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要約

脂肪滴は、C型肝炎ウイルス（HCV）を含むいくつかの病原体の複製のための重要な器官です。我々は、関連するタンパク質の定量的な質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。そのようなウイルス感染、環境ストレス、または薬物治療などの条件の様々な環境下で使用することができます。

要約

脂肪滴は、ビリオンの形態形成の推定場所として、さまざまな病原体の様々な、最も顕著にC型肝炎ウイルス（HCV）の複製に不可欠です。定量的脂肪滴のプロテオーム解析は、にローカライズや、ウイルス感染などの条件の下での脂肪滴からずれているタンパク質を同定するために使用することができます。ここでは、我々が正常にHCV感染後脂肪滴プロテオームの変化を特徴づけるために使用されているプロトコルを記述します。私たちは、細胞培養（SILAC）中のアミノ酸と安定同位体標識化を使用するので、質量分析により、タンパク質を定量するために「重い」アミノ酸と細胞の1人の人口の完全なプロテオームにラベルを付けます。脂肪滴の単離のために、2つの細胞集団（ すなわち、HCVに感染/「光」は、アミノ酸及び非感染コントロール/「重」アミノ酸）1に混合される：1と低張性緩衝液中で機械的に溶解しました。核とセルDを除去した後低速遠心分離によってebrisは、脂肪滴関連タンパク質は、等張緩衝液で3回の洗浄工程に続いて二つの連続超遠心分離工程により濃縮されます。脂肪滴画分の純度は、異なる細胞内コンパートメントを認識する抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析されます。脂肪滴関連タンパク質は、次いでクマシー染色に続いてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分離されています。トリプシン消化後、ペプチドを、液体クロマトグラフィー - エレクトロスプレーイオン化 - タンデム質量分析（LC-ESI-MS / MS）により定量化されます。この方法を使用して、我々はプロまたは抗ウイルスの宿主因子を表すことができ、HCV感染の際に脂肪滴に動員するタンパク質を同定しました。私たちの方法は、このような病原体による感染症、環境ストレス、または薬物治療として、異なる細胞および培養条件の多様に適用することができます。

概要

脂肪滴は、埋め込まれたタンパク質1、リン脂質の単層によって囲まれた中性脂質（トリグリセリド（TG）とコレステロールエステル（CE））のコアからなる細胞小器官高度に動的な細胞質（および核）です。すべての細胞型は、脂肪滴を生成し、彼らはサイズ、脂質組成、およびタンパク質の装飾が異なります。脂質滴はエネルギーおよび膜前駆体リザーバとして、またはタンパク質沈着物として含む、多様な機能を果たします。また、脂質の摂取を介して、それらは脂肪毒性から細胞を保護し、放出脂質シグナル伝達分子として、およびタンパク質分解および小胞体に関与している（ER）ストレス応答2。そのため、タンパク質のホストは、脂肪滴に結合し、他の細胞小器官で自分の世代、劣化、人身売買、との相互作用を支配します。このうち（PLIN1-5） 善意の脂肪滴結合タンパク質のファミリーであるペリリピンF "> 3。

脂肪滴の生合成は、おそらくER常駐酵素は、中性脂質のレンズ、最近酵母4にうまく視覚化されたプロセスを形成し、膜二重層内に蓄積中性脂質の合成を触媒するERで開始します。曲げ膜と上昇ホスファチジン酸およびジアシルグリセロールレベルは、その後、脂肪滴生成5のために必要とされるコア中性脂質および遮蔽リン脂質の同時合成として、リン脂質生合成に関与するタンパク質を誘引すると考えられています。 ERに存在する膜貫通ドメインを保有する酵素は、このプロセスを触媒します。大きな脂肪滴への拡張は、両親媒性ヘリックスを抱い脂質合成酵素の異なるクラスの活動を必要とし、これ脂肪滴にERから移動することができます。脂質小滴からの脂質の動員はtriglyceridの局所活性化を介して起こりますEおよびジアシルグリセロールリパーゼは、脂肪トリグリセリドリパーゼ（ATGL）及びホルモン感受性リパーゼ（HSL）、またはそのようなマクロやmicrolipophagy又は異なるオートファジー経路では、オートファジー6を媒介シャペロン。脂肪滴は、（β酸化および脂質合成のための）、ミトコンドリアおよびERのような他の細胞小器官、（脂質合成及びタンパク質輸送のため）だけでなく、リソソーム、エンドソーム、および細胞内細菌7によって誘導された小胞と相互作用します。確かに細菌、ウイルス、およびさえ寄生虫は複製と持続性のための脂肪滴、それらの間のHCV 8をターゲットにしています。

HCV感染は、毎年9あたり0.5程度万人が死亡を占め、世界的に肝臓に関連する罹患率および死亡率の主要な原因の1つです。 HCV感染の真の数は不明であるが、最近の推定値は130することを示唆している - 1.5億人が慢性的に感染しています。ませんvaccineが存在するが、最近承認された直動抗ウイルス薬は劇的標準のインターフェロンベースの治療に比べて治療応答を高めます。しかし、世界的に、患者の治療は可能性が高いため、新しい治療法の非常に高いコストに制限されます。慢性的にHCVに感染したすべての個人の約半数は、脂肪肝疾患（脂肪症）、肝細胞における脂肪滴の過剰な​​蓄積によって特徴付けられる状態を開発します。興味深いことに、脂肪滴も推定されるウイルスアセンブリサイト10、11として、HCV複製のためなどの重要な細胞小器官を浮上しました。

HCV感染細胞では、ウイルスタンパク質のコアおよびNS5Aはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1（DGAT1）の阻害剤として、トリグリセリドの生合成に依存するプロセスにおける脂肪滴に局在する脂肪滴と後続のHCV粒子の産生12へ輸送を損ないます>、13、14、15。また、コアまたはNS5Aのいずれかの脂質小滴結合ドメインにおける変異は、HCVアセンブリ16,17を抑制する。コアおよびNS5Aは次に密接脂質滴16に関連付けられた膜に、他の全てのウイルスタンパク質、ならびにウイルスRNA複製複合体を動員します。すべてのウイルスタンパク質の協調行動は、感染性ウイルスの子孫10、11の成功の生産のために必要とされます。構造タンパク質はウイルス粒子の一部であり、そして非構造タンパク質は、このプロセスに必要なタンパク質 - タンパク質相互作用を促進します。興味深いことに、 真正脂肪滴結合タンパク質PLIN3 / TIP47は、HCV RNA複製およびビリオン18の放出の両方のために必要とされる、19 P>、20。これらの最近の進歩にもかかわらず、特にHCV複製の後期段階中のウイルス - 宿主相互作用のメカニズムの詳細については、不明確なままであり、脂肪滴の正確な機能は不明です。

ここで、我々は、関連するタンパク質の定量的質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。この方法を使用して、我々は、HCV感染の間の脂肪滴のプロテオームにおける大きな変化を発見し、脂肪滴で分画さを共同で効率的なHCVの成熟21のために必要とされる宿主タンパク質としてアネキシンA3を特定しました。

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プロトコル

細胞培養物中のアミノ酸と安定同位体標識（SILAC）のためのメディアの調製

注記：ここでは、SILACのタンパク質定量キット- 13 C 6 L-アルギニン塩酸をSILAC標識のために使用した50mgのを補充したDMEM。透析ウシ胎児血清（FCS）をSILACタンパク質定量キットを備えています。

  1. DMEM培地の各ボトルから50ミリリットルを除去し、透析FCSを50mLを加えます。
  2. 13 C 6 L-リジン二塩酸及び13 C 6 L-アルギニン塩酸培地1mL中の50mgの50mgを溶解します。完全に混合し、DMEM + FCS培地にアミノ酸を追加します。
  3. 1×ペニシリン/ストレプトマイシン、および1×L-グルタミン代替を追加します。 0.45μmのフィルターを用いて培地を滅菌フィルター。 「重い」SILAC媒体としてのボトルにラベルを付けます。
  4. L-アルギニン塩酸50mgのとL-リジン二塩酸50mgを用いて1.3 - 「光」培地を調製するために、繰り返し1.1ステップ。 」などのボトルにラベルを付けます光」SILAC媒体。

2. SILAC標識およびアミノ酸取り込みコントロール

  1. トリプシン処理細胞（1×トリプシン-EDTA）および「重」SILAC培地及び「光」を有するものでよく、培地2mlを含む6ウェル培養プレートの2つのウェルにいずれかを1×10 5のHuh7.5細胞を分割SILAC媒体。
  2. 培養少なくとも6継代のために細胞（スプリット比：1：6）。 6回の継代後、「重い」は、アミノ酸の取り込みは95％以上であるべきです。
  3. 収穫「重い」の1×10 6個の細胞-及び「光」標識細胞集団は、取り込み効率を分析します。 1×PBSで細胞を洗浄し、160×gで、4℃で5分間の遠心分離によって細胞をペレット化。
  4. MS-バッファー（150mMのNaCl、1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した50mMトリス-HCl pH7.4、および1mM EDTA）の150μLに細胞ペレットを再懸濁し、氷上で30分間細胞をインキュベートします。溶解C4℃で超音波処理することによりells。
    注：以下は、ここで使用する超音波処理の設定です：タイマー、ホールド。出力制御、8。デューティ・サイクル80％; 2×30パルス。
  5. 11,000×gで、4℃で10分間の遠心分離により細胞破片を除去します。上清を新しいチューブに移し、洗剤互換タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。
  6. 95℃で沸騰し、6×試料緩衝液（375 mMトリス - 塩酸、pH6.8の25.8％グリセロール、123 mg / mlとSDS、600 / mlのブロモフェノールブルー、60μL/ mLのβメルカプトエタノール）を用いてタンパク質の75μgのを混ぜますC 5分間、約1時間バッファ180 Vで（3.02グラム/ Lトリス塩基、18.8グラム/ Lグリシン、および1g / L SDS）を実行し、または製造業者によればSDSでSDS-PAGEによってタンパク質を分離指示。
  7. コロイド状クーマシー染色溶液中にゲルを移します。各レーンから同じタンパク質バンドを切り出します。トリプシンでタンパク質を消化し、MS analysiで取り込み効果を分析S、22記載の方法。

SILAC標識のHuh7.5細胞の3脂質液滴分離

  1. 21記載されているように、37°Cで4時間ウイルスストック（ 例えば、JC1 NS5AB-mKO2-BSD、MOI 1）でインキュベートすることによって（ すなわち 、「光」は、アミノ酸で標識されたもの）HCVレポーターウイルスでの細胞の集団を感染。
    注：JC1 NS5AB-mKO2-BSDは 21先に説明し、重複NS5A-NS5B切断部位との間のブラストサイジン耐性遺伝子（BSD）、続いて感染率を監視するための蛍光レポーター（モノマーKusabiraオレンジ2、mKO2）を担持するHCVウイルスです、 23。 HCVとの仕事はBSL2 +（USA）またはS3 **（ドイツ）バイオセーフティーレベルの封じ込めと実践が必要です。代わりにHCVの感染、細胞が異なる病原体に感染させることができます。
  2. HCVに感染した「光」細胞と非感染＆＃を展開34;重い」は、細胞培養物の継代時に、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）でアリコートを修正し21記載の蛍光マーカータンパク質（ 例えば、mKO2）のフローサイトメトリーによってHCV感染率を決定し、。 JC1 NS5AB-mKO2-BSDの HCV株を使用する場合、HCV陽性細胞を選択するために、「光」の媒体には10μg/ mLのブラストサイジンSを追加します。感染率は、NOTE脂肪滴の分離のための90％よりも高くなければなりません。
  3. 1 D脂質滴分離に先立って、PBS、トリプシン処理で細胞を洗浄し、「軽い」および「重い」培地中で再懸濁し、そしてノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞を数えます。シード150cm 2の細胞培養皿中の各集団の7×10 6個の細胞。 「光」と「重い」細胞集団あたり少なくとも5つの料理を準備します。培地/皿O / Nの30ml中の細胞。
  4. 培地を除去し、1×PBSで細胞を洗浄。 1Xで細胞を剥離細胞スクレーパーを用いてPBS。
  5. ノイバウアーカウントチャンバーを使用して、両方の細胞集団をカウントし、50mLの遠心分離管に等しい細胞数をプールします。 160×gで、4℃で5分間の遠心分離によって細胞をペレット化。
  6. PBSを除去し、スクロース緩衝液（0.25Mのスクロース、1mMのEDTA、および1mM DTT、プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した）1mLに細胞ペレットを再懸濁します。タイトフィットダウンスホモジナイザーに細胞懸濁液を移し、氷上で200ストロークで細胞を溶解。
    注：トリパンブルー染色を使用して、完全な細胞溶解を確認してください。
  7. 1.5mLの微量遠心管に溶解物を移す1,000×gで、4℃で10分間、核および細胞破片をスピンダウン。
  8. 遠心分離後、入力制御として-20℃でポスト核フラクションの25μL（PNS）のアリコートを格納します。
  9. 4mLのTOT;脂質滴の洗浄緩衝液（〜3 mLの遠心チューブ（11×60 mm）での底およびオーバーレイにPNS画分の残りを置きAL）（50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）、100mMの塩化カリウム、1mMのEDTA、および1mMフェニルメタンスルホニルフルオリド）。
  10. 10万XGと4℃で2時間遠心します。 （ - 脂肪滴の量に応じて500μL、約250）管の上部から屈曲、鈍いカニューレを用いてフローティング脂肪滴画分を回収。遠心チューブ（11×60 mm）の中の脂質滴画分を置き、脂肪滴の洗浄緩衝液（〜3.5 mLを、4mLの合計）とのオーバーレイ、および遠心分離工程を繰り返します。
  11. チューブの上部から屈曲、鈍いカニューレを用いてフローティング脂肪滴画分を回収し、新しい1.5mLの微量遠心管に脂肪滴を転送します。 21,000×gで、4℃で20分間の脂肪滴の洗浄バッファーとスピンの500μLを追加します。
    注：脂肪滴は、バッファの先頭に浮かぶ白いバンドとして表示されます。
  12. ゲルローディングピペットチップを使用して、下にある洗浄緩衝液を除去し、この洗浄工程を3回繰り返します。
  13. ゲルローディングピペットチップを使用して洗浄緩衝液の最終除去した後、NP-40溶解緩衝液（50mMトリス-HCl pH7.4、150mMのNaCl、1％NP-40の10μLと脂肪滴画分の5μLを混合、）プロテアーゼ阻害剤カクテルを補いました。感染性物質を扱う場合、ウイルスを不活性化するために1時間氷上でサンプルをインキュベートします。洗剤互換タンパク質アッセイとタンパク質レベルを決定します。タンパク質の少なくとも35μgのは、MS分析のために必要とされています。
  14. -20℃で脂肪滴の画分を保管してください。
  15. 4×ローディング色素と脂質滴画分の対応するボリュームを混ぜます。感染性物質を扱う場合には、ウイルスを不活性化するために氷上で1時間インキュベートします。 95℃で5分間沸騰させます。
  16. メーカーのプロトコルに従って、SDS-PAGEを使用してタンパク質を分離。コロイド状クーマシー染色溶液中にゲルを移します。ゲルからのすべてのタンパク質バンドを切り出します。トリプシン後のゲル内消化24 </ SUP>、サンプルを蒸発させ、0.1％ギ酸でそれらを溶解します。 LC-MS / MSによって分析します。
    注：ここで、LC-MS / MS分析四重極飛行時間型質量分析計（Q-TOF）または線形トラップ四重極（LTQ）オービトラップ質量分析計で行いました。両方の機器は、ナノUPLCシステムへESIソースに結合されました。データ分析およびLC-MS / MSは、21、22に記載のように行ったQ-TOF上及びオービトラップ質量分析計で分析します。人間のケラチンでサンプルを汚染しないように細心の注意を払います。常にケラチンフリーピペットチップやチューブを使用しています。ケラチンのない化学物質と層流フードの下でバッファを準備します。使用方法の前に、蒸留水とエタノールとのすべての表面とデバイスを清掃してください。常に手袋と白衣を着用してください。

脂質液滴純度の4分析

  1. 脂肪滴画分1のアリコートを希釈：2と入力画分をNP-40のLysで1:10（ステップ3.9参照）バッファです。感染性物質を扱う場合、ウイルスを不活性化するために1時間氷上でサンプルをインキュベートします。洗剤互換タンパク質アッセイとタンパク質レベルを決定します。
  2. 6×サンプルバッファーでタンパク質の等量を混合し、感染性物質を扱う場合、ウイルスを不活性化するために1時間氷上でサンプルをインキュベートします。 SDS-PAGEを続行し、90分間80 Vでタンクブロッティングによってニトロセルロース膜にタンパク質を移します。
    注：（TBS-T（10mMのトリス-HCl pH7.6の、150mMのNaCl、および0.05％のTween20）中の5％脱脂粉乳粉末）をブロッキング緩衝液中で膜をブロッキングした後、脂肪滴のマーカーに対する抗体と共にインキュベートする（ 例えば、PLIN1、PLIN2、又はPLIN3）および二次HRP結合抗体によって、続いて他の細胞内区画（ 例えば、CALR、のMnSOD、またはチューブリン）のマーカー。タンパク質の検出のための化学発光を使用してください。

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結果

脂肪滴は、ビリオンアセンブリの推定上のサイトとして、HCV感染に不可欠であるが、ビリオンの形態形成および出口の分子メカニズムは不明な点が多いです。そのプロセスに関与する新規ホスト依存因子を同定するために、我々は、HCV感染細胞21（ 図1A）の定量的な脂質滴プロテオーム解析を行いました。我々は、脂質滴を精製するため...

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ディスカッション

ここで、我々は、ウイルス感染のような多様な培養条件下で脂質滴、に関連するタンパク質の濃縮および枯渇を比較するために、定量的脂質滴プロテオーム解析のための脂質滴を分離するためのプロトコルを記述しています。別の方法として、プロテオーム解析は、全ピーク強度に基づくラベルフリー定量化を行うことができます。この方法には、ダイナミックレンジの制限がなく、代謝の?...

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開示事項

著者は、開示することは何もありません。

謝辞

私たちは、JC1のためのR. Bartenschlager（ハイデルベルク大学）構築、のHuh7.5細胞用のCMライス（ロックフェラー大学）、J・マクローチラン（医学研究評議会ウイルス学ユニット）JFH1のための構築、T.脇田の（国立研究所に感謝しますHCVccレポーター構築物のための感染症、JFH1日本）、及びB・ウェブスターおよびワック・グリーン（ウイルス学および免疫学のグラッドストーン研究所）。この作業はDFG（HE 6889 / 2-1（EH）、INST 337 / 15-1 2013およびINST 337 / 16-1 2013（HS））からの資金によって支援されました。ハインリック・ペット研究所、実験ウイルス学のためのライプニッツ研究所は無料とハンブルクのハンザ同盟都市と健康の連邦省によってサポートされています。資金提供者は、研究デザイン、データの収集と分析、公表することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
SILAC Protein Quantitation Kit - DMEMThermo Fisher89983 
13C6 L-Arginine-HCl 50 mgThermo Fisher88210
Roti-Load 1Roth GmbHK929.1
Roti-Blue 5x ConcentrateRoth GmbHA152.2 
10x SDS-Tris-Glycine - BufferGeyer Th. GmbH & Co.KG A1415,0250 
GlutaMAX (100x)Life Technologies GmbH 350500038 
Penicillin/Streptomycin Solution for Cell CultureSigma-Aldrich Chemie GmbH P4333-100ml 
DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered SalineSigma-Aldrich Chemie GmbH D8537 
Trypsin-EDTASigma-Aldrich Chemie GmbH T3924-100ML 
Sodium Chloride BioChemicaAppliChem GmbHA1149,1000
Tris Ultrapure  AppliChem GmbHA1086,5000A 
EDTA BioChemicaAppliChem GmbHA1103,0250
Protease Inhibitor Cocktail 5 mLSigma-Aldrich Chemie GmbH P8340-5ML 
D(+)-Sucrose BioChemicaAppliChem GmbHA3935,1000
Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NFAppliChem GmbHA0625
DC Protein Assay Bio-Rad Laboratoris GmbH 500-0116 
GlycerolAppliChem GmbH151339
SDS UltrapureAppliChem GmbHA1112
Bromophenol blueAppliChem GmbHA2331
β-Mercaptoethanol AppliChem GmbHA4338
BlasticidinInvivogenant-bl-1 
Potassium Chloride AppliChem GmbHA1039
Phenylmethanesulfonyl Fluoride AppliChem GmbHA0999
Potassium Phosphate MonobasicSigma-Aldrich Chemie GmbH 221309
Dipotassium HydrogenphosphateSigma-Aldrich Chemie GmbH P3786 
DTT AppliChem GmbHA2948
NP-40AppliChemA1694
TWEEN 20AppliChemA4974
Nonfat dried milk powderAppliChemA0830
Anti-ADFP/ ADRP abcamab52355
M6PRB1/TIP47 100 µgabcamab47639
Calreticulin, pAb 200 µgEnzo Life Science GmbH ADI-SPA-600-F 
Anti-β-Tubulin Sigma-Aldrich Chemie GmbH T6074 200µl  
Ethanol absolute (EtOH)Geyer Th. GmbH & Co.KG A3678,0250  
Anti-MnSODEnzo Life Science GmbH ADI-SOD-110-F
Anti-mouse HRPThermo Fisher Pierce32430
Anti-rabbit HRPThermo Fisher  Pierce32460
Amersham Hyperfilm ECLGE Healthcare28906836
Lumi-Light Western Blotting SubstrateSigma-Aldrich Chemie GmbH 12015196001
96-Well Cell Culture PlateGreiner Bio-One GmbH 655 180 
Terumo Syringe 1 mLTerumoSS-01T
Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm SARSTEDT 83.1823.100 
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gelBio-Rad Laboratoris GmbH 456-9034 
6-Well Cell Culture PlateGreiner Bio-One GmbH 657160 
Dishes Nunclon 150/20 Fisher Scientific GmbH 10098720 - 168381 
Cell ScraperneoLab Migge GmbH C-8120 
Tube, 50 mLGreiner Bio-One GmbH 227261 
SafeSeal Tube RNase-free SARSTEDT 72.706.400 
Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mmBeckman Coulter GmbH 344062 
Suction NeedlesTranscodent6482
Biosphere Fil. Tip 1000 SARSTEDT 70.762.211 
Biosphere Fil. Tip 200SARSTEDT 70.760.211 
Biosphere Fil. Tip 10SARSTEDT 70.1130.210 
Dounce Tissue GrinderFisher Scientific GmbH 11883722
Pestles For Dounce All-Glass Tissue GrindersFisher Scientific GmbH 10389444
Orbitrap Fusion
Branson Sonifier 450
Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mLEppendorf5355 000.127
Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, BioRad165-8033
Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting ChamberBioRad165-4110
PowerPac HC Power SupplyBiorad164-5052
Centrifuge Eppendorf5424R
Centrifuge Eppendorf5424
Optima L-90KBeckman Coulter GmbH 365670
SW 60 Ti RotorBeckman Coulter GmbH 335649
Infinite M1000 PROTecan

参考文献

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