LERLIC-MS / MS pour la caractérisation en profondeur et Quantification de Glutamine et asparagine désamidation dans Shotgun Proteomics

Résumé

Ici, nous présentons un protocole étape par étape de la spectrométrie de masse de grande longueur d'interaction de répulsion électrostatique chromatographie hydrophile-tandem procédé (LERLIC-MS / MS). Ceci est une nouvelle méthodologie qui permet pour la première quantification et la caractérisation des temps glutamine et l'asparagine isoformes désamidation par protéomiques de fusil de chasse.

Résumé

Caractérisation des désamidation des protéines est impératif de déchiffrer le rôle (s) et les potentialités de cette modification post-traductionnelle de protéines (PTM) en pathologie humaine et d'autres contextes biochimiques. Afin d'effectuer la caractérisation des protéines désamidation, nous avons récemment développé une nouvelle spectrométrie de masse de grande longueur d'interaction répulsion hydrophile électrostatique chromatographie en tandem méthode (LERLIC-MS / MS) qui peut séparer la glutamine (Gln) et isoforme asparagine (Asn) produits de désamidation de composés modèles à des échantillons biologiques complexes. LERLIC-MS / MS est, par conséquent, la première stratégie protéomiques de fusil de chasse pour la séparation et la quantification des isoformes de Gln désamidation. Nous démontrons aussi, comme une nouveauté, que le protocole de traitement de l'échantillon décrit ici stabilise l'intermédiaire permettant sa caractérisation succinimide par LERLIC-MS / MS. Application de LERLIC-MS / MS comme indiqué dans cet article vidéo peut aider à élucider le moment Unknown matrices moléculaires de désamidation des protéines. De plus, LERLIC-MS / MS fournit une meilleure compréhension des réactions enzymatiques qui englobent désamidation dans les milieux biologiques distincts.

Introduction

Désamidation est une modification post - traductionnelle des protéines (PTM) qui introduit une charge négative sur le squelette de la protéine par modification de l' asparagine (Asn) et / ou de la glutamine (Gln) les résidus ^1. Cette modification tout en affectant des résidus Asn génère les produits isomères d' acide isoaspartique (isoAsp) et l' acide aspartique (Asp) à un 3 commun: rapport 1 ^2. Néanmoins, ce rapport peut être modifié par l'intervention de l'enzyme de réparation L-isoaspartyl méthyltransférase (PIMT) ^{3, 4.} De même, la désamidation de résidus Gln génère l'acide gamma-glutamique isomérique (γ-Glu) et des isoformes de l' acide alpha-glutamique (α-Glu) à une escompté 1: 7 Ratio ^{3, 5,} mais ce rapport peut être déplacé par l'action de l'enzyme ubiquitaire transglutaminase 2 et d'autres transglutaminases, y compris transglutaminase 1, enzyme récemment identifié comme étant associées à des vésicules extracellulaire dans le cerveau ^6.

L'origine de la désamidation peut être soit spontanée ou enzymatique, le premier est particulièrement fréquent sur les résidus Gln dans lequel transglutaminases et d' autres enzymes médient reticulation inter / intra-moléculaire par transamidation (voir ³ pour plus de détails sur Gln transamidation et ses implications dans plusieurs chroniques et maladies humaines fatale). Par conséquent, la désamidation est un PTM qui a une répercussion décisive sur la structure et la fonction des molécules concernées ^{4, 7, 8} et nécessite une caractérisation chimique en profondeur ³ à la lumière de ses conséquences biochimiques différentes , y compris son service comme horloge moléculaire du vieillissement ⁹ .

Bien que désamidation des résidus Asn a été relativement bien caractérisé par la protéomique fusil de chasse de bas en haut ^{1, 10,} désamidation de résidus Gln n'a toujours pas une méthode de caractérisation approprié au - delà de l'analyse difficile de composés modèles par fragmentation radical ^{électron-11.} Nous avons récemment mis au point une nouvelle stratégie de protéomique de fusil de chasse d' une dimension (LERLIC-MS / MS) ³ qui permet la séparation des isoformes et Gln Asn désamidation à partir d' échantillons biologiques complexes et composés modèles en une seule analyse. LERLIC-MS / MS sont basées sur la séparation des peptides digérés à la trypsine en utilisant une grande longueur (50 cm) sur une colonne échangeuse d'ions (LAX) fonctionnant en mode de chromatographie d'interaction de répulsion hydrophile électrostatique (Erlic) et couplée à spectrométrie de masse tandem (LC- MS / MS). Cette nouvelle stratégie d'analyse a été utilisée pour caractériser et relativement quantifier l'étendue de chaque résidu désamidée dans les tissus du cerveau humainf "> 3. Néanmoins, le protocole décrit ici fournira l' imagerie vidéo de LERLIC-MS / MS visant à étudier les particularités de désamidation des protéines dans le contexte biochimique d'intérêt.

DÉCLARATION ÉTHIQUE

Toutes les procédures de ce protocole ont été approuvés par le comité d'examen institutionnel de l'Université technologique de Nanyang à Singapour et ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles.

Protocole

1. Emballage Fanion-échange de grande longueur (LAX) Colonne Capillaire

(Note: Bien que la colonne LAX peut être emballé à domicile que nous décrivons dans ce protocole, les colonnes LAX sont disponibles dans le commerce, voir également le tableau des matériaux et des réactifs pour plus de détails).

1. Suspension de 50 mg de matériau de garnissage échangeur d'anions faible dans 3,5 ml de tampon d' emballage (tableau 1) pour préparer la suspension.
2. Assembler l'extrémité de la colonne capillaire (longueur 50 cm - tube 200 um de diamètre intérieur (ID)) en utilisant un raccord femelle-femelle, une virole et un écrou femelle. Placez un écran 1/16" OD de 1 micron taille des pores à l'intérieur du raccord femelle-femelle (Note:. L'écran utilisé ici doit avoir plus petite taille des pores de la taille des particules du matériau d'emballage pour empêcher la fuite de la matière de la colonne).
3. Emballer le capillaire avec la suspension à l'aide d'une pompe à pression fonctionnant à 4500 psi. (Remarque: Emballez le column jusqu'à ce que le matériau d'emballage est visible à l'entrée de la colonne).
4. Assembler l'autre extrémité de la colonne capillaire, comme décrit au point 1.2.

2. Préparation de l'échantillon

Ce protocole décrit l'application de LERLIC-MS / MS pour analyser les tissus du cerveau humain comme modèle protéome. (Nota: Dans le cas d'utilisation d'autres tissus ou des échantillons protéomiques, il convient d'adapter les procédures de préparation d'échantillon).

1. homogénéisation des tissus:
   une. Laver les tissus cérébraux (50 à 100 mg) avec une solution de tampon phosphate 1x pendant cinq minutes trois fois.
   b. Homogénéiser le tissu à 1: 1: 2,5 perles tissu / métal / tampon d'homogénéisation DDC (tableau 2) de rapport (p / p / v) pendant 5 min à 4 ° C dans des tubes en toute sécurité à verrouillage à une intensité maximale à l' aide d' un homogénéisateur de tissus. (Remarque: le tampon d'homogénéisation de la DDC peut inclure des inhibiteurs de protéase comme indiqué précédemment dans ³⁾
   c. Centrifuger l'homogénat de tissu obtenu from de l'étape précédente, à 10.000 x g, 4 ° C pendant 10 minutes et recueillir le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml.
   ré. Répétez les étapes bc pour les pastilles restantes et combiner les surnageants autant de fois que nécessaire jusqu'à ce qu'aucune pastille est observée. (Remarque: Si vous devez répéter les étapes bc plus de deux fois, déplacer l'échantillon et les perles à un nouveau tube de verrouillage en toute sécurité pour éviter la perte d'échantillon lors de l'étape de centrifugation).
   e. Quantifier la concentration en protéines des homogénats obtenus par dosage acide bicinchoninique (BCA) ^12.
2. Désoxycholate de sodium (DDC) en solution Assistée par digestion tryptique ¹³ de homogénats du cerveau.
   une. Ajouter une concentration finale de ( en utilisant la solution de réserve indiquée dans la solution 5 du tableau 3) à l'homogénat obtenu 10 mM de dithiothréitol (DTT) pour initier la réduction des liaisons disulfure de la protéine.
   b. Incuber l'homogénat pendant 30 min dans un bainpré-réglée à 60 ° C.
   c. Ajouter à l'homogénat à une concentration finale de 20 mM d' iodoacétamide (IAA) en utilisant la solution mère indiqué dans Solution 7 du tableau 4.
   ré. Incuber le broyat contenant IAA à la température ambiante dans l'obscurité pendant 45 min.
   e. Diluer l'homogénat de cerveau de deux plis à l' aide du tampon de dilution (solution à 6 du tableau 3).
   F. Incuber l'échantillon pendant une seconde étape de réduction pendant 30 minutes à 37 ° C.
   g. Ajouter rapport trypsine de qualité séquençage modifié dissous dans la solution 2 du tableau 2 à la protéine-enzyme à 01:50 (p / p).
   h. Digérer l'homogénat avec de la trypsine par incubation pendant une nuit à 30 ° C.
   je. Stopper la digestion enzymatique, le lendemain, en ajoutant 0,5% concentration finale d'acide formique (FA). (Note: L'ajout de FA provoque la précipitation des sels de la DDC dans des conditions acides.)
   j. Vortexer doucement les échantillons contenant de la DDC precipiTates.
   k. Pellet vers le bas les sels DDC par centrifugation des échantillons à 12 000 x g, 4 ° C pendant 10 min.
   l. Récupérer le surnageant et transférer le liquide dans un nouveau tube propre. (Remarque: Prenez soin pendant la pipetage de cette étape pour ne pas remettre en suspension et / ou recueillir des sels de la pastille DDC).
   m. Re-dissoudre le culot dans un tampon DDC de re-dissolution de la DDC (tableau 5) sous vigoureuse agitation par tourbillonnement pendant 1 min.
   n. Répétez les étapes Jl deux fois pour récupérer des peptides précipités et combinent les surnageants. (Note:. Voir Serra et al 2016 ¹³ pour plus de détails sur la DDC assistée en solution protocole de digestion tryptique adapté ici.)
3. Dessalage des échantillons digéré tryptique.
   une. Effectuer le dessalage des échantillons digérés à l'aide d'une cartouche de 1 g C-18. (Note: l'utilisation d'une grande cartouche de volume (5 ml), indépendamment de la quantité de garanties obtenue de protéine de nettoyage appropriée des sels restants de la DDC dans les échantillons avantà injection LC-MS / MS).
   b. Effectuer le conditionnement de la cartouche 1 g C-18 avec 5 ml d'acétonitrile (ACN).
   c. Passer 5 ml de tampon de nettoyage (tableau 6) de la cartouche conditionné 1g C-18 pour éliminer tout solvant organique restant.
   ré. Charger l'échantillon à la cartouche 1 g C-18.
   e. Effectuer 3 - 5 étapes de nettoyage à l'échantillon dans la colonne 1 g C-18 en utilisant 5 ml de tampon de nettoyage chaque étape.
   F. Éluer les peptides dessalée à partir de la cartouche de 1 g C-18 en utilisant 5 ml de tampon d'élution (tableau 7).
   g. Sécher les peptides élues dans un concentrateur sous vide.
   c. Reconstituer l'échantillon séché dans un volume final de 200 ul de tampon d'élution. (Note:. Utilisation vigoureuse et longue (> 10 min) suivie par sonication tourbillonnement subséquente dans un bain de sonication pendant 30 min à complètement remettre en suspension les peptides séchés dans un tampon d'injection)
   ré. Réglez le volume d'injection de l'échantillon pour LERLIC-MS / MS pour analyser entre 1 à 3 ug de protéine.

3. Une dimension LERLIC-MS / MS séparation

1. conditions de chromatographie liquide:
   Phases mobiles:
   A: 0,1% de FA dans l' eau (tableau 8).
   B: 0,1% dans ACN FA (tableau 9)
   Débit: 0,4 pi / min
   Colonne: LAX colonne capillaire (longueur 50 cm - 200 um ID)
   une. Utiliser les éléments suivants 1200 min-gradient: 95% de B pendant 40 min, 95-85% de B pendant 434 min, 85-70% de B pendant 522 min, 70-35% de B pendant 124 min, 35-3% de B pendant 45 min , isocratique à 3% de B pendant 5 min, 3 - 95% de B pendant 7 min et maintenu isocratique à 95% de B pendant 23 min.
   b. Effectuer la séparation des peptides à l' aide du capillaire LAX comme indiqué dans Serra & Gallart-Palau et al. ³ en utilisant une Chromatographie liquide à très haute pression.
2. Configuration du spectromètre de masse:
   une. Configurer les détails de l'événement d'analyse pour effectuer l'acquisition de données betwe alternatifen pleine transformée de Fourier-spectrométrie de masse (FT-MS) et la spectrométrie de masse à transformée de Fourier-tandem (FT-MS / MS) avec les paramètres suivants:
   a.1. mode d'acquisition des données: positif
   a.2 paramètres FT-MS:
   Gamme de masse: 350 - 2000 m / z
   Résolution: 60 000
   Microscans: 1 par spectre
   Commande automatique de gain: 1 × 10 ⁶
   a.3 paramètres FT-MS / MS:
   Mode Fragmentation: haute énergie dissociation collisionnelle (HCD)
   a.4 plage de masse: 150 - 2000 m / z
   a.5 Résolution: 30 000
   a.6 ions Top N: 10
   Microscans: 1 par spectre
   état de charge:> 2+
   largeur d'isolement: 2 Da
   A.7 commande de gain automatique: 1 × 10 ⁶
   b. Effectuer une détection par spectrométrie de masse des peptides , comme indiqué en ³ , en utilisant un spectromètre de masse Orbitrap équipé d'une source d'ions nanoélectrospray travaillant à 1,5 kV.

4. Analyse des données

1. effectuer proteà la recherche de base de données à l'LERLIC-MS / MS obtenu des données en utilisant les paramètres suivants à l' aide d' un logiciel spécifique protéomiques: (Note: Voir ³ pour plus de détails.)
   une. tolérance Ion: 10 ppm
   b. Fragment tolérance d'ions: 0,05 Da
   c. Taux de faux positifs (FDR): 1%
   ré. Base de données: base de données UniProt humaine
   e. modifications fixes: Carbamydomethylation à Cys
   F. modifications variables (le cas échéant par le logiciel): Oxydation (Met), désamidation (Asn et Gln).
2. Caractérisation Confiant et la quantification des produits déamidées dans les données isomériques LERLIC-MS / MS:
   une. base de données Export résultats de la recherche de LERLIC-MS / MS à un logiciel spreedsheet pour analyse.
   b. Trouver et extraire la liste complète des peptides déamidés et leurs homologues non désamidée.
   c. Utilisation de la liste des peptides obtenus comme référence, extraire les chromatogrammes d'ions (Xics) de ces peptides à l'aide d'un logiciel correspond le à 5 ppm de la tolérance de masse. (Remarque:Voir ³ pour plus de détails sur le logiciel utilisé pour l'extraction de Xics.)
   ré. Inspecter visuellement les Xics obtenus pour identifier l'élution à double pic séparé des produits isomériques comme indiqué ^3. (Note: les produits de ces peptides isomères identifiés au niveau MS / MS peut être facilement trouvé guidée par la présence de deux temps de rétention différents dans le résultat de la recherche de base de données.)
   e. quantification relative des produits isomères de chaque site / peptide désamidée doit être effectuée sur la base de l'aire du pic de chaque isomère identifiés dans les Xics obtenus.

Résultats

La désamidation de résidus Gln et Asn est considérée comme une modification de la protéine dégénérative (DPM) impliqués dans plusieurs maladies chroniques et mortelles ^14. Il a été démontré que cette PTM peut prédire les états demi-vie et d'anticorps et de dégradation d' autres molécules dans le corps humain et milieux biologiques similaires ^{1, 15.} L'importance de désamidation...

Discussion

Dans cette vidéo-article , nous présentons un protocole étape par étape de LERLIC-MS / MS ^3, un procédé pour effectuer une caractérisation en profondeur et de déterminer avec précision l'étendue de la désamidation de la protéine et des procédés enzymatiques impliquées sur cette modification de la protéine. LERLIC-MS / MS est basée sur l'utilisation d'une longue longueur (50 cm) LAX selon le principe de chromatographie d'interaction de répulsion électrostatique h...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material)	PolyLC Inc.	Special order
Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID	PolyLC Inc.	Special order
PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length	SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia	620050
Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Female nut for microferule	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microferule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Pressure Bomb NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC system	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Safe-lock tubes	Eppendorf	T9661-1000EA
Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile.	Next Advance	SSB14B
Table-top centrifuge	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg	Waters	WAT020805
Vacumm concentrator	Eppendorf	Concentrator Plus System
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
Orbitrap Elite mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray	Michrom-Bruker Inc.	TCSI-SS2
Incubator INCUCELL	MMM Group	INCUCELL111
Sequencing-grade modified trypsin	Promega	V5111
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11836170001 (ROCHE)
Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A1542
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	i6125
Formic acid	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Acetonitrile HPLC grade	Sigma-Aldrich	675415
Isopropanol HPLC grade	Sigma-Aldrich	675431
Water HPLC grade	Sigma-Aldrich	14263