流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

要約

この研究では、血小板の接着、広がり、および分泌の流れを調べるための蛍光顕微鏡検査に基づく方法を説明しています。この多目的プラットフォームは、血栓症および止血に関する機械的研究のための血小板機能の調査を可能にする。

要約

血小板は、止血における重要な役割を果たし、血管侵害を封鎖するための血栓の形成である。それらは血栓症、脈管構造を閉塞させ、器官を傷つける血栓の形成にも関わり、生命を脅かす結果となる。これは、血小板機能に関する科学的研究と、フロー条件下で起こる細胞生物学的プロセスを追跡する方法の開発を促す。

血小板の生物学における2つの重要な現象である血小板の接着と凝集の研究には、さまざまなフローモデルが利用できます。この研究は、活性化の間の流れの下でのリアルタイム血小板脱顆粒を研究する方法を記載している。この方法は、広視野の逆LEDベースの蛍光顕微鏡の下に置かれたシリンジポンプ装置に連結されたフローチャンバを利用する。ここで説明する設定は、蛍光標識された抗体またはフルオレセインによって送達される複数のフルオロフォアの同時励起を可能にする染料。生細胞イメージング実験後、カバーガラスは、静的顕微鏡法（ すなわち、共焦点顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を用いて、さらに処理および分析することができる。

概要

血小板は、血流中を循環する無核細胞である。彼らの主な機能は、損傷の部位での血管侵害を封鎖し、失血を防ぐことである。損傷のこれらの部位では、内皮下コラーゲン繊維が露出され、続いて多量体タンパク質、フォンビルブラント因子（VWF）によって覆われる。 VWFは、細胞表面¹上の糖タンパク質Ibα-IX-V複合体に依存し、血小板の速度を減速させる機構において血小板と循環して相互作用する。これは、高剪断速度において特に重要である。その後、血小板は、コラーゲンから活性化インパルスを受けながら形態学的変化を受ける。これは不可逆的な広がりをもたらし、最終的には血小板の凝集をもたらす。両方のプロセスは、血小板 - 血小板のクロストークを促進するために顆粒内容物の分泌に依存する。とりわけ、血小板α顆粒は、血小板接着を助け、橋渡しするためにフィブリノゲンおよびVWFを含むインテグリン依存的に血小板を結合する。血小板高密度顆粒は、カルシウムおよびアデノシン二リン酸（ADP）を含む無機化合物²を含み、血小板活性化を強化するのに役立つ。さらに、血小板は、（アレルギー性）炎症³ 、補体制御タンパク質⁴および血管新生因子^5,6のメディエーターを含有し、これらの内容物が様々な条件下でどのように差異的に放出されるかおよびどのように放出されるかについての疑問を生じさせる。

1980年代以来、血流モデルにおける血小板機能の研究は、血栓性メカニズムの研究にとって重要である⁷ 。それ以来、多くの技術的進歩がなされており、フィブリン形成を含むフローモデルは、現在、治療用血小板濃縮物の生体外での潜在能力をアッセイするために開発されている血栓形態に及ぼす剪断速度の乱れの影響を調べる⁹ 。安定した接着および生理学的血栓形成（止血）対病理学的な血栓形成（血栓症）を促進する分子および細胞 - 生物学的機構の相違は非常に微妙であり、これらの亜細胞のリアルタイム視覚化を可能にする流れモデルの開発を促すプロセス。

そのような設定が価値があるプロセスの例は、細胞内ポリリン酸の（再）分布と、これがフィブリン超微細構造¹⁰に与える時間依存性の影響を明らかにするための凝固因子の動員である。研究はしばしばエンドポイント分析に限定されます。記載された方法の主な目的は、血小板活性化の間に起こる動的細胞内プロセスのリアルタイムの視覚的調査を可能にすることである。

プロトコル

この研究のものを含む、 生体外での研究目的のために、血液の採取を承認した大学医療センターユトレヒトの地方医療倫理委員会。

1.ソリューションの準備

1. 10mMのHEPES、0.5mMのNa ₂ HPO 4、145mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgSO ₄ 、および5.55mMのD-グルクロン酸を溶解することによって4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）タイロード緩衝液を調製する。蒸留水中のグルコース。
   1. 緩衝液の2つの変異体を作製する：pHレベルをそれぞれ6.5および7.4に設定する。実験の毎日のために新鮮な緩衝液を作る。 10 ng / mLのプロスタサイクリンを補充する。
2. 50mM Trisと150mM NaClを蒸留水に溶解し、pHを9.0に調整してTRIS緩衝食塩水（TBS）を調製します。
3. 85 mMクエン酸三ナトリウム、71 mMクエン酸、111 mM D-グルコースを溶解して酸クエン酸デキストロース（ACD）を調製する。澄んだ水。
4. HEPESタイロード緩衝液（pH 7.4）に2％（v / v）パラホルムアルデヒド（PFA）を加えて固定液を調製する。溶解させるために加熱し（50〜70℃）、pHを7.4に設定する。等分し、-20℃で保存する。使用前に37℃で解凍する。
5. 1％（m / v）のヒト血清アルブミン（HSA）をHEPESタイロードバッファー（pH 7.4）に溶解してブロッキングバッファーを調製する
6. グリセロール12gにポリビニルアルコール4.8gを加えてポリビニルアルコール溶液を調製し、よく混合する。 12mLの蒸留水を加え、室温で一晩回転器に放置する。
   1. 0.2M Tris-HCl（pH8.5）24mLを添加する。 30分間混合しながら50℃に加熱する。 1.25gの1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン（DABCO）を添加し、よく混合する。 1,500 xgで5分間遠心分離する。等分した上清（15-20のスライドには1mLで十分です）を-20℃で保存します。アリコートは一度使用してください。

カバーガラスの準備

1. Degreaseカバー原液（25×50mm ² ）中に希釈していないクロム硫酸で一晩インキュベートする。カバーグラスを蒸留水ですすぎ、オーブンで60℃で一晩乾燥させます。
2. パラフィン膜（10×15cm ² ）のストリップを実験室のベンチの上に水滴で付着させ、パラフィン膜を平滑にして空気を除去する。パラフィン膜上に10μg/ mLのVWFまたは100μg/ mLのフィブリノーゲンの80μLのピペットを滴下する。眼鏡を滴の上に置きます。タンパク質溶液は2つの表面の間に広がり、ガラスの裏面全体を覆う。室温（RT）で1.5時間インキュベートする。
3. パラフィン膜を除去し、コーティングされた面をブロッキング緩衝液を含む4ウェルプレートに入れて、カバーガラスを置いてブロックする。 37℃で1時間または4℃で一晩インキュベートする。対照として、VWFまたはフィブリノゲンでコーティングされていないカバーガラスをブロックする。

血小板富化血漿（PRP）の調製

1. 静脈穿刺によりクエン酸塩全血（最終濃度：0.32％クエン酸ナトリウム（M / V））を採取する。
2. ブレーキなしで160 xgおよびRTで15分間血液を遠心分離する。プラスチックのパスツールピペットで上清（ すなわち、 PRP）を集める。
   注：遠心分離後、3つの層が上から下に観察される：PRP、白血球、および赤血球。白と赤のセルは含めないでください。典型的には、9mLの血液チューブを遠心分離した後、3mLのPRPを収集することができる。
3. 実験が洗浄された血小板を用いて行われる場合は、セクション4に進む。 PRPが必要な場合は、次の手順に進みます。
4. PRPを採取した後、残りの血液（赤血球を含む）を再び2,000 xgで10分間、ブレーキをかけずに遠心します。血小板欠乏血漿（PPP）を含む上清を集める。
   注：通常、この2回目の遠心分離ステップ後に2 mLを集めることができます。
5. pの数を数えるラットレットをPRPに添加し、150,000血小板/μLの濃度までPPPで希釈する（ステップ3.4）。
   注：希釈PRPの総量は、ドナーの血小板数に依存する。血小板数はドナー間で大きく異なり、PRP希釈は個々の基準で評価する必要があります。血小板数は、150,000〜450,000血小板/μLの範囲内で正常とみなされます。
6. セクション5に進みます。

4.洗浄された血小板の調製

1. 細胞分析装置を用いてPRP中の平均血小板容積（MPV）を決定する。
   注：これは血小板プレ活性化の指標です¹¹ 。血小板を静止させるための正常なMPVは、7.5〜11.5fLである¹¹ 。 MPVは、血小板洗浄処置中に1.5fL以上増加してはならない。
2. 血小板の前活性化を防ぐためにPRPに1/10容量のACDを加え、ブレーキなしで400 xgおよびRTで15分間遠心する。 suを削除するHEPESタイロードバッファー（pH 6.5）中でペレットを注意深くPRPの元の容量に再懸濁する。
3. 10μg/ mLの濃度にTBSを添加することによってプロスタサイクリンのアリコートを解凍する;それを氷上に保つ。
4. 血小板の活性化を防ぐために、再懸濁した血小板にプロスタサイクリンを10ng / mLの最終濃度で添加し、すぐにブレーキなしで400xgおよび室温で15分間遠心する。上清を除去し、HEPES Tyrode緩衝液（pH 7.4）中で注意深くペレットを再懸濁する。
5. 血小板の数をカウントし（ステップ3.5）、MPVの変化を決定する（ステップ4.1）（MPVは1.5fLを超えて変化してはならない）。
6. HEPES Tyrode緩衝液（pH 7.4）を用いて150,000血小板/μLの濃度に血小板数を調整する。実験に先立ち、血小板をRTで30分間回復させる。隔離後4時間以内に洗浄した血小板を実験に使用する。

5.フローチェンバーアセンブリ

注：これらの実験では、社内で開発されたフローチャンバー^{12を使用してい}ます。さらなる分析のために優先的に除去可能なカバーガラスを保持することができる限り、様々な商業的に製造されたフローチャンバを使用することができる。記載された実験に使用されるフローチャンバーは、ポリ（メチルメタクリレート）から作られ、顕微鏡インサートステージに正確に適合する。それは、入口と出口（ 図1A〜C ; 1,2）、および真空接続（ 図1AおよびC ; 3）を含む。カスタマイズされたシリコンシート（ 図1AおよびD ; 4）が上に配置される。カバーガラス（ 図1A ; 6）をチャンバーにしっかりと取り付けるために、2つの切り欠きが真空チャンネルを形成します（ 図1AおよびD ; 5）。中央の切り欠きが流路を形成する（ 図1A とD ; 7;幅2.0mm、高さ0.125mm）。入口および出口は流路に接続され、真空は真空チャネルに接続される。

1. フローチャンバーの上部を蒸留水で覆い、カスタマイズされたシリコンシートを滑らかな面を下にして水の上に置きます。シートを所定の位置に保持したまま余分な水分を除去してシートを定位置に浮かせます。
   注：このシリコーンシートは再使用可能です（シリコーンはその不活性特性で知られています）。一般に、血小板はそれに付着することが観察されていない。シートは洗剤で拭き取ることができ、材料が損傷するまで（ すなわち 、特にチャネル間の領域で裂ける）、再使用することができる。一般に、シートは1日に複数の実験を行って20日間使用することができる。
2. 60℃で1時間フローチャンバーをインキュベートして残留水を蒸発させて、シリコーンシートをフローチャンバーにしっかりと接着させます。
3. プラスチックのパスツールピペットで、HEPES Tyrode緩衝液（pH7.4）を流路に流した。コーティングされた面を下にして、カバーガラス（セクション2を参照）をフローチャネル上に置きます。真空ポンプを真空接続部に接続します（ 図1Aおよび図 C ; 3）。 10kPaの圧力をかけてください。

6.血小板の前染色および抗体の調製

1. 血小板染色
   1. 洗浄した血小板を10μg/ mLのDAPIと共に30分間37℃で暗所でインキュベートする。結合していないDAPIを洗い流し、血小板活性化を防ぐために、プロスタサイクリンを最終濃度10ng / mLで添加し、即座にブレーキなしで400xgおよびRTで15分間遠心分離する。
   2. 血小板ペレットをHEPES Tyrode緩衝液（pH 7.4）で再構成して、150,000血小板/μLの血小板濃度にする。
2. 抗体の調製
   1. ビオチン標識抗体とAlexa標識strepを混合するタビジンを1：1のモル比で含む。使用前に室温で最低10分間インキュベートする（ステップ7.6）。
      注：ビオチン標識効率は、バッチごとに異なる場合があります。標的分子の視覚化に問題がある場合、成功したビオチン化および特異的ビオチン化抗体の標的結合特性を確認するための対照実験を実施すべきである。

7.灌流

1. 蛍光顕微鏡と顕微鏡ソフトウェアを起動します。 表1に示す顕微鏡設定を使用します。
   注：顕微鏡ソフトウエアに適切な実験をロードすることにより、血小板および選択された蛍光標識抗体および/または色素の生細胞視覚化および記録のための顕微鏡および記録設定を開始する。室温でフロー実験を行う。
2. チューブに10 mLシリンジを接続し、1％HSA bloを吸引して吸入チューブをブロックする入口チューブに緩衝液を入れる。 RTで15分間インキュベートする。 HEPES Tyrode緩衝液（pH 7.4）を吸入管に吸引することによって吸入管をすすぐ。
3. ブロックされたインレットチューブと未処理のアウトレットチューブを直径1.02 mm、長さ約20-30 cmでチャンバーの入口と出口に接続します。出口チューブに10 mLのシリンジを接続します（より正確には、容量を小さくしてください）。シリンジポンプの電源を入れます。
   注記：シリンジの直径は、ポンプに設定された流量と組み合わせて、容積流量を決定します。流路の表面積と共に、せん断速度は、式¹³に従って計算することができる 以下。したがって、シリンジポンプの流量を変更することによって、または流路の寸法を変更することによってせん断速度を操作することが可能である。せん断速度800〜1,600s ^-1は、典型的には動脈血流をモデルとし、25〜100s ^-1モデルは静脈血フロー。この設定では、7.5μL/分の流速は25s ^-1のせん断速度をもたらす。
   せん断速度= 6Q / h ² w ^-1 s ^-1
   ここで、Q =容積流量（mL / s）、h =高さチャンネル（cm）（0.0125cm、これはシリコーンシートの厚さ）、w =幅チャンネル（cm）（このチャンバーでは0.2cm）。
4. 100倍の対物レンズ（1000倍の全増幅）に1滴の浸漬オイルを置き、ガラス面を下にして顕微鏡にチャンバーを取り付けます。
5. インレットチューブをHEPESタイロード緩衝液（pH 7.4）を入れたチューブに入れます。出口チューブに接続されたシリンジのプランジャーを手動で引っ張り、溶液をチャンバーに通してシステムから空気を除去します。シリンジポンプ（ 図1B およびC ; 8）にシリンジを置き、ポンプを短時間作動させてプランジャーを締め、安定した流れを確保します。
6. 血小板懸濁液またはPRPに抗体および/または色素を慎重に添加する。プラスチックピペットで混合し、混合物を1.5mLチューブに移す。
   注：せん断速度25s ^-1 （7.5μL/分）での典型的な30分間の灌流のために、最低225μLの血小板懸濁液が必要である。代表的な結果に用いた抗体を表2に示す。
7. HEPES Tyrodeの緩衝液（pH 7.4）から、PRPまたは洗浄した血小板、抗体および/または色素（ 図1B およびC ; 9）の入った1.5mLチューブに注入チューブを押し込みながら移動させます。
   注記：チューブを移動するとき、チューブに空気が入るのを防ぐために、チューブを絞る（空気を押し出す）ことが重要です。同様の方法で入口チューブを別のチューブに移動させることにより、後続のステップで様々な試薬で接着血小板を治療することが可能である。潜在的に有用な試薬のリストを表3に示す 。
8. 「ライブ映像を選択するn "オプションを使用して、カバーガラスの表面に顕微鏡を向け、血小板がフローチャンバーに達するまで1,600 ^s-1 （484μL/分） ^の剪断速度でポンプを始動させます。シリンジポンプの設定を7.5μL/分の流量に変更することにより、せん断速度を25 ^s-1に戻します。
9. カバーグラスのコーティングされた面の表面をモニターし、最初の血小板が付着し始めるのを待って顕微鏡をこの血小板に合焦させ、ソフトウェアで実験を開始して記録を開始する。ここで使用される録画設定については、 表1を参照してください。
10. ライブ録画を視覚的に追跡します。 30分後、シリンジポンプを停止する。
    注：実験中に血小板にフォーカスが当たっていることを確認してください。典型的には、20〜30枚の血小板が視野内に1,000倍の倍率で付着する。これは流路全体で約2,000〜3,000の血小板である。
11. 使用して固定フローチャンバー（オプション）。
    1. シリンジポンプが停止した後にフローが停止したら、注入チューブ（空気なし）を固定溶液に移します。ポンプを再起動し、手順7.8で述べたのと同じ流量で最低10分間、チャンネルを通して固定バッファーを流します。
12. 顕微鏡からチャンバーを取り出し、ガラスから浸漬油をきれいにし、真空を外し、18Gの針でカバーガラスをチャンバーから慎重に取り出します。
    注記：カバーガラスが破損してシリコンシートが損傷するのを防止します。
13. 蒸留水で予め濡らした組織の上にある4ウェルプレートにカバースライド（細胞を上向きにして）を置く。
    注：これにより、カバーガラスがウェルの表面に付着するのを防ぎ、乾燥を防ぎます。
14. カバーグラスの上に750μLの固定液をピペットで入れ、室温で1時間インキュベートする。試料を直接分析することができない場合、安定した固定を確実にするために、4℃で0.5％PFA（HEPES Tyrode緩衝液、pH 7.4で希釈）に保存してください。イメージングのためにカバーガラスを処理するには、セクション8に進んでください。
15. 使用後、チャンバー、配管、およびシートを蒸留水ですすぎ、洗剤溶液で一晩インキュベートする。チャンバーやその他の部品を再使用する前に、蒸留水ですすいでください。
16. すべてのメタデータを含む顕微鏡生データファイルを保存します。必要に応じて、ムービーを.MOV、h.264圧縮、または.AVIを非圧縮にエクスポートします。別々のフレームをJPEGまたはTIFファイルとして保存します。

共焦点蛍光顕微鏡の試料調製

1. カバーグラスを新しい4ウェルプレートに移し、3 mLのHEPESタイロードバッファー（pH 7.4）で5回リンスします。 3mL /ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、室温で1時間インキュベートする。
2. ブロッキングバッファを削除します。 HEPESタイロード緩衝液（pH 7.4）中に0.15％グリシン（M / V）3mL /ウェルを添加する。 Rで15分間インキュベートするT.
3. グリシン溶液を除去し、3mL /ウェルのブロッキング緩衝液で5回洗浄する。必要に応じて、追加の染色のためにブロッキング緩衝液で希釈したフルオロフォア結合抗体を添加する。暗所でRTで1時間インキュベートする。
4. ブロッキングバッファーで5回、蒸留水で2回洗浄する。細胞に触れることなく、余分な液体をティッシュで（縁の内側から）取り除いてガラスを乾燥させます。
5. 顕微鏡スライド上に60μLのポリビニルアルコール溶液をピペットで加える。細胞を落とした上にカバーガラスを置き、ポリビニルアルコールを2つの表面の間に広げます。暗所でRTで一晩インキュベートする。
6. 共焦点顕微鏡法で細胞を分析する¹⁴ 。
7. すべてのメタデータを含む記録されたスタックデータの生データファイルを保存します。必要に応じて、RAWデータファイルをMOV、h.264圧縮ファイル、または.AVI非圧縮ファイルに処理します。別々のスタックをJPEGまたはTIFファイルとして保存します。

結果

図1は、フローチャンバおよび実験装置の画像を示す。シリコンシートの位置および寸法;チュービング接続。 図2は、フローチャンバーの寸法の詳細を示しています。 図3およびムービー1は、固定化されたVWF上の血小板接着および広がりの画像の時系列を示す。 CD63は、休止血小板

ディスカッション

世界中で、血栓症は死亡および罹患率の主要な原因であり、血小板はその発症の中心的役割を果たす。この研究は、血小板脱顆粒の生細胞イメージングのための方法を記載している。一般に、血小板が活性化されると、全ての顆粒状の内容物が直接溶液中に放出されると想定される。付随する結果は、これが必ずしも当てはまらないことを示唆している。接着および脱顆粒の間、血小板はか?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	VWR	441476L
Na2HPO4	Sigma	S-0876
NaCl	Sigma	31434
KCl	Sigma	31248
MgSO4	Merck KGaA	1.05886
D-glucose	Merck KGaA	1.04074
Prostacyclin	Cayman Chemical	18220
Tri-sodium citrate	Merck KGaA	1.06448
Citric acid	Merck KGaA	1.00244
Cover glasses	Menzel-Gläser	BBAD02400500#A	24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness.
Chromosulfuric acid (2% CrO3)	Riedel de Haen	07404	CAS [65272-70-0].
Von Willebrand factor (VWF)	in-house purified
Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	FIB3L
4 well dish, non-treated	Thermo Scientific	267061
Human Serum Albumin Fraction V	Haem Technologies Inc.	823022
Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2%	Greiner Bio-One	455322
Cell analyser	Abbott Diagnostics	CELL-DYN hematology analyzer
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4
Syringe pump	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Harvard apparatus 22
10 mL syringe with 14.5 mm diameter	BD biosciences	305959	Luer-Lok syringe
Anti-CD63-biotin	Abcam	AB134331
Anti-CD62P-biotin	R&D Systems	Dy137
4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Polysciences Inc.	9224
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate	Thermo Scientific	S11223
Immersion oil	Zeiss	444963-0000-000
Detergent solution	Unilever, Biotex
Glycine	Sigma	56-40-6
Polyvinyl alcohol	Sigma	9002-89-5	Mowiol 40-88.
Tris hydrochloride	Sigma	1185-53-1
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	Sigma	280-57-9
Sheep Anti-hVWF pAb	Abcam	AB9378
Alexa fluor 488-NHS	Thermo Scientific	A20000
Glycerol	Sigma-Aldrich	15523-1L-R
Parafinn film	Bemis	PM-996	4 in. x 125 ft. Roll.
Silicone sheet non-reinforced	Nagor	NA 500-1	200 mm x 150 mm x 0.125 mm.
Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels	in-house made		Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1)
1.5 mL tubes	Eppendorf AG	T9661-1000AE
Fluorescent microscope	Zeiss Observer Z1		Equiped with LED excitation lights.
Microscope software	Zeiss ZEN 2	blue edition
18 G needle (18 G x 1 1/2")	BD biosciences	305196
NaCl	Riedel de Haen	31248375
Tris	Roche	10708976
Plastic pasteur pipet	VWR	612-1681	7 mL non sterile, graduated up to 3 mL.
Silicone tubing	VWR	228-0656	Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm.
Microscope slides	Thermo Scientific	ABAA000001##12E	76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end.