Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo

Resumo

Este trabalho descreve um método baseado em microscopia de fluorescência para o estudo da adesão, disseminação e secreção de plaquetas sob fluxo. Esta plataforma versátil permite a investigação da função plaquetária para pesquisas mecanicistas sobre trombose e hemostasia.

Resumo

As plaquetas são jogadores essenciais na hemostasia, a formação de trombos para selar as violações vasculares. Eles também estão envolvidos em trombose, a formação de trombos que obstruem a vasculatura e ferem órgãos, com conseqüências que ameaçam a vida. Isso motiva a pesquisa científica sobre a função plaquetária e o desenvolvimento de métodos para rastrear processos biológicos celulares, pois ocorrem em condições de fluxo.

Uma variedade de modelos de fluxo estão disponíveis para o estudo da adesão e agregação de plaquetas, dois fenômenos-chave na biologia das plaquetas. Este trabalho descreve um método para estudar a degranulação de plaquetas em tempo real sob fluxo durante a ativação. O método faz uso de uma câmara de fluxo acoplada a uma configuração de bomba de seringa que é colocada sob um microscópio de fluorescência à base de LED de campo largo e invertido. A configuração descrita aqui permite a excitação simultânea de múltiplos fluoróforos que são administrados por anticorpos marcados com fluorescência ou fluorescentesCorantes. Após experiências de imagem de células vivas, os óculos de cobertura podem ser processados ​​e analisados ​​usando microscopia estática (por exemplo , microscopia confocal ou microscopia eletrônica de varredura).

Introdução

As plaquetas são células anucleadas que circulam na corrente sanguínea. Sua principal função é selar as rupturas vasculares em locais de lesão e prevenir a perda de sangue. Nesses locais de lesão, as fibras subendoteliais de colágeno tornam-se expostas e são posteriormente cobertas pela proteína multimérica, o fator von Willebrand (VWF). O VWF interage com as plaquetas em circulação em um mecanismo que depende do complexo de glicoproteína Ibα-IX-V na superfície celular ¹ , diminuindo a velocidade das plaquetas. Isto é particularmente importante a altas taxas de cisalhamento. As plaquetas subseqüentemente sofrem alterações morfológicas enquanto recebem impulsos ativadores do colágeno. Isso leva a disseminação irreversível e, eventualmente, a agregação de plaquetas. Ambos os processos dependem da secreção de conteúdos de grânulos para facilitar a interferência plaquetária-plaquetas. Entre outros, os grânulos α plaquetários contêm fibrinogênio e VWF para auxiliar a adesão plaquetária e a ponteAs plaquetas juntas de uma maneira dependente da integrina. Os grânulos densos de plaquetas contêm compostos inorgânicos ² , incluindo o difosfato de adenosina e cálcio (ADP), que ajudam a reforçar a ativação plaquetar. Além disso, as plaquetas contêm mediadores da inflamação (alérgica) ³ , proteínas de controle do complemento ⁴ e fatores de angiogênese ^{5 , 6} , aumentando as questões de se e como esses conteúdos são diferencialmente liberados em condições variáveis.

Desde a década de 1980, o estudo da função plaquetária em modelos de fluxo tem sido valioso para a investigação de mecanismos trombóticos ⁷ . Desde então, muitos progressos técnicos foram feitos e os modelos de fluxo que incluem a formação de fibrina são atualmente desenvolvidos para testar o potencial hemostático de concentrados de plaquetas terapêuticas ex vivo ⁸ ou paraInvestigar a influência de distúrbios nas taxas de cisalhamento na morfologia do trombo ⁹ . As diferenças nos mecanismos moleculares e biológicos celulares que conduzem a adesão estável e formação de trombo fisiológico (hemostasia) versus formação de trombo patológico (trombose) podem ser muito sutis e motivar o desenvolvimento de modelos de fluxo que permitam a visualização em tempo real desses sub-celulares Processos.

Um exemplo de um processo para o qual essa configuração seria valiosa é a (re) distribuição de polifosfato intracelular e o recrutamento de fatores de coagulação para descobrir o impacto dependente do tempo que isso tem na ultraestrutura da fibrina ¹⁰ . Os estudos geralmente são limitados a análises de ponto final. O objetivo principal do método descrito é habilitar a pesquisa visual em tempo real de processos subcelulares dinâmicos que ocorrem durante a ativação plaquetária sob fluxo.

Protocolo

O Comitê de Ética Médica local do Centro Médico Universitário de Utrecht aprovou o desenho de sangue para fins de pesquisa ex vivo , incluindo aqueles deste estudo.

1. Preparação da solução

1. Prepare um tampão de Tyrode do ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico (HEPES) por dissolução de HEPES 10 mM, Na2HPO4 0,5 mM, NaCl 145 mM, KCl 5 mM, MgSO4 1 mM e D- Glicose em água destilada.
   1. Faça duas variantes do buffer: ajuste os níveis de pH em 6,5 e em 7,4, respectivamente. Faça um novo buffer para cada dia de experimentos. Suplementar com prostaciclina a 10 ng / mL quando indicado.
2. Prepare solução salina tamisada com TRIS (TBS) dissolvendo Tris 50 mM e NaCl 150 mM em água destilada e ajuste o pH para 9,0.
3. Prepare o citrato de ácido dextrose (ACD) dissolvendo citrato de tri-sódio 85 mM, ácido cítrico 71 mM e D-glucose 111 mM nissoÁgua cultivada.
4. Prepare uma solução fixadora adicionando 2% (v / v) de paraformaldeído (PFA) ao tampão HEPES Tyrode, pH 7,4. Aquecer para dissolver (50 - 70 ° C) e ajustar o pH para 7,4. Alíquota e armazene a -20 ° C. Descongelar a 37 ° C antes de usar.
5. Prepare o tampão de bloqueio dissolvendo albumina de soro humano (HSA) a 1% (m / v) no tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4
6. Faça uma solução de álcool polivinílico adicionando 4,8 g de álcool polivinílico a 12 g de glicerol e misture bem. Adicione 12 ml de água destilada e deixe-o em um rotador à temperatura ambiente durante a noite.
   1. Adicionar 24 mL de Tris-HCL 0,2 M, pH 8,5. Aquecer até 50 ° C enquanto se mistura durante 30 min. Adicione 1,25 g de 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO) e misture bem. Centrifugar a 1.500 xg por 5 min. Alíquota do sobrenadante (1 mL é suficiente para lâminas 15-20) e armazene a -20 ° C. Use as alíquotas uma vez.

2. Preparação do vidro da tampa

1. Descarte a tampaÓculos (25 x 50 mm ² ) por incubação durante a noite em ácido cromossulfúrico não diluído. Enxaguar os óculos de cobertura com água destilada e secá-los durante a noite a 60 ° C no forno.
2. Aderir a uma tira de uma película de parafina (10 x 15 cm ² ) em cima de um banco de laboratório com uma gota de água e remover o ar alisando a película de parafina. Pipetar 80 μL de gotas de 10 μg / mL de VWF ou 100 μg / mL de fibrinogênio na película de parafina. Coloque os óculos nas gotas; A solução de proteína se espalhará entre as duas superfícies para cobrir toda a parte traseira do vidro. Incubar durante 1,5 h à temperatura ambiente (RT).
3. Remova o filme de parafina e bloqueie os óculos de cobertura colocando-os, com o lado revestido para cima em uma placa de 4 poços com tampão de bloqueio. Incubar durante 1 h a 37 ° C ou durante a noite a 4 ° C. Como controle, bloqueie um copo de cobertura que não tenha sido revestido com VWF ou fibrinogênio.

3. Preparação de Plasma rico em plaquetas (PRP)

1. Recolher sangue total citratado (concentração final: 0,32% de citrato de sódio (M / V)) por punção venosa.
2. Centrifugar o sangue por 15 min a 160 xg e RT sem freio. Recolher o sobrenadante ( ou seja, o PRP) com uma pipeta Pasteur de plástico.
   NOTA: Após a centrifugação, três camadas podem ser observadas (de cima para baixo): PRP, glóbulos brancos e glóbulos vermelhos. Certifique-se de não incluir as células brancas e vermelhas. Tipicamente, 3 mL de PRP podem ser coletados após centrifugação de um tubo de sangue de 9 ml.
3. Continue a seção 4 se o experimento for realizado com plaquetas lavadas. Se o PRP for desejado, continue com o próximo passo.
4. Após a coleta de PRP, centrifugar o restante do sangue (contendo o sedimento de células vermelhas) novamente por 10 min a 2.000 xg sem freio. Recolher o sobrenadante contendo o plasma pobre em plaquetas (PPP).
   NOTA: Tipicamente, podem ser coletados 2 mL após este segundo passo de centrifugação.
5. Contar o número da pOs an�s do PRP num analisador de c�ulas e dilu�-lo com o PPP (passo 3.4) a uma concentra�o de 150 000 plaquetas / uL.
   NOTA: O volume total de PRP diluído depende da contagem de plaquetas do doador. As contagens de plaquetas variam amplamente entre os doadores e a diluição do PRP exige uma avaliação individual. As contagens de plaquetas são consideradas normais quando dentro de 150.000 e 450.000 plaquetas / μL.
6. Continue na seção 5.

4. Preparação de plaquetas lavadas

1. Determine o volume médio de plaquetas (MPV) no PRP usando um analisador de células.
   NOTA: Este é um indicador de pré-ativação plaquetária ¹¹ . Um MPV normal para plaquetas em repouso é 7.5-11.5 fL ¹¹ . O MPV não deve aumentar em mais de 1,5 fL durante o procedimento de lavagem de plaquetas.
2. Adicione um volume 1/10 de ACD ao PRP para evitar a pré-ativação das plaquetas e centrifugue por 15 min a 400 xg e RT sem freio. Remova o suPernatant e re-suspende o grânulo cuidadosamente no tampão de HEPES Tyrode, pH 6,5, ao volume original de PRP.
3. Destilar uma alíquota de prostaciclina por adição de TBS a uma concentração de 10 μg / mL; Mantenha-o no gelo.
4. Para evitar a ativação plaquetária, adicione prostaciclina em uma concentração final de 10 ng / mL às plaquetas re-suspensas e centrifugue imediatamente por 15 min a 400 xg e RT sem freio. Remova o sobrenadante e volte a suspender o grânulo com cuidado no tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4.
5. Contar o número de plaquetas (passo 3.5) e determinar a alteração no MPV (passo 4.1) (o MPV não deve mudar mais de 1,5 fL).
6. Ajuste o número de plaquetas com o tampão HEPES Tyrode, pH 7,4, para uma concentração de 150 000 plaquetas / μL. Deixe as plaquetas se recuperar durante 30 minutos à RT antes dos experimentos. Use plaquetas lavadas para experiências dentro de 4 h após o isolamento.

5. Conjunto da câmara de fluxo

NOTA: Essas experiências fazem uso de uma câmara de fluxo desenvolvida internamente ¹² . Pode ser utilizada uma variedade de câmaras de fluxo produzidas comercialmente, desde que possam conter uma tampa de vidro, que preferencialmente é removível para análises adicionais. A câmara de fluxo utilizada para as experiências descritas é feita a partir de poli (metacrilato de metilo) para ajustar precisamente uma fase de inserção do microscópio. Contém uma entrada e saída ( Figura 1A - C ; 1, 2), bem como uma conexão a vácuo ( Figura 1A e C ; 3). Uma folha de silicone personalizada ( Figura 1A e D ; 4) é colocada no topo. Dois recortes formam canais de vácuo ( Figura 1A e D ; 5) para fixar firmemente a tampa do vidro ( Figura 1A ; 6). Um corte central forma o canal de fluxo ( Figura 1A E D ; 7; 2,0 mm de largura e 0,125 mm de altura). A entrada e a saída estão conectadas ao canal de fluxo, e o vácuo está conectado ao canal de vácuo.

1. Cubra a parte superior da câmara de fluxo com água destilada e coloque a folha de silicone personalizada com o lado liso na água. Flutue a folha na posição removendo o excesso de água enquanto mantém a folha na posição.
   NOTA: Esta folha de silicone é reutilizável (o silicone é conhecido por suas propriedades inertes); Geralmente, as plaquetas não foram observadas para anexar a ela. As folhas podem ser limpas com detergente e reutilizadas até que o material fique danificado ( isto é, rasgando, especialmente na área entre os canais). Geralmente, uma folha pode ser usada por 20 dias com múltiplas experiências por dia.
2. Incubar a câmara de fluxo durante 1 h a 60 ° C para evaporar a água residual para aderir firmemente a folha de silicone à câmara de fluxo.
3. Com uma pipeta Pasteur de plástico, adicione uma gota deHEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, no canal de fluxo. Coloque o vidro da tampa (consulte a seção 2) com o lado revestido para baixo, no canal de fluxo. Conecte a bomba de vácuo à conexão de vácuo ( Figuras 1A e C ; 3). Aplique uma pressão de ~ 10 kPa.

6. Pré-coloração das plaquetas e preparação dos anticorpos

1. Coloração de plaquetas
   1. Incubar as plaquetas lavadas com 10 μg / mL de DAPI durante 30 min a 37 ° C no escuro. Para lavar a DAPI não ligada e prevenir a ativação plaquetária, adicione prostaciclina a uma concentração final de 10 ng / mL e centrifugue imediatamente por 15 min a 400 xg e RT sem freio.
   2. Reconstitua o sedimento de plaquetas no tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4, a uma concentração de plaquetas de 150 000 plaquetas / μL.
2. Preparação de anticorpos
   1. Misture o anticorpo marcado com biotina com estreptoma marcada com AlexaTavidina numa proporção molar de 1: 1. Incubar durante um mínimo de 10 minutos à temperatura ambiente antes da utilização (passo 7.6).
      NOTA: A eficiência da rotulagem da biotina pode variar entre diferentes lotes. Caso haja problemas com a visualização de moléculas alvo, as experiências de controle devem ser realizadas para confirmar a biotinilação bem sucedida, bem como as propriedades de ligação ao alvo do anticorpo biotinilado específico.

7. Perfusão

1. Comece o microscópio de fluorescência, bem como o software do microscópio. Use as configurações do microscópio listadas na Tabela 1 .
   NOTA: Inicie o microscópio e as configurações de gravação para a visualização e registro das plaquetas e os anticorpos e / ou corantes marcados fluorescentemente escolhidos, carregando um experimento apropriado no software do microscópio. Execute experiências de fluxo na RT.
2. Bloqueie a tubulação de entrada conectando uma seringa de 10 mL à tubulação e aspirando 1% de HSA bloNo buffer de entrada. Incube durante 15 minutos à TA. Enxaguar o tubo de entrada aspirando o tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4, no tubo de entrada.
3. Conecte o tubo de entrada bloqueado e o tubo de saída não tratado, ambos com um diâmetro de 1,02 mm e um comprimento de ~ 20-30 cm para a entrada e saída da câmara. Conecte uma seringa de 10 mL (ou menor volume para mais precisão) ao tubo de saída. Alimentar a bomba da seringa.
   NOTA: O diâmetro da seringa, em combinação com o caudal ajustado na bomba, determina o caudal volumétrico. Juntamente com a área de superfície do canal de fluxo, a taxa de cisalhamento pode ser calculada de acordo com a fórmula ¹³ abaixo. Por isso, é possível manipular a taxa de cisalhamento alterando o caudal da bomba da seringa ou alterando as dimensões do canal de fluxo. Uma taxa de cisalhamento de 800-1,600 s ^-1 tipicamente modelos para o fluxo sanguíneo arterial, enquanto 25 - 100 modelos ^s-1 para sangue venosofluxo. Para esta configuração, uma taxa de fluxo de 7,5 μL / min resulta em uma taxa de cisalhamento de 25 s ^-1 .
   Taxa de cisalhamento = 6Q / h ² w em s ^-1
   Em que: Q = taxa de fluxo volumétrico (mL / s), h = canal de altura (cm) (0,0125 cm, esta é a espessura da folha de silicone), w = largura do canal (cm) (0,2 cm nesta câmara).
4. Coloque uma gota de óleo de imersão em um objetivo de 100X (amplificação total de 1.000X) e monte a câmara no microscópio com a superfície de vidro para baixo.
5. Coloque a tubulação de entrada em um tubo contendo tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4. Puxe manualmente o êmbolo da seringa conectado ao tubo de saída e puxe a solução através da câmara para remover o ar do sistema. Coloque a seringa na bomba de seringa ( Figura 1B e C ; 8) e execute a bomba brevemente para apertar o êmbolo e garantir um fluxo estável.
6. Adicionar anticorpos e / ou corantes à suspensão de plaquetas ou PRP, cuidadosamenteMisture com uma pipeta de plástico e transfira a mistura para um tubo de 1,5 mL.
   NOTA: Para uma perfusão típica de 30 min a taxa de cisalhamento 25 ^s-1 (7,5 μL / min), é necessário um mínimo de 225 μL de suspensão de plaquetas. Os anticorpos utilizados para os resultados representativos são mostrados na Tabela 2 .
7. Mova o tubo de entrada, enquanto aperta, do tampão HEPES Tyrode, pH 7,4, para um tubo de 1,5 mL contendo PRP ou as plaquetas lavadas e os anticorpos e / ou corantes ( Figura 1B e C ; 9).
   NOTA: É importante que, ao transferir a tubulação, a tubulação seja espremida (pressionando o ar) para evitar que o ar entre na tubulação. É possível tratar plaquetas aderentes com uma variedade de reagentes em um passo subsequente, movendo o tubo de entrada para outro tubo de maneira semelhante. Uma lista de reagentes potencialmente úteis é fornecida na Tabela 3 .
8. Selecione a "visualização ao vivoN "no software, focalize o microscópio na superfície do vidro revestido revestido e inicie a bomba a uma taxa de cisalhamento de 1.600 ^s-1 (484 μL / min) até que as plaquetas atinjam a câmara de fluxo. Neste momento, Reduzir a taxa de cisalhamento de volta para 25 ^s-1 alterando as configurações da bomba da seringa para um caudal de 7,5 μL / min.
9. Monitore a superfície do lado revestido do vidro da tampa, espere até que a primeira plaquetas comece a aderir, aponte o microscópio para esta plaquetas e comece a gravar iniciando a experiência no software. Consulte a Tabela 1 para as configurações de gravação usadas aqui.
10. Siga a gravação ao vivo visualmente. Após 30 min, pare a bomba da seringa.
    NOTA: Certifique-se de que as plaquetas permanecem em foco durante o curso da experiência. Normalmente, 20-30 plaquetas se ligam no campo de visão com uma ampliação de 1.000X; Isto é cerca de 2.000-3.000 plaquetas em todo o canal de fluxo.
11. Fixação usandoA câmara de fluxo (opcional).
    1. Quando o fluxo parou depois que a bomba da seringa é parada, transfira a tubulação de entrada (sem ar) para a solução fixadora. Reinicie a bomba e circule o tampão de fixação através do canal por um mínimo de 10 minutos com o mesmo caudal mencionado no passo 7.8.
12. Remova a câmara do microscópio, limpe o óleo de imersão do vidro, desconecte o vácuo e remova cuidadosamente o vidro da tampa com uma agulha de 18 G.
    NOTA: Evite que o vidro da tampa quebre e danifique a folha de silicone.
13. Coloque o slide da tampa (com as células direcionadas para cima) em uma placa de 4 poços em cima de um tecido, pré-molhado com água destilada.
    NOTA: Isso evita que o vidro da tampa adira à superfície do poço e evita a secagem.
14. Pipetar 750 μL de solução fixadora no topo do vidro da tampa e incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Caso as amostras não possam ser analisadas diretamente,Guarde-os em 0,5% de PFA (diluído pelo tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4) a 4 ° C para garantir uma fixação estável. Proceda à seção 8 para processar o vidro da tampa para imagens.
15. Após o uso, enxágue a câmara, a tubulação e a folha com água destilada e incube durante a noite em uma solução detergente. Antes da reutilização da câmara e de outros componentes, enxaguar com água destilada.
16. Salve os arquivos de dados brutos do microscópio contendo todos os metadados. Quando necessário, exporte os filmes para .MOV, h.264 comprimido ou .AVI descompactado. Guarde quadros separados como arquivos JPEG ou TIF.

8. Preparação de Amostras para Microscopia de Fluorescência Confocal

1. Transfira os óculos de cobertura para placas novas de 4 poços e enxágue 5 vezes com 3 mL de tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4. Adicione 3 mL / poço de tampão de bloqueio e incube durante 1 h à TA.
2. Remova o buffer de bloqueio; Adicionar 3 mL / poço de 0,15% de glicina (M / V) no tampão HEPES Tyrode, pH 7,4; E incubar durante 15 minutos em RT.
3. Retire a solução de glicina e lave 5 vezes em 3 mL / poço de tampão de bloqueio. Opcionalmente, adicione anticorpos conjugados com fluoróforos diluídos em tampão de bloqueio para coloração adicional. Incube durante 1 h à RT no escuro.
4. Lavar 5 vezes com tampão de bloqueio e 2 vezes com água destilada. Secar o vidro removendo o excesso de líquido com um tecido (das bordas para dentro), sem tocar nas células.
5. Pipetar 60 μL de solução de álcool polivinílico em uma lâmina de microscópio. Coloque a tampa de vidro, com as células para baixo, em cima da gota e deixe o álcool polivinílico se espalhar entre as duas superfícies. Incube durante a noite na RT no escuro.
6. Analisar as células por microscopia confocal ¹⁴ .
7. Salve os arquivos de dados brutos dos dados da pilha gravada contendo todos os metadados. Quando necessário, processe os arquivos de dados brutos nos arquivos MOV, h.264 comprimidos ou .AVI descompactados. Guarde pilhas separadas como arquivos JPEG ou TIF.

Resultados

A Figura 1 mostra imagens da câmara de fluxo e configuração experimental; A posição e as dimensões da folha de silício; E conexões de tubulação. A Figura 2 fornece detalhes sobre as dimensões da câmara de fluxo. A Figura 3 eo Filme 1 mostram uma série de imagens de adesão plaquetária e propagação em VWF imobilizado. CD63 é uma proteína transmembranar que é inseri...

Discussão

Em todo o mundo, a trombose é uma das principais causas de morte e morbidade, e as plaquetas desempenham um papel central no seu desenvolvimento. Este trabalho descreve um método para a imagem de células vivas de degranulação de plaquetas sob fluxo. Em geral, assume-se que, quando as plaquetas se ativam, todos os conteúdos granulares são liberados diretamente na solução. Os resultados que acompanham sugerem que este não é necessariamente o caso. Durante a adesão e degranulação, as plaquetas retêm uma quan...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	VWR	441476L
Na2HPO4	Sigma	S-0876
NaCl	Sigma	31434
KCl	Sigma	31248
MgSO4	Merck KGaA	1.05886
D-glucose	Merck KGaA	1.04074
Prostacyclin	Cayman Chemical	18220
Tri-sodium citrate	Merck KGaA	1.06448
Citric acid	Merck KGaA	1.00244
Cover glasses	Menzel-Gläser	BBAD02400500#A	24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness.
Chromosulfuric acid (2% CrO3)	Riedel de Haen	07404	CAS [65272-70-0].
Von Willebrand factor (VWF)	in-house purified
Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	FIB3L
4 well dish, non-treated	Thermo Scientific	267061
Human Serum Albumin Fraction V	Haem Technologies Inc.	823022
Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2%	Greiner Bio-One	455322
Cell analyser	Abbott Diagnostics	CELL-DYN hematology analyzer
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4
Syringe pump	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Harvard apparatus 22
10 mL syringe with 14.5 mm diameter	BD biosciences	305959	Luer-Lok syringe
Anti-CD63-biotin	Abcam	AB134331
Anti-CD62P-biotin	R&D Systems	Dy137
4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Polysciences Inc.	9224
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate	Thermo Scientific	S11223
Immersion oil	Zeiss	444963-0000-000
Detergent solution	Unilever, Biotex
Glycine	Sigma	56-40-6
Polyvinyl alcohol	Sigma	9002-89-5	Mowiol 40-88.
Tris hydrochloride	Sigma	1185-53-1
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	Sigma	280-57-9
Sheep Anti-hVWF pAb	Abcam	AB9378
Alexa fluor 488-NHS	Thermo Scientific	A20000
Glycerol	Sigma-Aldrich	15523-1L-R
Parafinn film	Bemis	PM-996	4 in. x 125 ft. Roll.
Silicone sheet non-reinforced	Nagor	NA 500-1	200 mm x 150 mm x 0.125 mm.
Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels	in-house made		Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1)
1.5 mL tubes	Eppendorf AG	T9661-1000AE
Fluorescent microscope	Zeiss Observer Z1		Equiped with LED excitation lights.
Microscope software	Zeiss ZEN 2	blue edition
18 G needle (18 G x 1 1/2")	BD biosciences	305196
NaCl	Riedel de Haen	31248375
Tris	Roche	10708976
Plastic pasteur pipet	VWR	612-1681	7 mL non sterile, graduated up to 3 mL.
Silicone tubing	VWR	228-0656	Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm.
Microscope slides	Thermo Scientific	ABAA000001##12E	76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end.