Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من طول فترة طويلة للكهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LERLIC-MS / MS) الأسلوب. هذا هو منهجية جديدة تمكن لتقدير مرة الأولى، وتوصيف الجلوتامين والأسباراجين الإسوية نزع الأميد من البروتينات طلقات نارية.

Abstract

توصيف نزع الأميد البروتين لا بد من فك دور (ق) وإمكانات هذا البروتين posttranslational تعديل (PTM) في علم الأمراض البشرية وغيرها من السياقات البيوكيميائية. من أجل أداء توصيف نزع الأميد البروتين، وقد وضعنا مؤخرا رواية طويل طول كهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني، جنبا إلى جنب الطيف الكتلي (LERLIC-MS / MS) الطريقة التي يمكن فصل الجلوتامين (GLN) والهليونين (الأسباراجين) شكل الإسوي منتجات نزع الأميد من المركبات نموذج لعينات بيولوجية معقدة للغاية. LERLIC-MS / MS هو، وبالتالي فإن أول استراتيجية البروتينات بندقية لفصل وتقدير من الأشكال الإسوية نزع الأميد GLN. علينا أن نبرهن أيضا، والجدة، أن البروتوكول تجهيز العينات المذكورة هنا تستقر succinimide سيطة السماح توصيف من خلال LERLIC-MS / MS. تطبيق LERLIC-MS / MS كما هو موضح في هذه المقالة الفيديو يمكن أن تساعد على توضيح أونكنوو حالياالمصفوفات ن الجزيئية لنزع الأميد البروتين. بالإضافة إلى ذلك، يوفر LERLIC-MS / MS مزيد من فهم التفاعلات الأنزيمية التي تشمل نزع الأميد في الخلفيات البيولوجية متميزة.

Introduction

نزع الأميد هو تعديل البروتين posttranslational (PTM) الذي يقدم شحنة سالبة إلى العمود الفقري البروتين من خلال تعديل الهليونين (الأسباراجين) و / أو الجلوتامين (GLN) بقايا 1. هذا التعديل في حين تؤثر بقايا الأسباراجين يولد المنتجات ايزوميريا حمض isoaspartic (isoAsp) و n حمض -aspartic (الحية) في المشترك 3: نسبة 2 1. وعلى الرغم من أن هذه النسبة يمكن أن تتغير من خلال تدخل انزيم اصلاح-L isoaspartyl ناقلة الميثيل (PIMT) 3، 4. وبالمثل، نزع الأميد من بقايا GLN يولد الأحماض ايزوميريا جاما الجلوتاميك (γ-غلو) والأشكال الإسوية حمض الفا لالجلوتاميك (α-غلو) في متوقعة 1: 7 نسبة 3، 5، ولكن هذه النسبة يمكن أن تحول بفعل في كل مكان إنزيم الغلوتامين (2) وtransglutaminases الأخرى، بما في ذلك ناقلة الغلوتامين 1، عن طريق البريدnzyme التي تم تحديدها مؤخرا كما يرتبط مع حويصلات خارج الخلية في الدماغ 6.

أصل نزع الأميد يمكن أن تكون عفوية أو الأنزيمية، والسابق هو شائع بشكل خاص على بقايا GLN التي transglutaminases والأنزيمات الأخرى توسط أمور يشابك / داخل الجزيئي عبر transamidation (انظر 3 للحصول على مزيد من التفاصيل حول GLN transamidation وآثارها في عدة المزمنة و الأمراض التي تصيب الإنسان قاتلة). ولذلك، نزع الأميد هو PTM له تداعيات حاسمة على بنية ووظيفة الجزيئات تتأثر 4 و 7 و 8 و يتطلب الخواص الكيميائية في عمق 3 في ضوء نتائج البيوكيميائية المتنوعة بما في ذلك خدماتها على مدار الساعة كما الجزيئية الشيخوخة 9 .

وبالرغم من أن نزع الأميد من بقايا الأسباراجين نسبيا جيدا تتميز من قبل من أسفل إلى أعلى بندقية البروتينات 1، 10، نزع الأميد من بقايا GLN لا يزال لايوجد طريقة توصيف مناسبة ما وراء التحليل تحديا من المركبات النموذج من قبل القائم على الإلكترون تجزئة جذري 11. لقد وضعت مؤخرا رواية بعد واحد البروتينات بندقية استراتيجية (LERLIC-MS / MS) 3 التي تمكن فصل GLN والأسباراجين الإسوية نزع الأميد من العينات البيولوجية المعقدة والمركبات نموذج في تحليل واحد. ويستند LERLIC-MS / MS على الفصل بين الببتيدات تريبسيني هضمها باستخدام طول طويلة (50 سم) عمود التبادل الأيوني (LAX) العمل على وضع كهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني (ERLIC) وإلى جانب لجنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC- MS / MS). وقد استخدمت هذه الاستراتيجية تحليلية جديدة لتوصيف وquantitate نسبيا مدى كل بقايا deamidated في أنسجة الدماغ البشريو "> 3. ومع ذلك، فإن بروتوكول المذكورة هنا توفر التصوير الفيديو من LERLIC-MS / MS تهدف لدراسة خصائص نزع الأميد البروتين في سياق الكيمياء الحيوية من الفائدة.

بيان الأخلاق

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من هذا البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة نانيانغ التكنولوجية في سنغافورة وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.

Protocol

1. التعبئة وطول طويل أنيون الصرف (LAX) شعري العمود

(ملاحظة: على الرغم من أن العمود LAX يمكن أن يكون في المنزل معبأة كما وصفنا في هذا البروتوكول، والأعمدة LAX كما تتوفر تجاريا، انظر الجدول المواد والكواشف لمزيد من التفاصيل).

  1. تعليق 50 ملغ من ضعف مواد التعبئة والتغليف الصرف أنيون في 3.5 مل من التعبئة عازلة (الجدول 1) لتحضير الطين.
  2. تجميع نهاية العمود الشعري (طول 50 سم - 200 ميكرون قطرها الداخلي (ID) أنابيب) باستخدام الإناث والإناث المناسب، وferule والجوز الإناث. وضع الشاشة 1/16 "OD من 1 ميكرون حجم المسام داخل المناسب الإناث إلى الإناث (ملاحظة: الشاشة المستخدمة هنا يجب أن يكون أصغر حجم المسام من حجم الجسيمات من مواد التعبئة والتغليف لمنع تسرب المواد من عمود).
  3. حزمة الشعرية مع الطين باستخدام مضخة ضغط تعمل على 4500 رطل. (ملاحظة: حزمة من coluمليون حتى مواد التعبئة والتغليف واضح في دخول العمود).
  4. تجميع الطرف الآخر من العمود الشعري كما هو موضح في النقطة 1.2.

إعداد 2. عينة

ويحدد هذا البروتوكول تطبيق LERLIC-MS / MS لتحليل أنسجة المخ الإنسان كما بروتيوم نموذج. (ملاحظة: في حالة استخدام الأنسجة الأخرى أو عينات البروتين، وينبغي تكييف إجراءات إعداد العينات.)

  1. الأنسجة التجانس:
    ا. أنسجة الدماغ غسل (50-100 ملغ) مع 1X الفوسفات حل العازلة لمدة خمس دقائق ثلاث مرات.
    ب. تجانس الأنسجة في 1: 1: 2.5 الأنسجة / الخرز المعدنية / SDC التجانس العازلة (الجدول 2) نسبة (ث / ث / ت) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في أنابيب آمن قفل في أقصى كثافة استخدام الخالط الأنسجة. (ملاحظة: عازلة التجانس SDC قد تشمل مثبطات الأنزيم البروتيني كما هو مبين سابقا في 3)
    ج. أجهزة الطرد المركزي لجناسة الأنسجة، والتي تم الحصول عليها جيئة وذهابام الخطوة السابقة، في 10000 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وجمع طاف في جديد أنبوب 1.5 مل.
    د. كرر الخطوات قبل الميلاد لالكريات المتبقية والجمع بين supernatants عدة مرات حسب الضرورة حتى يتم احترام أي بيليه. (ملاحظة: إذا كان لديك لتكرار الخطوات قبل الميلاد أكثر من مرتين، نقل العينة والخرز لأنبوب جديد آمنة قفل لمنع فقدان عينة أثناء خطوة الطرد المركزي).
    ه. قياس تركيز البروتين من الخليط حصلت عليها حمض Bicinchoninic فحص (BCA) 12.
  2. deoxycholate الصوديوم (SDC) -assisted في حل زيتية الهضم 13 من الخليط الدماغ.
    ا. إضافة تركيز النهائي من 10 ملم dithiothreitol (DTT) (باستخدام محلول المخزون المشار إليها في حل 5 من الجدول رقم 3) لجناسة التي تم الحصول عليها للشروع في الحد من السندات البروتين ثاني كبريتيد.
    ب. احتضان جناسة خلال 30 دقيقة في حمامسلفا في 60 ° C.
    ج. إضافة إلى جناسة تركيز النهائي من 20 ملي iodoacetamide (IAA) باستخدام محلول المخزون المشار إليها في الحل 7 من الجدول (4).
    د. احتضان جناسة تحتوي على IAA في درجة حرارة الغرفة في الظلام خلال 45 دقيقة.
    ه. تمييع جناسة الدماغ يومين طيات باستخدام العازلة تخفيف (الحل 6 من الجدول 3).
    F. احتضان عينة لخطوة التخفيض الثاني خلال 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ز. إضافة التربسين تعديل التسلسل الصف الذائبة في الحل 2 من الجدول 2 في البروتين إلى إنزيم نسبة 01:50 (ث / ث).
    ح. هضم جناسة مع التربسين من الحضانة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
    أنا. إخماد الهضم الأنزيمي في اليوم التالي من خلال إضافة تركيز النهائي 0.5٪ من حمض الفورميك (FA). (ملاحظة: سوف إضافة FA يسبب ترسب الأملاح SDC تحت الظروف الحمضية).
    ي. دوامة بلطف العينات التي تحتوي على SDC precipi[تتس].
    ك. بيليه أسفل أملاح SDC بواسطة الطرد المركزي العينات في 12000 × ز، 4 ° C خلال 10 دقيقة.
    ل. جمع طاف ونقل السائل إلى أنبوب جديد نظيف. (ملاحظة: العناية خلال pipetting لهذه الخطوة لعدم إعادة تعليق و / أو جمع الأملاح من بيليه SDC).
    م. إعادة بحل بيليه SDC في SDC المذيبة إعادة عازلة (الجدول 5) تحت vortexing لقوي لمدة 1 دقيقة.
    ن. كرر الخطوات JL مرتين لاستعادة الببتيدات المترسبة والجمع بين supernatants. (ملاحظة: انظر سيرا وآخرون 2016 (13) لمزيد من التفاصيل حول SDC بمساعدة في حل بروتوكول الهضم زيتية تكييفها هنا.)
  3. إزالة الأملاح من تريبسيني هضمها العينات.
    ا. أداء تحلية عينات هضمها باستخدام خرطوشة 1G C-18. (ملاحظة: استخدام خرطوشة حجم كبير (5 مل) بشكل مستقل عن كمية البروتين الضمانات التي تم الحصول عليها التنظيف السليم للأملاح SDC المتبقية في العينات قبلالحقن LC-MS / MS).
    ب. أداء تكييف خرطوشة C-18 1G مع 5 مل من الأسيتونيتريل (ACN).
    ج. تمرير 5 مل من العازلة تنظيف (الجدول 6) من قبل مكيفة خرطوشة 1G C-18 لإزالة أي المذيبات العضوية المتبقية.
    د. تحميل العينة إلى خرطوشة 1G C-18.
    ه. أداء 3-5 خطوات تنظيف للعينة في العمود 1G C-18 باستخدام 5 مل من العازلة تنظيف كل خطوة.
    F. أزل الببتيدات المحلاة من 1G C-18 خرطوشة باستخدام 5 مل من شطف العازلة (الجدول 7).
    ز. تجفيف الببتيدات مزال في مكثف فراغ.
    ج. إعادة العينة المجففة في الحجم النهائي من 200 ميكرولتر من شطف العازلة. (ملاحظة: استخدم قوية وطويلة (> دقيقة) vortexing ل10 تليها صوتنة لاحقا في حمام صوتنة خلال 30 دقيقة لإعادة تعليق تماما الببتيدات المجففة في المخزن الحقن)
    د. ضبط حجم حقن العينة لLERLIC-MS / MS إلى anaينحل بين 1-3 ميكروغرام من البروتين.

3. البعد احد LERLIC-MS / MS الفصل

  1. شروط اللوني السائل:
    مراحل النقالة:
    A: 0.1٪ FA في الماء (الجدول 8).
    B: 0.1٪ FA ACN في (الجدول 9)
    معدل التدفق: 0.4 ميكرولتر / دقيقة
    العمود: عمود شعري LAX (طول 50 سم - 200 ميكرون ID)
    ا. استخدم التالي 1200 دقيقة التدرج: 95٪ B لمدة 40 دقيقة، 95-85٪ B عن 434 دقيقة، 85-70٪ B مقابل 522 دقيقة، 70-35٪ B عن 124 دقيقة، 35-3٪ B لمدة 45 دقيقة ، isocratic في 3٪ B لمدة 5 دقائق، 3-95٪ B أكثر من 7 دقائق وأبقى isocratic في 95٪ B لمدة 23 دقيقة.
    ب. أداء فصل الببتيدات باستخدام الشعرية LAX كما هو مبين في سيرا وGallart-بالاو وآخرون. 3 باستخدام فائقة ارتفاع ضغط اللوني السائل.
  2. الشامل التكوين مطياف:
    ا. تكوين تفاصيل الحدث المسح الضوئي لأداء الحصول على البيانات بالتناوب betweأون فورييه الكامل تحويل الكتلة الطيفي (FT-MS) وتحويل فورييه، جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (FT-MS / MS) مع المعلمات التالية:
    A.1. وضع الحصول على البيانات: إيجابية
    A.2 المعلمات FT-MS:
    مجموعة الشامل: 350 - 2000 م / ض
    قرار: 60،000
    Microscans: 1 في الطيف
    السيطرة التلقائية: 1 × 10 6
    A.3 المعلمات FT-MS / MS:
    وضع تجزئة: عالية الطاقة التفكك تصادم (HCD)
    A.4 قداس مجموعة: 150 - 2000 م / ض
    A.5 القرار: 30000
    أيونات A.6 الأعلى N: 10
    Microscans: 1 في الطيف
    تهمة الدولة:> 2+
    عرض العزلة: 2 دا
    A.7 السيطرة التلقائية: 1 × 10 6
    ب. أداء كشف مطياف الكتلة من الببتيدات كما هو مبين في 3 باستخدام مطياف الكتلة orbitrap مجهزة مصدر nanoelectrospray أيون تعمل على 1.5 كيلو فولت.

تحليل 4. البيانات

  1. أداء المتواجدفي البحث في قاعدة البيانات إلى LERLIC-MS / MS الحصول على بيانات باستخدام المعلمات التالية باستخدام برنامج البروتين محددة: (ملاحظة: الاطلاع على 3 لمزيد من التفاصيل).
    ا. أيون التسامح: 10 جزء في المليون
    ب. جزء التسامح أيون: 0.05 دا
    ج. معدل اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت): 1٪
    د. قاعدة بيانات: قاعدة بيانات يونيبروت الإنسان
    ه. التعديلات ثابت: Carbamydomethylation في السيستئين
    F. التعديلات متغير (إذا لزم الأمر من قبل البرنامج): الأكسدة (الحد)، نزع الأميد (الأسباراجين وGLN).
  2. توصيف ثقة وتقدير من المنتجات deamidated ايزوميريا في البيانات LERLIC-MS / MS:
    ا. تصدير نتائج البحث قاعدة البيانات من LERLIC-MS / MS إلى برنامج spreedsheet للتحليل.
    ب. البحث واستخراج قائمة كاملة من الببتيدات deamidated ونظرائهم غير deamidated.
    ج. باستخدام قائمة من الببتيدات التي تم الحصول عليها كمرجع، استخراج الاستشرابية أيون (XICs) من هذه الببتيدات باستخدام برنامج appropiate في 5 جزء في المليون من التسامح الشامل. (ملحوظة:الاطلاع على 3 لمزيد من التفاصيل حول البرمجيات المستخدمة لاستخراج XICs).
    د. بصريا تفقد XICs التي تم الحصول عليها لتحديد فصل مزدوجة الذروة شطف من المنتجات ايزوميريا كما هو مبين 3. (ملاحظة: المنتجات ايزوميريا تلك الببتيدات المحددة على مستوى MS / MS يمكن بسهولة العثور تسترشد جود مرتين الاحتفاظ مختلفة في نتيجة البحث في قاعدة البيانات.)
    ه. الكمي النسبي للمنتجات ايزوميريا من كل موقع deamidated / الببتيد يجب أن يقوم على أساس منطقة ذروة كل متزامر المحددة في XICs التي تم الحصول عليها.

النتائج

ويعتبر نزع الأميد من GLN والأسباراجين بقايا تعديل البروتين التنكسية (DPM) متورط في العديد من الأمراض المزمنة والقاتلة 14. وقد ثبت أن هذا PTM يمكن التنبؤ دول نصف العمر والهادمة من الأجسام المضادة والجزيئات الأخرى في الجسم البشري والخلفيات ال?...

Discussion

في هذا الفيديو المقال نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من LERLIC-MS / MS 3، وهي طريقة لأداء توصيف معمقة وتحديد دقيق لمدى نزع الأميد البروتين والعمليات الأنزيمية المعنية على هذا التعديل البروتين. ويستند LERLIC-MS / MS على استخدام طول طويلة (50 سم) LAX وفقا لمبدأ كهرباء-التنافر م...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وكان هذا العمل في جزء بدعم من المنح المقدمة من سنغافورة وزارة التربية والتعليم (المستوى 2: منح ARC9 / 15)، مجلس البحوث الطبية الوطنية في سنغافورة (NMRC-OF-IRG-0003-2016)، وجامعة تايوان الوطنية، NHG بحوث الشيخوخة غرانت ( منحة ARG / 14017). ونود أن نعرب عن امتناننا وشكرنا خالص للدكتور أندرو ألبرت وفريق PolyLC لتوفير تتكرم لنا مع مواد التعبئة والتغليف التي جعلت ذلك ممكنا هذه الدراسة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material)PolyLC Inc.Special order
Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm IDPolyLC Inc.Special order
PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm lengthSGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia 620050
Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbingUpchurch ScientificUPCHF-125
Female nut for microferuleUpchurch ScientificUPCHP-416
MicroferuleUpchurch ScientificUPCHF-132
Pressure Bomb NanoBaumeWestern Fluids EngineeringSP-400
Shimadzu Prominence UFLC systemShimadzuProminence UFLC
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24
Safe-lock tubesEppendorf T9661-1000EA
Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile.Next AdvanceSSB14B
Table-top centrifuge Hettich ZentrifugenRotina 380 R
Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VACPolyScience 8006 6L8006A11B
Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mgWatersWAT020805
Vacumm concentratorEppendorf Concentrator Plus System
Dionex UltiMate 3000 UHPLC DionexUltiMate 3000 UHPLC 
Orbitrap Elite mass spectrometerThermo Fisher Scientific Inc.ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray Michrom-Bruker Inc.TCSI-SS2
Incubator INCUCELL MMM GroupINCUCELL111
Sequencing-grade modified trypsinPromegaV5111
Protease inhibitor cocktail tabletsRoche11836170001 (ROCHE)
Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x)Sigma-AldrichP5493
Ammonium acetateSigma-AldrichA1542
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
IodoacetamideSigma-Aldrichi6125
Formic acidSigma-AldrichF0507 (HONEYWELL)
Ammonium hydroxideSigma-Aldrich338818 (HONEYWELL)
Acetonitrile HPLC gradeSigma-Aldrich675415
Isopropanol HPLC gradeSigma-Aldrich675431
Water HPLC gradeSigma-Aldrich14263

References

  1. Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
  2. Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
  3. Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
  4. Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
  5. Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
  6. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
  7. Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
  8. Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
  9. Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
  10. Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
  11. Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
  12. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  13. Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
  14. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
  15. Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
  16. Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
  17. Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
  18. Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
  19. Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
  20. Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
  21. Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
  22. Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
  23. Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
  24. Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
  25. Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
  26. Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
  27. Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
  28. Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
  29. Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
  30. Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122 ERLIC LERLIC DPMS Posttranslational PTMs Transamidation LAX HILIC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved