JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذا العمل على أساس مضان المجهري طريقة لدراسة التصاق الصفائح الدموية، ونشر، وإفراز تحت التدفق. هذه منصة تنوعا تمكن من التحقيق في وظيفة الصفائح الدموية للبحث الميكانيكي على تخثر الدم والارقاء.

Abstract

الصفائح الدموية هي اللاعبين الأساسيين في الارقاء، وتشكيل الجلطات لختم انتهاكات الأوعية الدموية. كما أنها تشارك في تخثر الدم، وتشكيل الجلطات التي تغلق الأوعية الدموية وجرح الأجهزة، مع عواقب تهدد الحياة. هذا يحفز البحث العلمي على وظيفة الصفائح الدموية وتطوير أساليب لتتبع العمليات البيولوجية الخلية كما تحدث في ظل ظروف التدفق.

وهناك مجموعة متنوعة من نماذج التدفق المتاحة لدراسة التصاق الصفائح الدموية والتجميع، وهما الظواهر الرئيسية في البيولوجيا الصفائح الدموية. يصف هذا العمل طريقة لدراسة التحبيب الصفائح الدموية في الوقت الحقيقي تحت تدفق أثناء التنشيط. الأسلوب يجعل من استخدام غرفة تدفق إلى جانب إعداد مضخة حقنة التي يتم وضعها تحت حقل واسع، مقلوب، ليد المستندة إلى مضان المجهر. الإعداد الموصوفة هنا يسمح للإثارة في وقت واحد من فلوروفوريس متعددة التي يتم تسليمها من قبل الأجسام المضادة فلورزنتلي المسمى أو فلوريسكصبغات. بعد التجارب التصوير الخلية الحية، ونظارات غطاء يمكن معالجتها بشكل إضافي وتحليلها باستخدام المجهر ثابت ( أي المجهري متحد البؤر أو المجهر الإلكتروني المسح).

Introduction

الصفائح الدموية هي الخلايا الأنوية التي تنتشر في مجرى الدم. وتتمثل مهمتها الرئيسية في سد الخروقات الوعائية في مواقع الإصابة ولمنع فقدان الدم. في هذه المواقع من الإصابة، تصبح ألياف الكولاجين تحت البطانية يتعرض ويغطيها لاحقا بروتين مولتيمريك، عامل فون ويلبراند (فوف). فوف يتفاعل مع الصفائح الدموية في التداول في الآلية التي تعتمد على بروتين سكري IPa- إيكس-V معقدة على سطح الخلية 1 ، مما يبطئ سرعة الصفائح الدموية. وهذا مهم بشكل خاص في معدلات القص العالية. الصفيحات في وقت لاحق تخضع للتغيرات المورفولوجية في حين تلقي تنشيط نبضات من الكولاجين. وهذا يؤدي إلى انتشار لا رجعة فيه وفي نهاية المطاف إلى تراكم الصفائح الدموية. كل من العمليات تعتمد على إفراز محتويات الحبيبية لتسهيل الصفائح الدموية الصفائح الدموية الحديث المتبادل. من بين أمور أخرى، حبيبات α الصفائح الدموية تحتوي على الفيبرينوجين وفوف لمساعدة التصاق الصفائح الدموية وجسرالصفائح الدموية معا بطريقة تعتمد على إنتغرين. تحتوي حبيبات كثيفة الصفيحات على مركبات غير عضوية 2 ، بما في ذلك الكالسيوم والأدينوسين ثنائي الفوسفات (أدب)، مما يساعد على تعزيز تفعيل الصفائح الدموية. وعلاوة على ذلك، الصفائح الدموية تحتوي على وسطاء من (حساسية) التهاب 3 ، تكملة السيطرة على البروتينات 4 ، وعوامل الأوعية الدموية 5 ، 6 ، مما يثير تساؤلات حول ما إذا كان وكيف يتم الإفراج عن هذه المحتويات تفاضليا في ظل ظروف مختلفة.

منذ 1980s، وكانت دراسة وظيفة الصفائح الدموية في نماذج التدفق قيمة للتحقيق في آليات الجلطات 7 . ومنذ ذلك الحين، أحرز الكثير من التقدم التقني، وتطورت حاليا نماذج التدفق التي تشمل تشكيل الليفين لفحص إمكانات مرقئ من مركزات الصفائح الدموية العلاجية السابقين الجسم الحي 8 أوالتحقيق في تأثير الاضطرابات في معدلات القص على التشكل الخثرة 9 . قد تكون الاختلافات في الآليات الجزيئية والخلية والبيولوجية التي تدفع التصاق مستقر وتشكيل خثرة الفسيولوجية (الارقاء) مقابل تشكيل خثرة المرضية (تخثر) دقيقة جدا وتحفيز تطوير نماذج التدفق التي تسمح لتصور في الوقت الحقيقي من هذه الخلايا الخلوية العمليات.

مثال على العملية التي من شأنها أن يكون هذا الإعداد قيمة هو (إعادة) توزيع متعدد الفوسفات داخل الخلايا وتجنيد عوامل التخثر للكشف عن تأثير تعتمد على الوقت أن هذا على البنية التحتية الفبرين 10 . وغالبا ما تقتصر الدراسات على تحليلات نقطة النهاية. والهدف الرئيسي من الطريقة الموصوفة هو تمكين التحقيق البصري في الوقت الحقيقي من العمليات تحت الخلايا الحيوية التي تحدث خلال تفعيل الصفائح الدموية تحت التدفق.

Protocol

وافقت اللجنة الأخلاقية الطبية المحلية للمركز الطبي الجامعي أوترخت رسم الدم لأغراض البحث خارج الجسم الحي ، بما في ذلك تلك الدراسة.

1. إعداد الحل

  1. إعداد 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينيثان سلفونيك حمض (هيبيس) العازلة تيرود عن طريق إذابة 10 ملي هيبيس، 0.5 ملي نا 2 هبو 4 ، 145 ملي كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم مغسو 4 ، و 5.55 ملم D- الجلوكوز في الماء المقطر.
    1. جعل اثنين من المتغيرات من المخزن المؤقت: تعيين مستويات الرقم الهيدروجيني في 6.5 و 7.4 على التوالي. جعل العازلة جديدة لكل يوم من التجارب. الملحق مع 10 نانوغرام / مل بروستاسيكلين حيث المشار إليها.
  2. إعداد تريس مخزنة المالحة (تبس) عن طريق إذابة 50 ملي تريس و 150 ملي كلوريد الصوديوم في الماء المقطر وضبط درجة الحموضة إلى 9.0.
  3. إعداد حمض سيترات سكر العنب (أسد) عن طريق إذابة 85 ملي ثلاثي سيترات الصوديوم، 71 ملي حمض الستريك، و 111 ملي D- الجلوكوز في ديسالمياه الحارة.
  4. إعداد حل تثبيتي عن طريق إضافة 2٪ (الخامس / الخامس) بارافورمالدهيد (بفا) إلى العازلة هيبيس تيرود، ودرجة الحموضة 7.4. الحرارة إلى حل (50 - 70 درجة مئوية) وتعيين درجة الحموضة إلى 7.4. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  5. إعداد عازلة عازلة عن طريق إذابة 1٪ (م / ت) ألبومين المصل البشري (هسا) في هيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 7.4
  6. جعل محلول كحول البولي فينيل بإضافة 4.8 غرام من الكحول البولي فينيل إلى 12 غرام من الجلسرين وتخلط جيدا. إضافة 12 مل من الماء المقطر وتركها على المدورة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
    1. إضافة 24 مل من 0.2 M تريس-هكل، ودرجة الحموضة 8.5. الحرارة إلى 50 درجة مئوية في حين خلط لمدة 30 دقيقة. إضافة 1.25 غرام من 1.4-ديازابيسكلو [2.2.2] أوكتان (دابكو) وتخلط جيدا. أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. قسامة طاف (1 مل يكفي لمدة 15-20 الشرائح) وتخزينها في -20 درجة مئوية. استخدام أليكوتس مرة واحدة.

2. غطاء إعداد الزجاج

  1. إزالة الشحومنظارات (25 × 50 مم 2 ) عن طريق احتضان بين عشية وضحاها في حامض الكروموسولفوريك مخفف. شطف النظارات غطاء بالماء المقطر وتجفيفها بين عشية وضحاها في 60 درجة مئوية في الفرن.
  2. التمسك شريط من فيلم البارافين (10 × 15 سم 2 ) على رأس مقاعد البدلاء المختبر مع قطرة من الماء وإزالة الهواء عن طريق تمهيد فيلم البارافين. ماصة قطرات 80 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل فوف أو 100 ميكروغرام / مل الفيبرينوجين على فيلم البارافين. وضع النظارات على قطرات. سوف ينتشر حل البروتين بين السطوح لتغطية الجانب الخلفي كله من الزجاج. احتضان لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة (رت).
  3. إزالة فيلم البارافين ومنع نظارات الغطاء عن طريق وضعها، مع الجانب المغلفة حتى في لوحة 4-جيدا مع عرقلة العازلة. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. كعنصر تحكم، منع زجاج الغطاء الذي لم مغلفة مع فوف أو الفيبرينوجين.

3. إعداد البلازما الغنية بالصفائح الدموية (برب)

  1. جمع سيتراتيد الدم الكامل (التركيز النهائي: 0.32٪ سيترات الصوديوم (M / V)) عن طريق الوريد.
  2. الطرد المركزي الدم لمدة 15 دقيقة في 160 x ج و رت دون الفرامل. جمع طاف ( أي، برب) مع ماصة باستور البلاستيك.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي، ويمكن ملاحظة ثلاث طبقات (من أعلى إلى أسفل): برب، وخلايا الدم البيضاء، وخلايا الدم الحمراء. تأكد من عدم تضمين الخلايا البيضاء والحمراء. عادة، يمكن جمع 3 مل من برب بعد الطرد المركزي من أنبوب الدم 9 مل.
  3. تابع القسم 4 إذا تم إجراء التجربة باستخدام الصفائح الدموية التي يتم غسلها. إذا كان المطلوب هو برب، فاستمر في الخطوة التالية.
  4. بعد جمع برب، الطرد المركزي ما تبقى من الدم (التي تحتوي على بيليه الخلية الحمراء) مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 2000 x ج دون الفرامل. جمع طاف تحتوي على البلازما فقيرة الصفائح الدموية (بب).
    ملاحظة: عادة، 2 مل يمكن جمعها بعد هذه الخطوة الطرد المركزي الثانية.
  5. عد عدد الصفحة pوالبرازيليين في برب على محلل الخلية وتمييع ذلك مع بب (الخطوة 3.4) إلى تركيز 150،000 الصفائح الدموية / ميكرولتر.
    ملاحظة: الحجم الكلي لل برب المخفف يعتمد على عدد الصفائح الدموية للمتبرع. وتختلف التعدادات الصفائحية اختلافا كبيرا بين المانحين، ويتطلب التخفيف من حدة الصفيحات تقييمها على أساس فردي. وتعتبر التعدادات الصفائح الدموية طبيعية في حدود 150،000 و 450،000 صفائح / ميكرولتر.
  6. تابع القسم 5.

4. إعداد الصفائح الدموية غسلها

  1. تحديد متوسط ​​حجم الصفائح الدموية (مبف) في برب باستخدام محلل الخلية.
    ملاحظة: هذا هو مؤشر على الصفائح الدموية قبل تفعيل 11 . و مبف العادي لاستعادة الصفائح الدموية هو 7.5-11.5 فل 11 . يجب أن لا يزيد مبف بأكثر من 1.5 فل خلال إجراء الغسيل الصفائح الدموية.
  2. إضافة 1/10 حجم أسد إلى برب لمنع الصفائح الدموية قبل تفعيل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 400 x ج و رت دون الفرامل. إزالة سو طاف وإعادة تعليق بيليه بعناية في هيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 6.5، إلى حجم الأصلي من برب.
  3. ذوبان الجليد قسامة من بروستاسيكلين بإضافة تبس إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل. يبقيه على الجليد.
  4. لمنع تفعيل الصفائح الدموية، إضافة بروستاسيكلين في تركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل إلى الصفائح إعادة تعليق وعلى الفور الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 400 x ج و رت دون فرامل. إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه بعناية في هيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 7.4.
  5. عد عدد الصفائح الدموية (الخطوة 3.5) وتحديد التغيير في مبف (الخطوة 4.1) (مبف لا ينبغي أن تتغير أكثر من 1.5 فل).
  6. ضبط عدد الصفائح الدموية مع العازلة هيبيس تيرود، ودرجة الحموضة 7.4، إلى تركيز 150،000 الصفائح الدموية / ميكرولتر. ترك الصفائح الدموية لاسترداد لمدة 30 دقيقة في رت قبل التجارب. استخدام الصفائح الدموية غسلها للتجارب في غضون 4 ساعات بعد العزلة.

5. تدفق غرفة الجمعية

سس = "jove_content"> ملاحظة: هذه التجارب الاستفادة من غرفة تدفق المتقدمة في المنزل 12 . ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من غرف التدفق المنتجة تجاريا، طالما أنها يمكن أن تعقد غطاء الزجاج، والتي تفضيلي قابل للإزالة لمزيد من التحليلات. غرفة التدفق المستخدمة للتجارب وصفها مصنوع من بولي (ميثيل ميثاكريلات) لتتناسب بدقة المجهر إدراج المرحلة. أنه يحتوي على مدخل ومخرج ( الشكل 1A - C ، 1، 2)، وكذلك اتصال فراغ ( الشكل 1A و C ؛ 3). يتم وضع ورقة سيليكون مخصصة ( الشكل 1A و D ؛ 4) على القمة. اثنين من المقطعين شكل قنوات فراغ ( الشكل 1A و D ؛ 5) لإرفاق غطاء الزجاج ( الشكل 1A ؛ 6) بإحكام إلى الغرفة. وهناك أشكال قطع المركزي قناة تدفق ( الشكل 1A و D ؛ 7؛ 2.0 مم العرض و 0.125 مم الارتفاع). يتم توصيل مدخل ومخرج لقناة التدفق، ويتم توصيل فراغ لقناة فراغ.

  1. تغطية الجزء العلوي من غرفة تدفق مع الماء المقطر ووضع ورقة سيليكون مخصصة مع الجانب السلس لأسفل على الماء. تعويم ورقة في الموقف عن طريق إزالة المياه الزائدة مع الحفاظ على ورقة في الموقف.
    ملاحظة: هذا سيليكون ورقة هو re-- صالحة للاستعمال (سيليكون هو معروف لخصائص خاملة)؛ وعموما، لم يلاحظ الصفائح الدموية أن نعلق عليه. يمكن تنظيف الأوراق مع المنظفات وإعادة استخدامها حتى تصبح المواد تالفة ( أي تمزيق، وخاصة في المنطقة بين القنوات). عموما، يمكن استخدام ورقة لمدة 20 يوما مع تجارب متعددة في اليوم الواحد.
  2. احتضان غرفة تدفق لمدة 1 ساعة عند 60 درجة مئوية لتتبخر المياه المتبقية لالتزام بقوة ورقة سيليكون إلى غرفة التدفق.
  3. مع ماصة باستور البلاستيك، إضافة قطرة منهيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 7.4، على قناة التدفق. وضع غطاء الزجاج (انظر القسم 2) مع الجانب المغلفة أسفل، على قناة التدفق. إرفاق مضخة فراغ إلى اتصال فراغ ( أرقام 1A و C ؛ 3). تطبيق ~ 10 كيلو باسكال الضغط.

6. قبل تلطيخ الصفائح الدموية وإعداد الأجسام المضادة

  1. تلطيخ الصفائح الدموية
    1. احتضان الصفائح الدموية غسلها مع 10 ميكروغرام / مل دابي لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. لغسل دابي غير منضم ومنع تفعيل الصفائح الدموية، إضافة بروستاسيكلين في تركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل وعلى الفور الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 400 x ج و رت دون فرامل.
    2. إعادة بيليه الصفائح الدموية في هيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 7.4، إلى تركيز الصفائح الدموية من 150،000 الصفائح الدموية / ميكرولتر.
  2. إعداد الأجسام المضادة
    1. مزيج البيوتين المسمى الأجسام المضادة مع اليكسا المسمى بكتيرياتافيدين في نسبة المولي من 1: 1. احتضان لمدة لا تقل عن 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام (الخطوة 7.6).
      ملاحظة: بيوتين كفاءة وسم يمكن أن تختلف بين دفعات مختلفة. وينبغي أن يكون هناك مشاكل مع التصور من الجزيئات المستهدفة، وينبغي إجراء تجارب السيطرة لتأكيد بيوتينيلاتيون ناجحة، وكذلك خصائص ملزم الهدف من الأجسام المضادة البيروكسيديز محددة.

7. الإرواء

  1. بدء المجهر مضان، فضلا عن البرمجيات المجهر. استخدام إعدادات المجهر المدرجة في الجدول 1 .
    ملاحظة: بدء المجهر وتسجيل إعدادات لتصور الخلية الحية وتسجيل الصفائح الدموية والأجسام المضادة المختارة فلورزنتلي المسمى و / أو الأصباغ عن طريق تحميل تجربة مناسبة في برنامج المجهر. إجراء تجارب تدفق في رت.
  2. منع أنابيب مدخل عن طريق ربط حقنة 10 مل إلى الأنابيب و الشفط 1٪ هسا بلوكينغ العازلة في أنابيب مدخل. احتضان لمدة 15 دقيقة في رت. شطف أنابيب مدخل عن طريق الشفط هيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 7.4، في أنابيب مدخل.
  3. ربط أنابيب مدخل المحظورة وأنابيب مخرج غير المعالجة، على حد سواء مع قطرها 1.02 مم وطول ~ 20-30 سم إلى مدخل ومخرج من الغرفة. ربط حقنة 10 مل (أو أقل حجم لمزيد من الدقة) إلى أنابيب منفذ. السلطة على مضخة حقنة.
    ملاحظة: قطر الحقنة، في تركيبة مع معدل تدفق تعيين على المضخة، وتحديد معدل التدفق الحجمي. جنبا إلى جنب مع مساحة سطح قناة التدفق، ويمكن حساب معدل القص وفقا للصيغة 13 أدناه. وبالتالي، فمن الممكن لمعالجة معدل القص عن طريق تغيير معدل تدفق مضخة الحقنة أو تغيير أبعاد قناة التدفق. معدل القص من 800-1،600 ثانية -1 نماذج عادة لتدفق الدم الشرياني، في حين أن 25 - 100 S-1 نماذج للدم الوريديتدفق. لهذا الإعداد، معدل تدفق 7.5 ميكرولتر / دقيقة النتائج في معدل القص من 25 ثانية -1 .
    معدل القص = 6Q / h 2 w في s -1
    حيث: Q = معدل التدفق الحجمي (مل / s)، h = ارتفاع القناة (سم) (0.0125 سم، وهذا هو سمك ورقة سيليكون)، w = قناة العرض (سم) (0.2 سم في هذه الغرفة).
  4. وضع قطرة من زيت الغمر على هدف 100X (مجموع التضخيم من 1000X) وتركيب الغرفة على المجهر مع سطح الزجاج إلى أسفل.
  5. وضع أنابيب مدخل إلى أنبوب يحتوي على العازلة هيبيس تيرود، ودرجة الحموضة 7.4. سحب يدويا المكبس من حقنة متصلة أنابيب مخرج وسحب الحل من خلال غرفة لإزالة الهواء من النظام. وضع حقنة في مضخة حقنة ( الشكل 1B و C ؛ 8) وتشغيل المضخة لفترة وجيزة لتشديد المكبس وضمان تدفق مستقر.
  6. إضافة الأجسام المضادة و / أو الأصباغ إلى تعليق الصفائح الدموية أو برب، بعنايةمزيج مع ماصة بلاستيكية، ونقل الخليط إلى أنبوب 1.5 مل.
    ملاحظة: لنضح نموذجي 30 دقيقة في معدل القص 25 S-1 (7.5 ميكرولتر / دقيقة)، هناك حاجة إلى 225 ميكرولتر على الأقل من تعليق الصفائح الدموية. وترد في الجدول 2 الأجسام المضادة المستخدمة في النتائج التمثيلية.
  7. نقل أنابيب مدخل، في حين الضغط، من العازلة هيبيس تيرود، ودرجة الحموضة 7.4، إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي إما برب أو الصفائح الدموية غسلها والأجسام المضادة و / أو الأصباغ ( الشكل 1B و C ؛ 9).
    ملاحظة: من المهم أن، عند نقل الأنبوب، وتقلص الأنابيب (الضغط خارج الهواء) لمنع الهواء من دخول الأنابيب. فمن الممكن لعلاج الصفائح الدموية الملتصقة مع مجموعة متنوعة من الكواشف في خطوة لاحقة عن طريق تحريك أنابيب مدخل إلى أنبوب آخر بطريقة مماثلة. وترد في الجدول 3 قائمة بالكواشف المفيدة المحتملة.
  8. حدد "فيسواليزاتيو الحيةn "في البرنامج، ركز المجهر على سطح غطاء الزجاج المطلي، وبدء المضخة بمعدل قص 1،600 ثانية -1 (484 ميكرولتر / دقيقة) حتى تصل الصفائح الدموية إلى غرفة التدفق، وفي هذه اللحظة، تقليل معدل القص مرة أخرى إلى 25 s-1 عن طريق تغيير إعدادات مضخة حقنة إلى معدل تدفق 7.5 ميكرولتر / دقيقة.
  9. مراقبة سطح الجانب المغلفة من غطاء الزجاج، والانتظار حتى يبدأ الصفائح الدموية الأولى على الانضمام، والتركيز المجهر على هذه الصفائح الدموية، وبدء التسجيل عن طريق الشروع في التجربة في البرنامج. انظر الجدول 1 للتعرف على إعدادات التسجيل المستخدمة هنا.
  10. اتبع التسجيل المباشر بصريا. بعد 30 دقيقة، ووقف مضخة حقنة.
    ملاحظة: تأكد من أن الصفائح الدموية البقاء في التركيز خلال مسار التجربة. عادة، 20-30 الصفائح الدموية تعلق في مجال الرؤية في التكبير من 1000X. وهذا هو حوالي 2،000-3،000 الصفائح الدموية في قناة التدفق كله.
  11. التثبيت باستخدامغرفة التدفق (اختياري).
    1. عندما توقف تدفق بعد توقف مضخة حقنة، نقل أنابيب مدخل (الهواء-- مجانا) إلى الحل تثبيتي. إعادة تشغيل المضخة وتدفق العازلة التثبيت من خلال القناة لمدة لا تقل عن 10 دقيقة في نفس معدل التدفق كما ذكر في الخطوة 7.8.
  12. إزالة غرفة من المجهر، وتنظيف النفط الغمر من الزجاج، وقطع الفراغ، وإزالة بعناية الزجاج غطاء من الغرفة مع إبرة 18 G.
    ملاحظة: منع الزجاج غطاء من كسر وإلحاق ورقة السيليكون.
  13. وضع الشريحة غطاء (مع الخلايا الموجهة صعودا) في لوحة 4-جيدا على رأس الأنسجة، قبل رطب بالماء المقطر.
    ملاحظة: هذا يمنع الزجاج الغطاء من التمسك سطح البئر ويمنع التجفيف.
  14. ماصة 750 ميكرولتر من الحل تثبيتي على رأس الزجاج الغطاء واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. في حالة لا يمكن تحليل العينات مباشرة،تخزينها في 0.5٪ بفا (المخفف من قبل هيبيس تيرود العازلة، ودرجة الحموضة 7.4) في 4 درجات مئوية لضمان تثبيت مستقرة. انتقل إلى القسم 8 لمعالجة الزجاج غطاء للتصوير.
  15. بعد الاستخدام، شطف الغرفة، أنابيب، ورقة مع الماء المقطر واحتضان بين عشية وضحاها في محلول المنظفات. قبل إعادة استخدام الغرفة وغيرها من المكونات، وشطف بالماء المقطر.
  16. حفظ المجهر ملفات البيانات الخام التي تحتوي على كافة البيانات الوصفية. عند الحاجة، تصدير الأفلام إلى. موف، h.264 مضغوط، أو. أفي غير مضغوط. حفظ إطارات منفصلة كملفات جبيغ أو تيف.

8. إعداد عينة لالمضاد المجهري متحد البؤر

  1. نقل النظارات غطاء إلى لوحات جديدة 4 جيدا وشطف 5 مرات مع 3 مل من العازلة هيبيس تيرود، ودرجة الحموضة 7.4. إضافة 3 مل / بئر من عرقلة الحاضنة واحتضان لمدة 1 ساعة في رت.
  2. إزالة المخزن المؤقت حظر؛ إضافة 3 مل / جيدا من 0.15٪ الجلايسين (M / V) في هيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 7.4. واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  3. إزالة محلول الجلايسين وغسل 5 مرات في 3 مل / جيدا من عرقلة العازلة. اختياريا، إضافة فلورفور مترافق الأجسام المضادة المخفف في عرقلة العازلة لالتلطيخ إضافية. احتضان لمدة 1 ساعة في رت في الظلام.
  4. يغسل 5 مرات مع عرقلة عازلة و 2 مرات مع الماء المقطر. تجفيف الزجاج عن طريق إزالة السائل الزائد مع الأنسجة (من حواف الداخل)، دون لمس الخلايا.
  5. ماصة 60 ميكرولتر من محلول الكحول البولي فينيل على شريحة المجهر. وضع الزجاج غطاء، مع الخلايا أسفل، على رأس من قطرة والسماح للكحول البولي فينيل تنتشر بين السطوح اثنين. احتضان بين عشية وضحاها في رت في الظلام.
  6. تحليل الخلايا التي المجهر متحد البؤر 14 .
  7. حفظ ملفات البيانات الخام من البيانات المكدس المسجلة التي تحتوي على كافة البيانات الوصفية. عند الحاجة، معالجة ملفات البيانات الخام في موف، h.264 مضغوط، أو .AVI الملفات غير المضغوطة. حفظ مكدسات منفصلة كملفات جبيغ أو تيف.

النتائج

ويبين الشكل 1 صور غرفة تدفق والإعداد التجريبي. موقف وأبعاد ورقة السيليكون. و وصلات الأنابيب. الشكل 2 يوفر تفاصيل عن أبعاد غرفة التدفق. الشكل 3 والفيلم 1 تظهر سلسلة زمنية من الصور من التصاق الصف?...

Discussion

في جميع أنحاء العالم، والتجلط هو السبب الرئيسي للوفاة والمراضة، والصفائح الدموية تلعب دورا محوريا في تطورها. يصف هذا العمل طريقة للتصوير الخلية الحية من التحبيب الصفائح الدموية تحت التدفق. ويفترض عموما أنه عندما يتم تنشيط الصفائح الدموية، يتم تحرير جميع محتويات ال?...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

(سم) تعترف بالدعم المالي المقدم من المنظمة الدولية للمرضى لنواقص المانع C1 (هاي) و ستيكتينغ فريندن فان هيت ومك أوترشت ومؤسسة لاندستينر لأبحاث نقل الدم (لسبر).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) VWR441476L
Na2HPO4SigmaS-0876
NaClSigma31434
KClSigma31248
MgSO4Merck KGaA1.05886
D-glucoseMerck KGaA1.04074
Prostacyclin Cayman Chemical18220
Tri-sodium citrateMerck KGaA1.06448
Citric acid Merck KGaA1.00244
Cover glassesMenzel-GläserBBAD02400500#A24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness.
Chromosulfuric acid (2% CrO3)Riedel de Haen07404CAS [65272-70-0].
Von Willebrand factor (VWF)in-house purified
FibrinogenEnzyme Research LaboratoriesFIB3L
4 well dish, non-treatedThermo Scientific267061
Human Serum Albumin Fraction VHaem Technologies Inc.823022
Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2%Greiner Bio-One455322
Cell analyser Abbott DiagnosticsCELL-DYN hematology analyzer
ParaformaldehydeSigma30525-89-4 
Syringe pumpHarvard Apparatus, Holliston, MAHarvard apparatus 22
10 mL syringe with 14.5 mm diameterBD biosciences305959Luer-Lok syringe
Anti-CD63-biotin Abcam AB134331
Anti-CD62P-biotin R&D SystemsDy137
4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)Polysciences Inc. 9224
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugateThermo ScientificS11223 
Immersion oilZeiss444963-0000-000
Detergent solutionUnilever, Biotex
GlycineSigma56-40-6 
Polyvinyl alcoholSigma9002-89-5Mowiol 40-88.
Tris hydrochlorideSigma1185-53-1 
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)Sigma280-57-9
Sheep Anti-hVWF pAbAbcam AB9378
Alexa fluor 488-NHSThermo ScientificA20000
GlycerolSigma-Aldrich15523-1L-R
Parafinn filmBemisPM-9964 in. x 125 ft. Roll.
Silicone sheet non-reinforcedNagorNA 500-1200 mm x 150 mm x 0.125 mm.
Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channelsin-house madeMade of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1)
1.5 mL tubesEppendorf AGT9661-1000AE
Fluorescent microscopeZeiss Observer Z1 Equiped with LED excitation lights.
Microscope softwareZeiss ZEN 2blue edition
18 G needle (18 G x 1 1/2")BD biosciences305196
NaClRiedel de Haen31248375
TrisRoche10708976
Plastic pasteur pipetVWR612-1681 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL.
Silicone tubingVWR228-0656Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm.
Microscope slidesThermo ScientificABAA000001##12E76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end.

References

  1. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  2. Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
  3. May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
  4. Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
  5. Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
  6. Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
  7. Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
  8. Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
  9. Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
  10. Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
  11. Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
  12. Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
  13. Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
  14. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
  15. Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
  16. Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
  17. Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
  18. Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
  19. Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

125

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved