	0.7 U
Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit	Invirtogen	4368814	9 U (RT enzyme)
NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL	Invirtogen	AM9932
Gotaq DNA polymerase 2500U	VWR	PAM3008	1 U
96 Well Half Skirt PCR Plate	Phenix	MPX-96M2
MicroAmp Clear Adhesive Film	ThermoFisher	4306311
UltraPure Agarose	Invirtogen	15510-027
SnaBI	New England Biolabs	R0130	15 U (insert) 30 U (vector)
SacII	New England Biolabs	R0157	40 U (insert) 80 U (vector)
MfeI	New England Biolabs	R3589S	40 U (insert) 80 U (vector)
BstBI	New England Biolabs	R0519	40 U (insert) 80 U (vector)
Calf Intestinal Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	10 U
Quick ligase	New England Biolabs	M2200S
Wizard Plus minipreps DNA purification systems	Promega	A1460
Wizard Plus midipreps DNA purification systems	Promega	A7640
DNA clean & concentrator-25 kit	Genesee Scientific	11-304C
ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit	Genesee Scientific	11-306A
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28704
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells	ThermoFisher	18265017
Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent)	Mirus	MIR2300
BD FACS Aria II (sorter)	BD
BD Fortessa (flow cytometer)	BD