JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

قطرات الدهون هي عضيات مهمة لتكرار عدة مسببات الأمراض، بما في ذلك فيروس التهاب الكبد C (HCV). نحن تصف طريقة لعزل قطرات الدهون لمطياف الكتلة الكمية من البروتينات المرتبطة بها. أنها يمكن أن تستخدم في إطار مجموعة من الشروط، مثل عدوى فيروس، والإجهاد البيئي، أو العلاج من تعاطي المخدرات.

Abstract

قطرات الدهون ضرورية لتكرار مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض المختلفة، وأبرزها فيروس التهاب الكبد C (HCV)، والموقع المفترض التشكل الفيريون. ويمكن استخدام تحليل بروتيوم الدهون قطرات الكمي لتحديد البروتينات التي توطين أو مشردون من قطرات الدهون في ظل ظروف مثل العدوى بالفيروس. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي تم استخدامه بنجاح لوصف التغيرات التي طرأت على بروتيوم الدهون قطرات بعد الإصابة مع HCV. نحن نستخدم مستقرة النظائر وسمها مع الأحماض الأمينية في الثقافة الخليوي (SILAC)، وبالتالي تسمية بروتيوم كاملة من السكان واحدة من الخلايا التي تحتوي على الأحماض الأمينية "الثقيلة" ل quantitate البروتينات التي مطياف الكتلة. لعزل الدهون قطرة، والسكان الخلية اثنين (أي / "خفيفة" الأحماض الأمينية المصابة HCV و / الأحماض الأمينية "الثقيلة" غير المصابة السيطرة) يتم خلط 1: 1 و هي lysed ميكانيكيا في المخزن منخفض التوتر. بعد إزالة النوى وخلايا دebris بانخفاض الطرد المركزي السرعة، يتم إثراء البروتينات المرتبطة قطرات الدهون من قبل اثنين من الخطوات تنبيذ فائق اللاحقة تليها ثلاث خطوات الغسيل في المخزن متساوي التوتر. ويتم تحليل نقاء الكسور قطرات الدهون التي النشاف الغربية مع الأجسام المضادة الاعتراف مقصورات التحت خلوية مختلفة. ثم يتم فصل البروتينات المرتبطة قطرات الدهون عن طريق الكهربائي للهلام SDS-بولكرلميد (SDS-PAGE)، يليه Coomassie تلطيخ. بعد زيتية هضم، وكميا الببتيدات التي اللوني التأين electrospray، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي السائل (LC-ESI-MS / MS). باستخدام هذا الأسلوب، حددنا البروتينات تجنيدهم للقطرات الدهون على فيروس التهاب الكبد الوبائي التي قد تمثل العوامل المضيفة المؤيدة أو المضادة للفيروسات. يمكن تطبيق أسلوبنا لمجموعة متنوعة من الخلايا المختلفة والظروف والثقافة، مثل العدوى مع مسببات الأمراض، والإجهاد البيئي، أو العلاج من تعاطي المخدرات.

Introduction

قطرات الدهون هي غاية الحيوية هيولي (والنووية) عضيات الخلية تتكون من مجموعة أساسية من الدهون المحايدة (الدهون الثلاثية (TG) والكوليسترول استر (CE)) محاطة أحادي الطبقة من الدهون الفوسفاتية مع البروتينات جزءا لا يتجزأ 1. جميع أنواع الخلايا تنتج قطرات الدهون، ولكنها تختلف في الحجم والتكوين الدهون، والديكور البروتين. قطرات الدهون الوفاء وظائف متنوعة، بما في ذلك منصب الطاقة والسلائف غشاء الخزانات أو ودائع البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال امتصاص الدهون، وأنها تحمي الخلايا من lipotoxicity، والدهون الإفراج كما يشير الجزيئات، ويشاركون في تدهور البروتين والشبكة الإندوبلازمية (ER) استجابات التوتر 2. على هذا النحو، ومجموعة من البروتينات ربط قطرات الدهون ويحكم جيلهم، وتدهور، والاتجار، والتفاعل مع العضيات الأخرى. ومن بين هذه الأسرة perilipin من البروتينات الدهنية قطرة ملزمة الحسنة النية (PLIN1-5)و "> 3.

الدهون قطرات نشوء حيوي المرجح يبدأ في ER، حيث تحفيز الانزيمات-ER المقيمين تركيب الدهون المحايدة التي تتراكم داخل طبقة ثنائية الغشاء، وتشكيل عدسة الدهون المحايدة، وهي العملية التي كانت تصور في الآونة الأخيرة بشكل جيد في الخميرة 4. ثم ويعتقد أن غشاء الانحناء وارتفاع مستويات حمض ومادة ال diacylglycerol الفسفاتيديك لجذب البروتينات المشاركة في التركيب الحيوي فوسفورية، وتركيب وقت واحد من الدهون المحايدة الأساسية والدهون الفوسفاتية التدريع مطلوب لتوليد الدهون قطرات 5. الانزيمات إيواء المجالات عبر الغشاء الذي يقيم في ER تحفيز هذه العملية. التوسع إلى قطرات الدهون الكبيرة يتطلب النشاط من فئة مختلفة من الإنزيمات تجميع الدهون التي تؤوي على الحلزون متقابلة الزمر وبالتالي يمكن السفر من ER إلى قطرات الدهون. تعبئة الدهون من قطرات الدهون يحدث من خلال تفعيل المحلي للtriglyceridه ومادة ال diacylglycerol الليباز الليباز الدهنية الدهون الثلاثية (ATGL) وهرمون الليباز حساسة (HSL) أو عن طريق مسارات ذاتية البلعمة مختلفة، مثل الاقتصاد الكلي والاقتصاد microlipophagy أو الالتهام الذاتي 6 الوصيفة بوساطة. قطرات الدهون تتفاعل مع العضيات الخلوية الأخرى، مثل الميتوكوندريا (لبيتا للأكسدة والتوليف الدهن) وER (لتخليق الدهون والاتجار البروتين)، ولكن أيضا مع الجسيمات الحالة، الإندوسومات، والفجوات الناجمة عن البكتيريا داخل الخلايا 7. في الواقع البكتيريا والفيروسات والطفيليات حتى تستهدف قطرات الدهون للنسخ المتماثل والمثابرة، من بينها HCV 8.

فيروس التهاب الكبد الوبائي هو أحد الأسباب الرئيسية للمراضة ذات الصلة الكبد والوفاة في جميع أنحاء العالم، وهو ما يمثل حوالي 0.5 مليون حالة وفاة سنويا 9. العدد الحقيقي للإصابات HCV غير معروف، ولكن تشير التقديرات الأخيرة التي 130-150٬000٬000 الناس مصابون بشكل مزمن. لا VACCINيوجد الإلكترونية، ولكن تمت الموافقة عليه مؤخرا مضادات الفيروسات المفعول المباشر زيادة كبيرة الاستجابات العلاجية مقارنة مع العلاج القائم على فيروسات القياسية. ومع ذلك، في جميع أنحاء العالم، من المرجح أن يقتصر علاج المرضى بسبب التكاليف الباهظة للعلاجات جديدة. ما يقرب من نصف جميع الأفراد المصابين المزمنين مع HCV تطوير مرض الكبد الدهني (تنكس دهني)، وهي حالة تتميز التراكم المفرط للقطرات الدهون في خلايا الكبد. ومن المثير للاهتمام، ظهرت قطرات الدهون أيضا العضيات الخلوية كما الحيوية للنسخ المتماثل HCV، خدمة مزعومة كمواقع التجمع الفيروسية 10، 11.

في الخلايا المصابة HCV، جوهر البروتين الفيروسي وNS5A توطين لقطرات الدهون في عملية تعتمد على مكونات الدهون الثلاثية، ومثبطات مادة ال diacylglycerol ناقلة الأسيل-1 (DGAT1) يضعف الاتجار إلى قطرات الدهون وHCV لاحق إنتاج الجسيمات 12 و 13 و 14 و 15. وبالإضافة إلى ذلك، والطفرات في الدهون المجالات ملزم قطرة إما الأساسية أو NS5A قمع HCV التجمع 16 و 17. الأساسية وNS5A ثم تجنيد جميع البروتينات الفيروسية الأخرى، وكذلك المجمعات تكرار RNA الفيروسي، إلى الأغشية المرتبطة بشكل وثيق مع دهن قطرات 16. مطلوب إجراءات متضافرة من جميع البروتينات الفيروسية لإنتاج الناجح للسلالة الفيروسية المعدية 10 و 11. البروتينات الهيكلية هي جزء من virions، والبروتينات غير الهيكلية تعزيز التفاعلات البروتين البروتين المطلوبة لهذه العملية. ومن المثير للاهتمام، يطلب من حسن النية الدهون ملزم قطرة البروتين PLIN3 / TIP47 لكل من تكرار RNA HCV وإطلاق سراح virions 18 و 19 20. وعلى الرغم من هذه التطورات الأخيرة، وتفاصيل الآلية، وخاصة من التفاعلات الفيروسات المضيف أثناء المراحل المتأخرة من تكرار HCV، لا تزال غير محددة، وظيفة محددة من قطرات الدهون غير معروف.

هنا، نحن تصف طريقة لعزل قطرات الدهون لقياس الطيف الكتلي الكمي من البروتينات المرتبطة بها. باستخدام هذا الأسلوب، وجدنا تغيرات عميقة في بروتيوم الدهون الحبرية خلال فيروس التهاب الكبد الوبائي، وحددت A3 annexin كما بروتين المضيف الذي مع قطرات الدهون-fractionates التعاون ومطلوب لHCV كفاءة نضوج 21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام عن مستقرة النظائر وسمها مع الأحماض الأمينية في الثقافة الخليوي (SILAC)

ملاحظة: هنا، والكميات كيت SILAC البروتين - DMEM تستكمل مع 50 ملغ من 13 C 6 L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك كانت تستخدم لوضع العلامات SILAC. يتم توفير مدال الجنين العجل المصل (FCS) مع مجموعة الكميات SILAC البروتين.

  1. إزالة 50 مل من كل زجاجة من DMEM المتوسطة وإضافة 50 مل من FCS مدال.
  2. حل 50 ملغ من 13 C 6 L-ليسين-2HCl و 50 ملغ من 13 C 6 L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك في 1 مل من المتوسط. تخلط جيدا وإضافة الأحماض الأمينية إلى المتوسطة DMEM + FCS.
  3. إضافة 1X القلم / بكتيريا و1X-L الجلوتامين بديلا. معقم مرشح المتوسط ​​باستخدام فلتر 0.45 ميكرون. تسمية زجاجة كوسط SILAC "الثقيل".
  4. لإعداد "خفيفة" المتوسطة، كرر الخطوات من 1،1-1،3 باستخدام 50 ملغ من L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك و 50 ملغ من L-ليسين-2HCl. تسمية زجاجة باسم "ضوء "المتوسطة SILAC.

2. SILAC وضع العلامات والأحماض الأمينية تحكم التأسيس

  1. يعرض للتريبسين الخلايا (1X التربسين-EDTA) وانقسام 1 × 10 5 Huh7.5 الخلايا في 2 آبار لوحة الثقافة 6 جيدا تحتوي على 2 مل من المتوسط، واحدة بشكل جيد مع المتوسط SILAC "الثقيل" واحد مع "النور" SILAC المتوسطة.
  2. ثقافة الخلايا لمدة لا تقل عن 6 مقاطع (نسبة انقسام: 1: 6)؛ بعد 6 فقرات، يجب أن يكون إدراج الأحماض الأمينية "الثقيلة" أكثر من 95٪.
  3. حصاد 1 × 10 6 خلايا "الثقيل" - السكان الخلية -labeled و "النور" لتحليل فعالية التأسيس. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 160 x ج و 4 ° C.
  4. إعادة تعليق الكريات الخلايا في 150 ميكرولتر من MS-العازلة (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، و1 ملم EDTA تستكمل مع 1X كوكتيل مثبط البروتياز)، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة. ليز جملتعلمي اللغة اإلنكليزية صوتنة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: فيما يلي إعدادات صوتنة المستخدمة هنا: توقيت، عقد. مراقبة الانتاج، 8؛ دورة العمل، 80٪، و2 × 30 نبضة.
  5. إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 11000 x ج و 4 ° C. نقل طاف لأنبوب جديد وتحديد تركيز البروتين مع بروتين فحص المنظفات متوافق.
  6. خلط 75 ميكروغرام من البروتين العازلة مع عينة 6X (375 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 25.8٪ الجلسرين، 123 ملغ / مل SDS، 600 ميكروغرام / مل برموفينول الأزرق، و 60 ميكرولتر / مل β-المركابتويثانول)، يغلي في درجة حرارة 95 درجة C لمدة 5 دقائق، وفصل البروتينات عن طريق SDS-PAGE في SDS العازلة تشغيل (3.02 جم / L تريس قاعدة، 18.8 غ / L الجلايسين، و 1 غرام / L SDS) في 180 V لحوالي 1 ساعة أو وفقا لمصنعي "التعليمات.
  7. نقل جل في الغروية حل تلطيخ Coomassie. استئصال الفرقة البروتين نفسه من كل حارة. هضم البروتينات مع التربسين وتحليل فعالية التأسيس من قبل MS تحليل سياسيالصورة، كما هو موضح 22.

3. الدهون القطرة عزل الخلايا Huh7.5 المسمى SILAC

  1. تصيب السكان واحدة من الخلايا (أي تلك التي وصفت مع الأحماض "خفيفة" الأمينية) مع فيروس مراسل HCV التي يحتضنها مع مخزونات فيروس (على سبيل المثال، JC1 NS5AB-mKO2-BSD، MOI 1) لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية، كما هو موضح 21 .
    ملاحظة: JC1 NS5AB-mKO2-BSD هو فيروس HCV يحمل مراسل مضان (أحادى Kusabira أورانج 2، mKO2) لمراقبة معدلات الإصابة تليها Blasticidin المقاومة جين (BSD) بين تكرار موقع NS5A-NS5B الانقسام، التي سبق وصفها 21، 23. العمل مع HCV يتطلب BSL2 + (USA) أو S3 ** (ألمانيا) الاحتواء والممارسات على مستوى السلامة الحيوية. بدلا من الإصابة بفيروس HCV، وخلايا يمكن أن يصاب مع مسببات الأمراض المختلفة.
  2. توسيع الخلايا المصابة HCV "الخفيفة" وغير مصاب & #34؛ الخلايا الثقيلة "خلال الركض من الثقافات، وتحديد قسامة مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني وتحديد معدلات الإصابة HCV التدفق الخلوي من البروتين علامة فلوري (على سبيل المثال، mKO2)، كما هو موضح 21، و وينبغي أن تكون معدلات الإصابة أعلى من 90٪ للدهن قطيرة العزلة ملاحظة: إذا كنت تستخدم JC1 NS5AB-mKO2-BSD HCV سلالة، إضافة 10 ميكروغرام / مل blasticidin S إلى متوسطة "خفيفة" لتحديد لخلايا HCV إيجابي.
  3. 1 د قبل العزلة الدهون قطرة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، ويعرض للتريبسين، resuspend في "النور" و "الثقيل" المتوسطة، وعد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. بذور 7 × 10 6 خلايا من كل السكان في 150 سم 2 خلية طبق الثقافة. إعداد لا يقل عن 5 أطباق في "النور" و "الثقيل" سكان الخلية. ثقافة الخلايا في 30 مل من المتوسط ​​/ طبق O / N.
  4. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X. فصل الخلايا في 1XPBS باستخدام مكشطة الخلية.
  5. عدد سكان كل منهما خلية باستخدام غرفة عد نويباور وتجمع أعداد الخلايا متساوية في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 160 x ج و 4 ° C.
  6. إزالة PBS و resuspend بيليه خلية في 1 مل من عازلة السكروز (0.25 M السكروز، 1 ملم EDTA، و1 ملم DTT، على أن تستكمل مع الكوكتيل مثبط البروتياز). نقل تعليق خلية إلى ضيقة الخالط Dounce وليز الخلايا مع 200 السكتات الدماغية على الجليد.
    ملاحظة: تأكيد تحلل الخلية الكامل باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.
  7. نقل المحللة في أنبوب 1.5 مل microfuge وتدور باستمرار نوى وحطام خلية لمدة 10 دقيقة في 1000 x ج و 4 ° C.
  8. بعد الطرد المركزي، وتخزين قسامة من 25 ميكرولتر من جزء آخر من الأسلحة النووية (PNS) في -20 ° C كعنصر تحكم الإدخال.
  9. ضع بقية جزء الجهاز العصبي المحيطي في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي (11 × 60 ملم) وتراكب مع العازلة الدهون قطرات تغسل (~ 3 مل، 4 مل طفلالله) (50 ملي العازلة فوسفات البوتاسيوم 7.4 درجة الحموضة، و 100 ملي كلوريد البوتاسيوم، 1 ملم EDTA، و1 ملم phenylmethanesulfonyl الفلورايد).
  10. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 ساعة عند 100000 x ج و 4 ° C. حصاد العائمة جزء الدهون قطرات باستخدام عازمة، قنية حادة من أعلى الأنبوب (حوالي 250-500 ميكرولتر، اعتمادا على كمية من قطرات الدهون). وضع جزء الدهون قطرة في أنبوب الطرد المركزي (11 × 60 ملم)، وتراكب مع العازلة الدهون قطرات تغسل (~ 3.5 مل، 4 مل الكل)، وكرر الخطوة الطرد المركزي.
  11. حصاد العائمة جزء الدهون قطرات باستخدام عازمة، قنية حادة من أعلى الأنبوب ونقل قطرات الدهون إلى 1.5 أنبوب جديد microfuge مل. إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة الدهون قطرة وتدور لمدة 20 دقيقة في 21000 x ج و 4 ° C.
    ملاحظة: قطرات الدهون تظهر والفرقة بيضاء تطفو على أعلى العازلة.
  12. إزالة غسل العازلة تحتاني باستخدام هلام تحميل ماصة وكرر هذه الخطوة غسل ثلاث مرات.
  13. بعد إزالة النهائية للغسل العازلة باستخدام هلام تحميل ماصة، مزيج 5 ميكرولتر من الكسور قطرات الدهون مع 10 ميكرولتر من NP-40 تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 1٪ NP-40 ، على أن تستكمل مع الكوكتيل مثبط البروتياز). احتضان العينة على الجليد لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. تحديد مستوى البروتين مع بروتين فحص المنظفات متوافق. وهناك حاجة لا يقل عن 35 ميكروغرام من البروتين لMS-التحليل.
  14. تخزين الدهون كسور قطرة في -20 ° C.
  15. مزيج حجم المماثل من قطرات جزء الدهون مع 4x وصبغ التحميل. احتضان على الجليد لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. يغلي في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  16. فصل البروتينات باستخدام SDS-PAGE وفقا لبروتوكول الصانعين. نقل جل في الغروية حل تلطيخ Coomassie. استئصال جميع العصابات البروتين من الهلام. بعد تريبسيني في جل الهضم 24 </ سوب>، تتبخر العينات ويحل لهم في حمض الفورميك بنسبة 0.1٪. تحليل من قبل LC-MS / MS.
    ملاحظة: هنا، وLC-MS / MS أجريت التحليلات على الرباعي وقت من الطيران مطياف الكتلة (Q-TOF) أو على مصيدة الخطي الرباعي (LTQ) orbitrap مطياف الكتلة. وإلى جانب كل من الأدوات مع ESI المصدر إلى نظام نانو UPLC. تحليل البيانات وLC-MS / MS تحليل على Q-TOF وعلى مطياف الكتلة orbitrap أجريت على النحو المبين 21 و 22. الحرص على عدم تلويث العينة مع الكيراتين الإنسان. دائما استخدام نصائح ماصة خالية من الكيراتين وأنابيب. إعداد مخازن تحت غطاء تدفق الصفحي مع المواد الكيميائية خالية من الكيراتين. قبل الاستخدام، وتنظيف جميع الأسطح والأجهزة مع الماء المقطر والايثانول. دائما ارتداء القفازات ومعطف المختبر.

4. تحليل الدهون القطرة الطهارة

  1. تمييع aliquots من الدهون كسور قطرة 1: 2 وكسور الإدخال (راجع الخطوة 3.9) 01:10 مع NP-40 ليزهو العازلة. احتضان العينات في الثلج لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. تحديد مستوى البروتين مع بروتين فحص المنظفات متوافق.
  2. خلط كميات متساوية من البروتين العازلة مع عينة 6X واحتضان العينات في الثلج لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. المضي قدما SDS-PAGE ونقل البروتينات على غشاء النيتروسليلوز من النشاف دبابات على 80 V لمدة 90 دقيقة.
    ملاحظة: بعد حجب الغشاء في عرقلة العازلة (الخالي المجففة مسحوق الحليب 5٪ في TBS-T (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 0.05٪ Tween20))، واحتضان مع الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات قطرات الدهون (على سبيل المثال ، PLIN1، PLIN2، أو PLIN3) وعلامات من المقصورات التحت خلوية أخرى (على سبيل المثال، CALR، MnSOD، أو تويولين)، تليها الأجسام المضادة إلى جانب HRP الثانوية. استخدام التوهج للكشف عن البروتينات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

قطرات الدهون ضرورية لفيروس التهاب الكبد الوبائي مثل المواقع المفترضة التجمع الفيريون، ولكن الآليات الجزيئية من التشكل والخروج من virions غير معروفة إلى حد كبير. لتحديد عوامل التبعية المضيف جديدة تشارك في هذه العملية، أجرينا الكمي تحليل بروتيوم الدهو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا، نحن تصف بروتوكول لعزل قطرات الدهون لتحليل الدهون قطرات بروتيوم الكمي لمقارنة التخصيب واستنزاف البروتينات المرتبطة قطرات الدهون في ظل ظروف ثقافة متنوعة، مثل الالتهابات الفيروسية. كطريقة بديلة، يمكن إجراء تحليل بروتيوم مع quantifications خالية من التسمية على أساس مجم?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

نشكر R. Bartenschlager (جامعة هايدلبرغ) ليبني JC1، CM رايس (جامعة روكفلر) للخلايا Huh7.5، J مكلوشلان (مجلس البحوث الطبية وحدة علم الفيروسات) لبناء، T واكيتا (المعهد الوطني للJFH1 الأمراض المعدية، واليابان) لJFH1، وB وبستر ووك غرين (معهد جلادستون لعلم الفيروسات والمناعة) ليبني مراسل HCVcc. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من DFG (HE 6889 / 2-1 (EH)، INST 337 / 15-1 2013، وINST 337 / 16-1 2013 (HS)). ويدعم معهد هاينريش بيت، معهد ليبنيز لعلم الفيروسات التجريبي من قبل الحرة ومدينة هامبورغ ووزارة الصحة الاتحادية. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو في الإعداد للمخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
SILAC Protein Quantitation Kit - DMEMThermo Fisher89983 
13C6 L-Arginine-HCl 50 mgThermo Fisher88210
Roti-Load 1Roth GmbHK929.1
Roti-Blue 5x ConcentrateRoth GmbHA152.2 
10x SDS-Tris-Glycine - BufferGeyer Th. GmbH & Co.KG A1415,0250 
GlutaMAX (100x)Life Technologies GmbH 350500038 
Penicillin/Streptomycin Solution for Cell CultureSigma-Aldrich Chemie GmbH P4333-100ml 
DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered SalineSigma-Aldrich Chemie GmbH D8537 
Trypsin-EDTASigma-Aldrich Chemie GmbH T3924-100ML 
Sodium Chloride BioChemicaAppliChem GmbHA1149,1000
Tris Ultrapure  AppliChem GmbHA1086,5000A 
EDTA BioChemicaAppliChem GmbHA1103,0250
Protease Inhibitor Cocktail 5 mLSigma-Aldrich Chemie GmbH P8340-5ML 
D(+)-Sucrose BioChemicaAppliChem GmbHA3935,1000
Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NFAppliChem GmbHA0625
DC Protein Assay Bio-Rad Laboratoris GmbH 500-0116 
GlycerolAppliChem GmbH151339
SDS UltrapureAppliChem GmbHA1112
Bromophenol blueAppliChem GmbHA2331
β-Mercaptoethanol AppliChem GmbHA4338
BlasticidinInvivogenant-bl-1 
Potassium Chloride AppliChem GmbHA1039
Phenylmethanesulfonyl Fluoride AppliChem GmbHA0999
Potassium Phosphate MonobasicSigma-Aldrich Chemie GmbH 221309
Dipotassium HydrogenphosphateSigma-Aldrich Chemie GmbH P3786 
DTT AppliChem GmbHA2948
NP-40AppliChemA1694
TWEEN 20AppliChemA4974
Nonfat dried milk powderAppliChemA0830
Anti-ADFP/ ADRP abcamab52355
M6PRB1/TIP47 100 µgabcamab47639
Calreticulin, pAb 200 µgEnzo Life Science GmbH ADI-SPA-600-F 
Anti-β-Tubulin Sigma-Aldrich Chemie GmbH T6074 200µl  
Ethanol absolute (EtOH)Geyer Th. GmbH & Co.KG A3678,0250  
Anti-MnSODEnzo Life Science GmbH ADI-SOD-110-F
Anti-mouse HRPThermo Fisher Pierce32430
Anti-rabbit HRPThermo Fisher  Pierce32460
Amersham Hyperfilm ECLGE Healthcare28906836
Lumi-Light Western Blotting SubstrateSigma-Aldrich Chemie GmbH 12015196001
96-Well Cell Culture PlateGreiner Bio-One GmbH 655 180 
Terumo Syringe 1 mLTerumoSS-01T
Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm SARSTEDT 83.1823.100 
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gelBio-Rad Laboratoris GmbH 456-9034 
6-Well Cell Culture PlateGreiner Bio-One GmbH 657160 
Dishes Nunclon 150/20 Fisher Scientific GmbH 10098720 - 168381 
Cell ScraperneoLab Migge GmbH C-8120 
Tube, 50 mLGreiner Bio-One GmbH 227261 
SafeSeal Tube RNase-free SARSTEDT 72.706.400 
Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mmBeckman Coulter GmbH 344062 
Suction NeedlesTranscodent6482
Biosphere Fil. Tip 1000 SARSTEDT 70.762.211 
Biosphere Fil. Tip 200SARSTEDT 70.760.211 
Biosphere Fil. Tip 10SARSTEDT 70.1130.210 
Dounce Tissue GrinderFisher Scientific GmbH 11883722
Pestles For Dounce All-Glass Tissue GrindersFisher Scientific GmbH 10389444
Orbitrap Fusion
Branson Sonifier 450
Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mLEppendorf5355 000.127
Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, BioRad165-8033
Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting ChamberBioRad165-4110
PowerPac HC Power SupplyBiorad164-5052
Centrifuge Eppendorf5424R
Centrifuge Eppendorf5424
Optima L-90KBeckman Coulter GmbH 365670
SW 60 Ti RotorBeckman Coulter GmbH 335649
Infinite M1000 PROTecan

References

  1. Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
  4. Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
  5. Kory, N., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
  6. Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
  7. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49(2015).
  8. Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
  9. Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
  10. Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
  11. Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
  12. Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
  13. Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
  14. Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
  15. Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
  16. Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
  17. Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
  18. Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302(2013).
  19. Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
  20. Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
  21. Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
  22. Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
  23. Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
  24. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  25. Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
  26. Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
  27. Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
  28. Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
  29. Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122 SILAC C HCV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved