JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Липидные капли являются важными органеллы для репликации нескольких патогенных микроорганизмов, в том числе вируса гепатита С (HCV). Мы опишем метод, чтобы изолировать липидные капли для количественного масс-спектрометрии ассоциированных белков; он может быть использован при различных условиях, например, вирусной инфекции, экологический стресс, или лекарственной терапии.

Аннотация

Липидные капельки имеют важное значение для репликации множества различных патогенов, наиболее заметно вирусом гепатита С (HCV), как предполагаемый сайт вириона морфогенеза. Количественный анализ протеых липидов капель может быть использован для идентификации белков, которые локализуют или смещены из липидных капель в условиях, такие как вирусные инфекции. Здесь мы опишем протокол, который был успешно использован для характеристики изменений в протеоме липидных капельного следующие инфекций HCV. Мы используем стабильные изотопы Этикетировочные с аминокислотами в культуре клеток (SILAC) и, таким образом маркировать полную протеые одной популяции клеток с «тяжелыми» аминокислотами для количественного определения белков с помощью масс-спектрометрии. Для выделения липидов капли, две клеточных популяций (то есть HCV-инфицированные / «легкая» аминокислота и неинфицированная контрольная / «тяжелая» аминокислота) смешивает 1: 1 и лизируют механически гипотонический буфер. После удаления ядер и клеток Debris низкоскоростного центрифугирования, липидные капли белки, ассоциированные обогащены два последующих стадий ультрацентрифугирования с последующих тремя стадиями промывки в изотоническом буфере. Чистота фракций капель липидов анализируют с помощью вестерн-блоттинга с антителами, распознающих различные субклеточные отсеки. Липидные капельные-ассоциированные белки затем разделяли с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующим окрашиванием Кумасси. После расщепления трипсина, пептиды количественно с помощью жидкостной хроматографии-ионизации электрораспыления-тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-МС / МС). С помощью этого метода, мы идентифицировали белки набраны в липидных капель при инфекции HCV, которые могут представлять про- или противовирусных факторов хозяина. Наш метод может быть применен к различным различных клеток и условий культивирования, таких как инфекции с патогенами, экологический стресс, или лекарственной терапии.

Введение

Липидные капли имеют высокие динамические цитоплазматические (и ядерные) органеллы клеток , состоящие из сердцевины нейтральных липидов (триглицериды (ТГ) и холестерин эфир (С)) приложен монослоем фосфолипидов со встроенными белками 1. Все типы клеток производят липидные капли, но они различаются по размеру, составу липидов и белков украшения. Липидные капли выполняют различные функции, в том числе, выступающие в качестве энергии и предшественников мембраны резервуаров или в виде белковых отложений. Кроме того, через поглощение липидов, они защищают клетки от Липотоксичности, липиды высвобождения в качестве сигнальных молекул, и участвуют в деградации белков и эндоплазматический ретикулум (ЭР) реакции на стрессе 2. Таким образом, множество белков связываются с липидных капель и регулируют их генерации, деградацию, торговлю, и взаимодействие с другими органелл. Среди них perilipin семейство добросовестных связывающих белков липидной капельки (PLIN1-5)е "> 3.

Липидный капли биогенез вероятно , начинается в ER, где ER-резидентов ферменты катализируют синтез нейтральных липидов , которые накапливаются внутри мембранного бислоя, образуя линзу нейтральных липидов, процесс , который недавно был визуализирован красиво в дрожжах 4. Мембрана изгиба и повышенные уровни фосфатидной кислоты и диацилглицерина затем думали , чтобы привлечь белки , участвующие в биосинтезе фосфолипидов, как одновременное синтеза основных нейтральных липидов и фосфолипидов экранирующих требуются для выработки липидов капели 5. Ферменты, несущие трансмембранные домены, которые находятся в ER катализирует этот процесс. Экспансия крупных липидных капель требует активности другого класса липидов синтеза ферментов, которые укрывают амфипатическую спираль и таким образом перемещаются из ЭР в липидных капель. Мобилизации липидов из липидных капель происходит за счет локальной активации triglyceridе и диацилглицерин липаза жировая ткань триглицерид липаза (ATGL) и гормон-чувствительная липаза (HSL) или различными пути аутофагии, такие как макро- и microlipophagy или шаперон-опосредованная аутофагия 6. Липидные капли взаимодействуют с другими клеточными органеллами, такие как митохондрии (для беты-окисления и синтеза липидов) и ER (для синтеза липидов и торговли белком), но и с лизосомами, эндосыми и вакуолей , вызванной внутриклеточными бактериями 7. Действительно бактерии, вирусы, паразиты и даже предназначаться липидные капли для репликации и упорства, среди них 8 HCV.

ВГС - инфекция является одной из ведущих причин печени , связанные с заболеваемостью и смертности во всем мире, что составляет около 0,5 миллиона смертей в год 9. Истинное число инфекций HCV неизвестно, но недавние оценки показывают, что 130 - 150 миллионов людей хронически инфицированы. Нет vaccinе существует, но недавно утвержденное прямое действие противовирусных значительно увеличить терапевтические реакции по сравнению со стандартной терапией интерферона основой. Тем не менее, во всем мире, лечение больных, вероятно, будет ограничено из-за чрезвычайно высокой стоимости новых терапевтических средств. Около половины всех лиц, хронически инфицированный вирусом гепатита С развитием жировой болезни печени (стеатоз), состояние, характеризующееся избыточным накоплением липидных капель в гепатоцит. Интересно, что липидные капли также становится жизненно важные клеточные органеллы для репликации HCV, предполагаемо , выступающей в качестве вирусных сборочных участков 10, 11.

В HCV-инфицированных клетках, вирусный белок ядра и NS5A локализуются в липидных капель в процессе , который зависит от биосинтеза триглицеридов, в качестве ингибиторов диацилглицерол ацилтрансферазы-1 (DGAT1) ухудшать оборотом в липидных капель и последующего производства HCV 12 частиц >, 13, 14, 15. Кроме того, мутации в липидных капельных-связывающих доменов либо ядра или NS5A подавить сборку HCV 16, 17. Сердечник и NS5A затем набирать все другие вирусные белки, а также комплексы репликации вирусной РНК, с мембранами , тесно связанных с липидом капель 16. Согласованные действия всех вирусных белков требуются для успешного производства инфекционного вирусного потомства 10, 11. Структурные белки являются частью вирионов, и неструктурные белки способствуют белок-белковых взаимодействий, необходимых для этого процесса. Интересно, что добросовестные липидный капелька-связывающий белок PLIN3 / TIP47 необходим как для HCV репликации РНК и высвобождение вирионов 18, 19 , 20. Несмотря на эти последние достижения, механистические детали, особенно на вирус-хозяин взаимодействий в поздних стадиях репликации вируса гепатита C, по-прежнему плохо определены, и точная функция липидных капель неизвестна.

Здесь мы описываем способ, чтобы изолировать липидные капли для количественного масс-спектрометрии ассоциированных белков. С помощью этого метода, мы обнаружили глубокие изменения в протеоме липидов капели во время инфекции HCV и определил аннексин A3 в качестве хоста - белка , который со-фракционирование с липидным капель и требуется для созревания эффективности HCV 21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка носителей для стабильного изотопа маркировки с аминокислотами в культуре клеток (SILAC)

Примечание: В данном случае Количественного комплекта SILAC белок - DMEM , дополненный 50 мг 13 С 6 L-аргинин-HCl использовали для маркировки SILAC. Диализовали фетальной телячьей сыворотки (FCS), снабжен Количественное Kit SILAC белка.

  1. Удалить 50 мл из каждой бутылки DMEM среды и добавляют 50 мл диализованной FCS.
  2. Растворяют 50 мг 13 C 6 L-лизин-2HCl и 50 мг 13 C 6 L-аргинин-HCl в 1 мл среды. Тщательно перемешать и добавить аминокислоты в среде DMEM + FCS.
  3. Добавить 1x пенициллина / стрептомицина и 1x L-глютамин замену. Стерильный фильтр среды с использованием фильтра 0,45 мкм. Этикетка бутылки как «тяжелый» SILAC среды.
  4. Для того, чтобы подготовить «свет» среды, повторите шаги 1.1 - 1.3 с использованием 50 мг L-аргинин-HCl и 50 мг L-лизин-2HCl. Этикетка бутылки как "свет»SILAC среды.

2. SILAC маркировка и Аминокислотное Включение управление

  1. Trypsinize клетки (1x Трипсин-EDTA) и сплит 1 х 10 5 клеток в Huh7.5 2 лунки планшета для культуры 6-луночный , содержащую 2 мл среды, а один с «тяжелым» SILAC среды и один с «свет» SILAC среда.
  2. Культуры клеток по меньшей мере, 6 проходов (сплит соотношение: 1: 6); после 6 проходов, включение «тяжелых» аминокислот должно быть более чем на 95%.
  3. Урожай 1 × 10 6 клеток на «тяжелую» - и «свет» популяции -меченых клеток для анализа эффективности инкорпорации. Промывают клетки в 1x PBS и осаждения клеток центрифугированием в течение 5 мин при 160 х г и 4 ° С.
  4. Ресуспендируют клеток гранул в 150 мкл MS-буфера (150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, и 1 мМ ЭДТА, дополненной 1x коктейль ингибитора протеазы) и инкубируют клетки на льду в течение 30 мин. Лизировать сгезов путем обработки ультразвуком при 4 ° С.
    Примечание: Ниже приведены параметры, используемые Ультразвука здесь: таймер, держать; управление выходом, 8; рабочий цикл, 80%; и 2 х 30 импульсов.
  5. Удалите остатки клеток путем центрифугирования в течение 10 мин при 11000 х г и 4 ° С. Передача супернатант в новую пробирку и определяют концентрацию белка с моющим средством, совместимый белкового анализа.
  6. Смешайте 75 мкг белка с 6х образца буфера (375 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 25,8% глицерина, 123 мг / мл SDS, 600 мкг / мл бромфенолового синего, и 60 мкл / мл β-меркаптоэтанола), кипение при температуре 95 ° с в течение 5 мин, и отделить белки от SDS-PAGE в SDS работает буфера (3,02 г / л Трис-основание, 18,8 г / л глицина и 1 г / л SDS) при 180 в в течение приблизительно 1 ч или в соответствии с производителями ' инструкции.
  7. Передача геля в коллоидный раствор окрашивания Кумасся. Акцизный ту же полосу белка из каждой полосы. Дайджест белков с помощью трипсина и анализировать эффективность включения с помощью MS analysiс, как описано 22.

3. Липидных капельного Выделения SILAC-меченые клетки Huh7.5

  1. Infect одну популяции клеток (т.е. те , помечено «легкие» аминокислоты) с вирусом репортера HCV путем инкубации с запасами вируса (например, Jc1 NS5AB-mKO2-BSD, MOI 1) в течение 4 ч при 37 ° С, как описано 21 ,
    Примечание: Jc1 NS5AB-mKO2-BSD представляет собой вирус гепатита С, несущим флуоресценциями репортера (мономерный Kusabira Orange 2, mKO2) для мониторинга показателей заболеваемости , за которыми следует бластицидину ген устойчивости (BSD) между дублированным сайтом расщепления NS5A-NS5B, описан ранее 21, 23. Работа с HCV требует BSL2 + (США) или S3 ** (Германия) биобезопасность уровня локализации и практики. Вместо инфекции ВГС, клетки могут быть заражены различными патогенами.
  2. Расширение HCV-инфицированных «легких» клеток и неинфицированных & #34;. Тяжелая»клетка во время пассирования культур, фиксирует аликвоты с 4% параформальдегидом (PFA) в PBS и определяют уровни инфекции вируса гепатита C с помощью проточной цитометрии белка флуоресцентных маркеров (например, mKO2), как описано 21, а уровни инфекции должны быть выше , чем 90% для липидов капель изоляции . ПРИМЕЧАНИЯ: При использовании Jc1 NS5AB-mKO2-BSD штамма вируса гепатита C, добавляют 10 мкг / мл бластицидина S к «легкой» среде , чтобы выбрать для HCV-позитивных клеток.
  3. 1 г до выделения липидов капли, промыть клетки с PBS, Trypsinize, ресуспендируют в «легкой» и «тяжелой» среды, и подсчет клеток с использованием счетной камеры Neubauer. Семенной 7 × 10 6 клеток каждой популяции в 150 см 2 клеточной культуральной чашке с. Приготовьте по крайней мере 5 блюд за «легкой» и «тяжелой» клеточной популяции. Культуры клеток в 30 мл среды / тарелки O / N.
  4. Удалите среду и промыть клетки в ом PBS. Отделить клетки в омPBS с использованием клеточного скребка.
  5. Граф оба клеточных популяций с помощью счетной камеры Neubauer и объединить одинаковое количество клеток в 50 мл центрифужной пробирки. Гранулы клетки центрифугирования в течение 5 мин при 160 й г и 4 ° С.
  6. Удалить PBS и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл буфера сахарозы (0,25 М сахарозы, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ ДТТ, с добавлением ингибиторов протеаз). Передача клеточной суспензии в облегающем Даунсе гомогенизатор и лизис клеток с 200 штрихами на льде.
    Примечание: Убедитесь, полный лизис клеток с использованием трипанового синего окрашивания.
  7. Передача лизата в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и спином вниз ядер и обломков клеток в течение 10 мин при 1000 х г и 4 ° С.
  8. После центрифугирования, хранить аликвоты 25 мкл постъядерной фракции (ПНС) при -20 ° С в качестве входного контроля.
  9. Поместите остальную часть фракции ПНС в нижней части трубки центрифуги (11 х 60 мм) и наложения с липидный промывочной капель буфера (~ 3 мл; 4 мл TOTаль) (50 мМ калий-фосфатного буфера рН 7,4, 100 мМ хлорида кали, 1 мМ ЭДТА, и фторид phenylmethanesulfonyl 1 мМ).
  10. Центрифуга в течение 2 ч при 100000 х г и 4 ° С. Урожай фракции липидов капель с использованием плавающей согнуты, тупой канюлю из верхней части трубы (приблизительно 250 - 500 мкл, в зависимости от количества липидных капель). Поместите фракцию липидов капель в центрифужной пробирке (11 х 60 мм), наложение с липидным промывочным капель буфером (~ 3,5 мл, 4 мл всего) и повторите шаг центрифугирования.
  11. Урожай фракции липидов капель с использованием плавающей согнуты, тупая канюли из верхней части трубки и передают липидные капли в новый 1,5 мл микроцентрифужной пробирки. Добавьте 500 мкл липидного капель промывочного буфера и спина в течение 20 мин при 21000 х г и 4 ° С.
    Примечание: липидные капли появляются в виде белой полосы, плавающей на верхней части буфера.
  12. Удалить нижележащий буфер для промывки с использованием геля загрузкой пипетки и повторить эту стадию промывки три раза.
  13. После окончательного удаления буфера для промывки с использованием геля загрузки пипетки, смешайте 5 мкл липидных фракций капель с 10 мкл NP-40 буфера для лизиса (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl и 1% NP-40 , с добавлением ингибиторов протеаз). Выдержите образец на льду в течение 1 ч для инактивации вируса при работе с инфекционным материалом. Определить уровень белка с помощью моющего средства, совместимого белкового анализа; по меньшей мере, 35 мкг белка необходим для MS-анализа.
  14. Хранить фракции липидов капель при -20 ° С.
  15. Смешайте соответствующий объем капельной фракции липидов с 4-кратным красителем. Выдержите на льду в течение 1 ч для инактивации вируса при работе с инфекционным материалом. Кипение при температуре 95 ° С в течение 5 мин.
  16. Отделить белки с помощью SDS-PAGE в соответствии с протоколом производителя. Передача геля в коллоидный раствор окрашивания Кумасся. Акцизный все белковые полосы из геля. После того, как трипсин в геле-переваривание 24 </ SUP>, испаряются образцы и растворить их в 0,1% -ной муравьиной кислоты. Анализ с помощью LC-MS / MS.
    Примечание: Здесь, ЖХ-МС / МС анализы были выполнены на масс-спектрометре Квадрупольный времени пролета (Q-TOF) или на линейной Trap квадрупольный (LTQ) Orbitrap масс-спектрометра. Оба прибора были соединены с ESI-источника к системе нано-UPLC. Анализ данных и ЖХ-МС / МС анализ на Q-TOF и на Orbitrap масс - спектрометра были выполнены , как описано 21, 22. Соблюдайте осторожность, чтобы не загрязнить образец с человеческим кератином. Всегда используйте кератиновые свободные наконечники и трубы. Подготовка буферов под капотом ламинарного потока с кератиновыми свободным химическими веществами. Перед использованием, очистить все поверхности и устройство с дистиллированной водой и этанолом. Всегда носите перчатки и лабораторный халат.

4. Анализ липидов дроплета чистоты

  1. Развести аликвот липидных фракций капель 1: 2 и входных фракций (см шаг 3.9) 1:10 NP-40 лизявляется буфером. Инкубируйте образцы на льду в течение 1 ч для инактивации вируса при работе с инфекционным материалом. Определить уровень белка с помощью моющего средства, совместимого белкового анализа.
  2. Смешайте равные количества белка с буфером 6х образца и инкубировать образцов на льду в течение 1 ч для инактивации вируса при работе с инфекционным материалом. Продолжить SDS-PAGE и переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану с помощью бака-блоттинга при 80 В в течение 90 мин.
    Примечание: После блокирования мембраны в блокирующем буфере (5% обезжиренное сушат сухое молоко в TBS-T (10 мМ Трис-HCl , рН 7,6, 150 мМ NaCl и 0,05% Tween 20)), инкубируют с антителами , направленными против маркеров капельных липидов (например , , PLIN1, PLIN2 или PLIN3) и маркеры других субклеточных отсеков (например, CALR, MnSOD или тубулина), с последующим вторичным HRP-антител в сочетании. Использование хемилюминесценции для обнаружения белков.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

липидные капли имеют жизненно важное значение для инфекции HCV, как предполагаемых участков сборки вириона, но молекулярные механизмы морфогенеза и выхода вирионов в значительной степени неизвестны. Для выявления новых факторов хозяина зависимостей , вовлеченных в э?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы опишем протокол для выделения липидных капель для количественного анализа липидов капель протеома, чтобы сравнить обогащение и истощение белков, ассоциированных с каплями липидов при различных условиях культивирования, таких как вирусные инфекции. В качестве альтернативно?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Р. Bartenschlager (Университет Гейдельберга) для конструкций Jc1, CM Райс (Rockefeller University) для клеток Huh7.5, J Мак-Лошлен (Medical Research Council вирусологии Unit) для JFH1 строительства, T Уэйкита (Национальный институт Инфекционные заболевания, Япония) для JFH1 и B Уэбстер и Ук Грин (Гладстон Институт вирусологии и иммунологии) для репортер конструкций HCVcc. Эта работа была поддержана за счет средств от DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013, и INST 337 / 16-1 2013 (HS)). Pette Институт Heinrich, Лейбниц Институт экспериментальной вирусологии поддерживается Вольного и Ганзейского города Гамбурга и Федеральным министерством здравоохранения. В спонсорам не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
SILAC Protein Quantitation Kit - DMEMThermo Fisher89983 
13C6 L-Arginine-HCl 50 mgThermo Fisher88210
Roti-Load 1Roth GmbHK929.1
Roti-Blue 5x ConcentrateRoth GmbHA152.2 
10x SDS-Tris-Glycine - BufferGeyer Th. GmbH & Co.KG A1415,0250 
GlutaMAX (100x)Life Technologies GmbH 350500038 
Penicillin/Streptomycin Solution for Cell CultureSigma-Aldrich Chemie GmbH P4333-100ml 
DPBS 1x Dulbecco's Phosphate-buffered SalineSigma-Aldrich Chemie GmbH D8537 
Trypsin-EDTASigma-Aldrich Chemie GmbH T3924-100ML 
Sodium Chloride BioChemicaAppliChem GmbHA1149,1000
Tris Ultrapure  AppliChem GmbHA1086,5000A 
EDTA BioChemicaAppliChem GmbHA1103,0250
Protease Inhibitor Cocktail 5 mLSigma-Aldrich Chemie GmbH P8340-5ML 
D(+)-Sucrose BioChemicaAppliChem GmbHA3935,1000
Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NFAppliChem GmbHA0625
DC Protein Assay Bio-Rad Laboratoris GmbH 500-0116 
GlycerolAppliChem GmbH151339
SDS UltrapureAppliChem GmbHA1112
Bromophenol blueAppliChem GmbHA2331
β-Mercaptoethanol AppliChem GmbHA4338
BlasticidinInvivogenant-bl-1 
Potassium Chloride AppliChem GmbHA1039
Phenylmethanesulfonyl Fluoride AppliChem GmbHA0999
Potassium Phosphate MonobasicSigma-Aldrich Chemie GmbH 221309
Dipotassium HydrogenphosphateSigma-Aldrich Chemie GmbH P3786 
DTT AppliChem GmbHA2948
NP-40AppliChemA1694
TWEEN 20AppliChemA4974
Nonfat dried milk powderAppliChemA0830
Anti-ADFP/ ADRP abcamab52355
M6PRB1/TIP47 100 µgabcamab47639
Calreticulin, pAb 200 µgEnzo Life Science GmbH ADI-SPA-600-F 
Anti-β-Tubulin Sigma-Aldrich Chemie GmbH T6074 200µl  
Ethanol absolute (EtOH)Geyer Th. GmbH & Co.KG A3678,0250  
Anti-MnSODEnzo Life Science GmbH ADI-SOD-110-F
Anti-mouse HRPThermo Fisher Pierce32430
Anti-rabbit HRPThermo Fisher  Pierce32460
Amersham Hyperfilm ECLGE Healthcare28906836
Lumi-Light Western Blotting SubstrateSigma-Aldrich Chemie GmbH 12015196001
96-Well Cell Culture PlateGreiner Bio-One GmbH 655 180 
Terumo Syringe 1 mLTerumoSS-01T
Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 µm SARSTEDT 83.1823.100 
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gelBio-Rad Laboratoris GmbH 456-9034 
6-Well Cell Culture PlateGreiner Bio-One GmbH 657160 
Dishes Nunclon 150/20 Fisher Scientific GmbH 10098720 - 168381 
Cell ScraperneoLab Migge GmbH C-8120 
Tube, 50 mLGreiner Bio-One GmbH 227261 
SafeSeal Tube RNase-free SARSTEDT 72.706.400 
Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mmBeckman Coulter GmbH 344062 
Suction NeedlesTranscodent6482
Biosphere Fil. Tip 1000 SARSTEDT 70.762.211 
Biosphere Fil. Tip 200SARSTEDT 70.760.211 
Biosphere Fil. Tip 10SARSTEDT 70.1130.210 
Dounce Tissue GrinderFisher Scientific GmbH 11883722
Pestles For Dounce All-Glass Tissue GrindersFisher Scientific GmbH 10389444
Orbitrap Fusion
Branson Sonifier 450
Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mLEppendorf5355 000.127
Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, BioRad165-8033
Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting ChamberBioRad165-4110
PowerPac HC Power SupplyBiorad164-5052
Centrifuge Eppendorf5424R
Centrifuge Eppendorf5424
Optima L-90KBeckman Coulter GmbH 365670
SW 60 Ti RotorBeckman Coulter GmbH 335649
Infinite M1000 PROTecan

Ссылки

  1. Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
  4. Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
  5. Kory, N., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
  6. Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
  7. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49(2015).
  8. Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
  9. Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
  10. Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
  11. Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
  12. Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
  13. Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
  14. Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
  15. Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
  16. Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
  17. Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
  18. Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302(2013).
  19. Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
  20. Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
  21. Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
  22. Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
  23. Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
  24. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  25. Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
  26. Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
  27. Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
  28. Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
  29. Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

122SILACHCV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены