تشريح وثقافة ماوس الجنينية الكلى

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل وزراعة أساسيات ميتانيفريك من الأجنة الماوس.

Abstract

الهدف من هذا البروتوكول هو لوصف طريقة لتشريح، العزلة، والثقافة من أساسيات ميتانيفريك الماوس.

خلال تطور الكلى الثدييات، واثنين من الأنسجة الاصلية، وبرعم الحالب والميزينشيم ميتانيفريك، والتواصل وتحفيز بالمثل آليات الخلوية لتشكيل في نهاية المطاف نظام جمع و نيفرونس الكلى. كما تنمو الأجنة الثدييات داخل الرحم وبالتالي لا يمكن الوصول إليها للمراقب، وقد وضعت ثقافة الجهاز. مع هذا الأسلوب، فمن الممكن لدراسة التفاعلات الظهارية اللحمة المتوسطة والسلوك الخلوي خلال أورغانوجينيسيس الكلى. وعلاوة على ذلك، يمكن التحقق من أصل الكلى الخلقية والتشوهات الجهاز البولي التناسلي. بعد تشريح دقيق، يتم نقل أساسيات ميتانيفريك على مرشح الذي يطفو على وسط الاستزراع ويمكن أن تبقى في حاضنة ثقافة الخلية لعدة أيام. ومع ذلك، يجب أن يكون على بينة من أن الشروط هيالاصطناعي ويمكن أن تؤثر على عملية التمثيل الغذائي في الأنسجة. أيضا، اختراق المواد اختبار يمكن أن تكون محدودة بسبب المصفوفة خارج الخلية والغشاء القاعدي موجودة في إكسلانت.

ميزة رئيسية واحدة من ثقافة الجهاز هو أن المجرب يمكن الحصول على إمكانية الوصول المباشر إلى الجهاز. هذه التكنولوجيا هي رخيصة وبسيطة، ويسمح لعدد كبير من التعديلات، مثل إضافة المواد النشطة بيولوجيا، ودراسة المتغيرات الجينية، وتطبيق تقنيات التصوير المتقدمة.

Introduction

The mammalian kidney is derived from two primordial structures with mesodermal origin: the tubular epithelial ureteric bud and the metanephric mesenchyme. During nephrogenesis, the ureteric bud invades the metanephric mesenchyme and branches to form the collecting system. The metanephric mesenchyme gives rise to the epithelial elements of the nephrons. These processes occur in a precisely timed and spatially coordinated manner and are initiated by reciprocal inductive mechanisms. Both tissue components communicate and affect the other's cell morphogenesis.

In the 1920s, it was Boyden who performed the in vivo obstruction of the mesonephric duct in chicken, providing the first indication of inductive interactions as separated nephric blastema fail to differentiate¹. At about the same time, the first successful attempts to culture chicken nephric rudiments in a hanging drop were published. Subsequently, the organ culture was developed to study tissue interactions in mammalian organogenesis. In the 1950s, Grobstein developed a technique in which metanephric rudiments could be cultured on a filter. This technique was modified by Saxén, who placed the filter on a Trowell-type screen in a culture dish¹. Over the years, many modifications and applications for organ culture have emerged. The method described here is based on Saxén's technique but is simplified, as the filters float free on the medium and the diameter of the culture well only slightly exceeds the diameter of the filter, limiting unwanted movement of the filter.

Whole-organ culture is a classical, cheap, and simple but powerful tool to investigate cellular processes and intercellular communication during organogenesis. Organ culture allows for treatment with biological agents, such as growth factors, antibodies, antisense oligonucleotides, viruses, and peptides, as well as with pharmaceutical compounds and other chemicals. Also, gene function may be studied using explants derived from genetically modified mice or using inducible gene inactivation technology, such as the Cre-loxP system. This allows for the study of genetic mutations that cause embryonic lethality prior to the development of the kidney. Organ culture can also be combined with fluorescent tagging for gene function or lineage tracing and modern imaging techniques, which enable real-time monitoring of cell behavior².

In the specific example provided here, the effect of EphrinB2-activated Eph-receptor signaling on the branching morphology of the ureteric bud was investigated. The morphology of the EphA4/EphB2 double-knockout mice suggested several severe defects in kidney development, which were detectable as early as embryonic day 11 (E11) and involved the ureteric bud, the ureter, and the common nephric duct³. Signaling via Eph receptors requires the clustering of the ligand-receptor dimer⁴. To over-activate Eph signaling, the kidney rudiments from E11.5 mouse embryos were cultured in the presence of clustered recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is a known ligand for the EphA4 receptor, which is expressed in the ureteric bud tips³.

Protocol

وتم الحفاظ على الفئران وفقا للوائح السويدية وتشريعات الاتحاد الأوروبي (2010/63 / يو). وتم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات السويدية (التصاريح C79 / 9 و C248 / 11 و C135 / 14). وقد تمت الموافقة على الإجراءات في جامعة هايدلبرغ التي تتعلق بالمواضيع الحيوانية من قبل ريجيرونسبراسيديوم كارلسروه وضباط رعاية الحيوان في جامعة هايدلبرغ.

1. إعداد الكواشف والمواد للثقافة

ملاحظة: استخدام غطاء تدفق رقائقي للحد من التلوث.

1. في يوم تشريح، قبل الكتلة البشرية فك وحدها أو المؤتلف البروتين إفرين خيالي تنصهر إلى فك البشري عن طريق مزجها مع الأجسام المضادة الماعز فك الإنسان بنسبة مولارية من 1: 5 في المالحة الفوسفات معقمة المالحة (بس). احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ⁵ .
2. إعداد وسط الثقافة عن طريق استكمال دولبيكو في النسر المعدل المتوسطة: المغذياتالخليط F-12 (دمم / F12) مع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (v / v)، 1٪ الجلوتامين (الخامس / الخامس)، 1٪ الأنسولين ترانسفرين-السيلينيوم (v / v)، 50 ميكروغرام / مل الإنسان holo- ترانسفيرين، و 1.5 ميكروغرام / مل أمفوتيريسين.
   ملاحظة: 10 مل من المتوسط ​​يكفي ل 16 الأجنة.
3. إضافة محلول إفرين متجمد المؤتلف في تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل إلى وسط الاستزراع. استخدام فك الإنسان المتجمعة كسيطرة.
4. إعداد لوحات الثقافة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الوسط الثقافي إلى كل بئر من العقيمة، غير المطلية، مسطحة القاع البوليسترين لوحة 4 جيدا.
5. باستخدام ملقط معقم، مكان بعناية واحد مرشح غشاء البولي مع حجم المسام من 5 ميكرون لكل بئر على أعلى المتوسطة. نقل لوحة أعدت إلى حاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ كو ₂ ). تأكد من أن المرشح يبقى جافة على السطح العلوي ويطفو.
   ملاحظة: مرشح واحد يكفي لاثنين من أنلاجين الكلى.
6. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع ما يقرب من 30 نصائح ماصة (حجم: 100 ميكرولتر) أبروسيماتلy 1 ملم من طرف ليؤدي إلى افتتاح أوسع. ضع النصائح مرة أخرى في رف ماصة طرف.

2. تشريح رذاذ ميتانيفريك في E11.5

1. التضحية الماوس في فترة الحوامل في E11.5 عن طريق خلع عنق الرحم (أو باستخدام طريقة وافقت عليها لجنة الأخلاق المحلية).
2. إزالة الرحم والأجنة، كما وصفها براون وآخرون ⁶ . من هذه النقطة إلى الأمام، والعمل تحت المجهر تشريح.
3. باستخدام رقم 5 ملقط الساعاتي، وقطع الجنين مباشرة تحت أركان. استخدام طبق بتري جديدة لكل الجنين. إزالة الساقين والذيل من الجنين. للقيام بذلك، والاستيلاء على الأنسجة المراد إزالتها مع زوج واحد من رقم 5 ملقط الساعاتي واستخدام نصائح الزوج الثاني لخفض.
4. لإزالة كتلة الجهاز البطني، واستخدام نصائح من زوج من ملقط لفتح أفقيا جدار الجسم من الجنين في اتجاه منقاري إلى الذيلية.
   1. قطع سطحيا، موازية ل tالأبهر الظهري. استخدام الدم المملوءة وبالتالي مرئية الظهري الأبهر للتوجه. بعناية فصل الجزء البطني من جدار الجسم من الجزء الظهري باستخدام نصائح ملقط مغلقة والوجه الجنين أكثر. قطع جدار الجسم أفقيا في اتجاه منقاري إلى الذيلية واستخدام الشريان الأورطي الظهري للتوجه، كما في الجانب السابق.
5. مرة واحدة وقد تم فصل جدار الجسم البطني من الجسم الظهري، والاستيلاء عليها مع زوج واحد من ملقط وسحب بعناية لإزالته، جنبا إلى جنب مع كتلة الجهاز.
   ملاحظة: أنلاجين ميتانيفريك عادة ما تبقى تعلق على جدار الجسم الظهري. فهي بيضاوية، ~ 200 ميكرون هياكل طويلة تقع على مستوى أطرافه الخلفية.
6. عقد جدار الجسم الظهري مع زوج واحد من ملقط، مع الجانب البطني مواجهة. باستخدام زوج آخر من ملقط، والاستيلاء على الشريان الأورطي الظهري في نهاية منقاري وقشر بعناية الشريان الأورطي الظهري من جدار الجسم الظهري.
   ملاحظة: كلا الكلى ميتانيفريك البقاء عادة إرفاقإد، حتى، ال التعريف، ظهري، أورتي.
7. باستخدام زوج واحد من ملقط، وقطع روسترالي إلى أنلاجين الكلى لإزالة الشريان الأبهر. ثم، فصل بعناية اثنين من أنلاجين الكلى باستخدام نصائح ملقط.
8. تقشر بعناية الأنسجة غير المرغوب فيها من أنلاجين الكلى باستخدام نصائح ملقط. الحرص على عدم إلحاق الضرر اللحمة المتوسطة، كما يمكن أن يؤدي الضرر في ضعف النمو وإقصاء إكسلانت من مزيد من التحليل.
9. نقل أنلاجين الكلى بشكل منفصل باستخدام ماصة ميكروليتر وفتح ماصة واسعة مفتوحة في 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لتصفية غشاء البولي في لوحة 4 جيدا.
   ملاحظة: بسبب التوتر السطحي، وسوف تكون مغطاة إكسلانت مع طبقة رقيقة من المتوسطة. مرشح واحد يكفي لاثنين من أنلاجين الكلى.
   1. وضع كل من أنلاجين الكلى في وسط كل نصف منها من المرشح. نقل لوحة العودة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية / 5٪ كو ₂ . ترك لوحة في الحاضنة حتى رود ميتانيفريكمن الجنين المقبل على استعداد لوضعها على التصفية.
10. كرر الخطوات من 2.3-2.9.1 لكل جنين.
    ملاحظة: مع بعض الممارسة، فإن إجراء تشريح يستغرق حوالي 5 دقائق لكل جنين.
11. احتضان أنلاجين الكلى لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية / 5٪ كو ₂ .

3. إعداد الكواشف للتثبيت وتلطيخ

1. لإعداد بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) في برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم (ث / ت)، حل بفا في 60 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني، واثارة باستمرار. بارد إلى درجة حرارة الغرفة واستخدام فلتر الورق لإزالة الجسيمات المتبقية. قسامة والحفاظ على 4 درجات مئوية للاستخدام الفوري أو تجميد للتخزين على المدى الطويل.
   تنبيه: بفا سامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المحددة في معايير السلامة المحلية والعمل في غطاء الدخان. التخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية واستخدام حاويات النفايات المعينة.
2. لإعداد حل بيرمابيليزاتيون، تمييع تريتون X-100في برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم إلى 0.3٪ (الخامس / الخامس).
3. لإعداد حجب الحل، إضافة 5٪ (الخامس / الخامس) الماعز المصل و 0.1٪ تريتون X-100 إلى برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم. إضافة أزيد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 0.02٪ (ث / ت). تخزين في 4 درجات مئوية.
   تنبيه: أزيد الصوديوم سامة. التعامل مع أزيد الصوديوم وفقا للسلامة المحلية وحماية البيئة اللوائح.
   ملاحظة: عند استخدام الأجسام المضادة للتلطيخ، واستخدام مصل 5٪ من الأنواع تم اشتقاق الأجسام المضادة الثانوية من لجعل حجب الحل.
4. تمييع البيروكسيديز دوليتشور بيفلوروس راصة 1: 200 في حجب الحل. تمييع Alexa488 مترافق ستريبتافيدين 1: 200 في حجب الحل.
5. (انظر جدول المواد)، إضافة 0.1 غرام من الكحول القابلة للذوبان في الماء بولي فينيل موكودزيف / مل إلى 25٪ (ث / ت) الجلسرين في 0.1 M تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.5) . الحرارة إلى 50 درجة مئوية تحت التحريض المستمر لمدة 1 ساعة، يبرد، وضبط درجة الحموضة إلى 8.0-8.5 باستخدام 1M هيدروكسيد الصوديوم. تجنب تركيزات أعلى هيدروكسيد الصوديوم. إضافة 100 ميكروغرام / مل N- بروبيلغالات والثيميروسال إلى تركيز النهائي من 0.02٪ (ث / ت). يحرك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   تنبيه: ثيميروسال سامة. التعامل معها وفقا للسلامة المحلية وحماية البيئة اللوائح.
   1. ملء المتوسطة التضمين في أنابيب 50 مل، وتوازن الدوار، وأجهزة الطرد المركزي في 3،200 x ج ودرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. صب حل واضح في أنابيب 15 مل وتجاهل بيليه. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع. مرة واحدة إذابة، والحفاظ على الحل في 4 درجات مئوية. الدافئة إلى ~ 30 درجة مئوية مباشرة قبل الاستخدام.
6. إعداد العديد من الشرائح الزجاجية كما المرشحات مع إكسلانتس هي التي شنت. لهذا، الغراء اثنين كوفرسليبس الصغيرة، 18 × 18 ملم، على جانبي الشريحة الزجاجية باستخدام لاصقة فورية، وترك مساحة 15 ملم ~ للمرشح بينهما.

4. التثبيت وتلطيخ

1. بعد فترة زراعة من 3أيام في المختبر (ديف)، وإزالة لوحات من الحاضنة ونضح بعناية وسط الثقافة من كل بئر باستخدام ميكروبيبيت. تأكد من عدم لمس فلتر والحفاظ على فتح طرف نحو جدار البئر.
2. إضافة 500 ميكرولتر من 4٪ بفا / برنامج تلفزيوني لكل بئر. المرشحات سوف تطفو على تثبيتي. باستخدام ميكروبيبيت، إضافة بعناية بفا تثبيتي قطرة للغمر المرشحات. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: بالنسبة لجميع الخطوات التالية، يجب الحرص على عدم غسل إإكسبلنتس من التصفية. الحفاظ على فتح طرف ماصة نحو جدار البئر.
3. إزالة بفا وشطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، غمر مرشح. إضافة 500 ميكرولتر من حل بيرمابيليزاتيون إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
4. شطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر من حجب الحل لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
5. استبدال الحل حظر مع250 ميكرولتر من البيروكسيديز دوليكوروس بيفلوروس راصة المخفف 1: 200 في حجب الحل واحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
6. إزالة الحل بلاتلوروس دوليتشوروس الجلوتين وشطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر.
7. إضافة 250 ميكرولتر من Alexa488 مترافق ستريبتافيدين المخفف 1: 200 في حجب الحل واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. بدلا من ذلك، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
   ملاحظة: ويتحقق أفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء عند حضانة عند 4 درجات مئوية.
8. شطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. باستخدام ملقط، ونقل المرشحات إلى الشرائح الزجاجية المعدة، مع إإكسبلانتس مواجهة. جبل مع ~ 50-100 ميكرولتر من تضمين المتوسطة. تغطية مع 60 ملم طول رقم 1.5 كوفرسليبس. السماح حل المتوسطة التضمين لتصلب لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. انتقل إلى التصوير أو تخزين الشرائح، ملفوفة في احباط، في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للصورة.
9. صورة مع المجهر إبيفلورزنس إبيفلورزنس ^{7 <}/ سوب> مقترنة بمصباح زئبق واستخدام وحدة مرآة للإثارة الزرقاء (ممر علوي للإثارة، 460 - 495 نانو متر، ومرآة ثنائية اللون، و 505 نانو متر، وممر اجتياز للانبعاثات، و 510 - 550 نانومتر)، و 20X من العدسات، فتحة.

النتائج

وقد استمدت أنلاجين الكلى ميتانيفريك من الحوامل الأسود -6 الفئران إنبريد في E11.5 وتم تربيتها. بعد 3 أيام، برعم الحالب قد تشعبت تصل إلى 5 مرات، مما أدى إلى تشعب من برعم الحالب على شكل حرف T في البداية. تم تصوير كل مستكشف، وتم تحديد أعداد القطاعات ونقاط النه...

Discussion

وتصف هذه المخطوطة طريقة لعزل أنلاجين ميتانيفريك النامية من جنين الماوس وثقافة أساسيات الجهاز. هذا الأسلوب هو تقنية قياسية، كما وضعتها غروبستين ⁸ و ساكسن ^{9 ، 10} ، وتم تكييفها وتعديلها من قبل العديد من الآخرين ¹¹ <...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21331020
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140148
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040117	use for dissection
holo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T0665
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x)	Thermo Fisher Scientific	41400045
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Amphotericin B solution	Sigma-Aldrich	A2942
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Thimerosal	Sigma-Aldrich	T5125
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin	Vector Laboratories	B-1035
Alexa488 conjugated Streptavidin	Jackson Immuno Research	016-540-084
Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF	R&D Systems	496-EB
Recombinant Human IgG1 Fc, CF	R&D Systems	110-HG-100
Goat Anti-Human IgG Fc Antibody	R&D Systems	G-102-C
Phosphate buffered saline tablets	Sigma-Aldrich	P4417	use for fixation and immunostaining
Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm	agnthos.se	0208-5-PS	2 pairs of forceps are needed
Iris scissors, straight, 12 cm	agnthos.se	03-320-120
Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm	agnthos.se	08-032-130
Petri dishes Nunclo Delta treated	Thermo Fisher Scientific	150679
TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain	MerckMillipore	TMTP01300
Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom	Sigma-Aldrich	D6789-1CS
Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm	nordicbiolabs	107222
Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm	nordicbiolabs	102032
Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain	nordicbiolabs	1030418
VWR Razor Blades	VWR	55411-055
50 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430828
15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430055
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped	Sigma-Aldrich	WHA1213125
Fixed stage research mircoscope	Olympus	BX61WI
Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac	Taconic	B6-M
Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac	Taconic	B6-F
Greenough Stereo Microscope	Leica	Leica S6 E