Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von metanephrischen Rudimente aus Mäuseembryonen.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode für die Sektion, Isolierung und Kultur der Maus metanephrischen Rudimente zu beschreiben.

Während der Säugetier-Nieren-Entwicklung, die beiden Vorläufer-Gewebe, die ureterische Knospe und das metanephrische Mesenchym, kommunizieren und wechselseitig zelluläre Mechanismen induzieren, um schließlich das Sammelsystem und die Nephrone der Niere zu bilden. Da Säugetier-Embryonen intrauterin wachsen und daher für den Beobachter unzugänglich sind, wurde eine Orgelkultur entwickelt. Mit dieser Methode ist es möglich, epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen und zelluläres Verhalten während der Nierenorganogenese zu untersuchen. Darüber hinaus kann der Ursprung von angeborenen Nieren- und Urogenitaltrakt-Fehlbildungen untersucht werden. Nach sorgfältiger Dissektion werden die metanephrischen Rudimente auf einen Filter übertragen, der auf Kulturmedium schwimmt und in einem Zellkulturinkubator für mehrere Tage gehalten werden kann. Allerdings muss man sich bewusst sein, dass die Bedingungen sindKünstlich und könnte den Stoffwechsel im Gewebe beeinflussen. Auch konnte das Eindringen von Testsubstanzen aufgrund der extrazellulären Matrix und der im Explantat vorhandenen Basalmembran begrenzt werden.

Ein wesentlicher Vorteil der Orgelkultur ist, dass der Experimentator direkten Zugang zum Orgel haben kann. Diese Technologie ist billig, einfach und erlaubt eine Vielzahl von Modifikationen, wie die Zugabe von biologisch aktiven Substanzen, die Untersuchung von genetischen Varianten und die Anwendung fortschrittlicher bildgebender Verfahren.

Einleitung

The mammalian kidney is derived from two primordial structures with mesodermal origin: the tubular epithelial ureteric bud and the metanephric mesenchyme. During nephrogenesis, the ureteric bud invades the metanephric mesenchyme and branches to form the collecting system. The metanephric mesenchyme gives rise to the epithelial elements of the nephrons. These processes occur in a precisely timed and spatially coordinated manner and are initiated by reciprocal inductive mechanisms. Both tissue components communicate and affect the other's cell morphogenesis.

In the 1920s, it was Boyden who performed the in vivo obstruction of the mesonephric duct in chicken, providing the first indication of inductive interactions as separated nephric blastema fail to differentiate¹. At about the same time, the first successful attempts to culture chicken nephric rudiments in a hanging drop were published. Subsequently, the organ culture was developed to study tissue interactions in mammalian organogenesis. In the 1950s, Grobstein developed a technique in which metanephric rudiments could be cultured on a filter. This technique was modified by Saxén, who placed the filter on a Trowell-type screen in a culture dish¹. Over the years, many modifications and applications for organ culture have emerged. The method described here is based on Saxén's technique but is simplified, as the filters float free on the medium and the diameter of the culture well only slightly exceeds the diameter of the filter, limiting unwanted movement of the filter.

Whole-organ culture is a classical, cheap, and simple but powerful tool to investigate cellular processes and intercellular communication during organogenesis. Organ culture allows for treatment with biological agents, such as growth factors, antibodies, antisense oligonucleotides, viruses, and peptides, as well as with pharmaceutical compounds and other chemicals. Also, gene function may be studied using explants derived from genetically modified mice or using inducible gene inactivation technology, such as the Cre-loxP system. This allows for the study of genetic mutations that cause embryonic lethality prior to the development of the kidney. Organ culture can also be combined with fluorescent tagging for gene function or lineage tracing and modern imaging techniques, which enable real-time monitoring of cell behavior².

In the specific example provided here, the effect of EphrinB2-activated Eph-receptor signaling on the branching morphology of the ureteric bud was investigated. The morphology of the EphA4/EphB2 double-knockout mice suggested several severe defects in kidney development, which were detectable as early as embryonic day 11 (E11) and involved the ureteric bud, the ureter, and the common nephric duct³. Signaling via Eph receptors requires the clustering of the ligand-receptor dimer⁴. To over-activate Eph signaling, the kidney rudiments from E11.5 mouse embryos were cultured in the presence of clustered recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is a known ligand for the EphA4 receptor, which is expressed in the ureteric bud tips³.

Protokoll

Die Mäuse wurden nach den schwedischen Vorschriften und den Rechtsvorschriften der Europäischen Union (2010/63 / EU) aufrechterhalten. Alle Verfahren wurden nach den Richtlinien des schwedischen Ethikausschusses durchgeführt (Genehmigungen C79 / 9, C248 / 11 und C135 / 14). Die Verfahren an der Universität Heidelberg mit Tierfächern wurden vom Regierungspräsidium Karlsruhe und den Tierschutzbeauftragten an der Universität Heidelberg genehmigt.

1. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien für Kultur

HINWEIS: Verwenden Sie eine laminare Strömungshaube, um die Kontamination zu minimieren.

1. Am Tag der Sezierung wurde das menschliche Fc allein oder rekombinantes chimäres Ephrinprotein, das mit menschlichem Fc fusioniert ist, durch Mischen mit anti-humanen Fc-Ziegen-Antikörpern in einem Molverhältnis von 1: 5 in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt. 1 Stunde bei 37 ° C inkubieren ⁵ .
2. Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient ergänzenMischung F-12 (DMEM / F12) mit 1% Penicillin / Streptomycin (v / v), 1% Glutamin (v / v), 1% Insulin-Transferrin-Selen (v / v), 50 μg / ml menschliches Holo- Transferrin und 1,5 μg / ml Amphotericin.
   HINWEIS: 10 ml Medium reicht für 16 Embryonen aus.
3. Fügen Sie gruppierte rekombinante Ephrinlösung in einer Endkonzentration von 20 μg / ml zum Kulturmedium hinzu. Verwenden Sie Clustered Human Fc als Kontrolle.
4. Bereiten Sie Kulturplatten vor, indem Sie 500 & mgr; l Kulturmedium zu jeder Vertiefung einer sterilen, unbeschichteten, flachen Boden-Polystyrol-4-Well-Platte hinzufügen.
5. Mit sterilen Pinzetten sorgfältig einen Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von 5 μm pro Well auf das Medium legen. Übertragen Sie die vorbereitete Platte in den Inkubator (37 ° C / 5% CO ₂ ). Stellen Sie sicher, dass der Filter auf der Oberseite trocken bleibt und schwimmt.
   HINWEIS: Ein Filter reicht für zwei Nierenanlagen aus.
6. Mit einer Rasierklinge schneiden Sie ca. 30 Pipettenspitzen (Volumen: 100 μl) approximatelY 1 mm von der Spitze, um zu einer breiteren Öffnung zu führen. Legen Sie die Spitzen wieder in ein Pipetten-Tip-Rack.

2. Dissektion von metanephrischen Rudimente bei E11.5

1. Opfer eine zeitlich-schwangere Maus bei E11.5 durch zervikale Versetzung (oder mit einer Methode, die von der lokalen Ethik-Ausschuss genehmigt).
2. Entfernen Sie den Uterus und die Embryonen, wie von Brown et al. ⁶ beschrieben. Von diesem Punkt aus, arbeiten Sie unter einem Sektionsmikroskop.
3. Mit der Nr. 5 Uhrmacherzange, schneide den Embryo direkt unter die Vorderbeine. Verwenden Sie für jeden Embryo eine frische Petrischale. Entfernen Sie die Beine und den Schwanz des Embryos. Um dies zu tun, greifen Sie das Gewebe mit einem Paar von Nr. 5 Uhrmacher Pinzette entfernt werden und verwenden Sie die Spitzen eines zweiten Paares zu schneiden.
4. Um die ventrale Organmasse zu entfernen, benutze die Spitzen einer Pinzette, um die Körperwand des Embryos in einer rostral-to-caudalen Richtung zu öffnen.
   1. Schnitt oberflächlich, parallel zu tEr dorsale aorta Verwenden Sie die Blut-gefüllte und daher sichtbare dorsale Aorta zur Orientierung. Sorgfältig trennen Sie den ventralen Teil der Körperwand von der dorsalen Teil mit den Spitzen der geschlossenen Pinzette und drehen Sie den Embryo über. Schneiden Sie die Körperwand seitlich in einer rostralen bis kaudalen Richtung und verwenden Sie die dorsale Aorta zur Orientierung, wie für die vorherige Seite.
5. Sobald die ventrale Körperwand vom dorsalen Körper getrennt ist, packt sie mit einer Pinzette und zieht sie sorgfältig zusammen, um sie zusammen mit der Orgelmasse zu entfernen.
   HINWEIS: Die metanephrischen Anlagen bleiben gewöhnlich an der dorsalen Körperwand befestigt. Sie sind ovale, 200 μm lange Strukturen, die sich auf der Höhe der Hinterbeine befinden.
6. Halten Sie die dorsale Körperwand mit einer Pinzette, mit der ventralen Seite nach oben. Mit dem anderen Paar Pinzette, greifen die dorsale Aorta an seinem rostralen Ende und sorgfältig schälen die dorsale Aorta aus der dorsalen Körperwand.
   ANMERKUNG: Beide metanephrischen Nieren bleiben in der Regel angebrachtAuf die dorsale aorta
7. Mit einem Paar Pinzette, schneiden rostral auf die Niere anlagen, um die Aorta zu entfernen. Dann trennen Sie sorgfältig die beiden Niere anlagen mit den Spitzen der Pinzette.
8. Vorsichtig vor unerwünschtes Gewebe aus der Niere anlagen mit den Spitzen der Pinzette abziehen. Achten Sie darauf, das Mesenchym nicht zu beschädigen, da Schäden zu einem schlechten Wachstum und Ausschluss des Explantats aus einer weiteren Analyse führen können.
9. Übertragen Sie die Niere anlagen separat mit einer Mikroliterpipette und einer weit geöffneten Pipettenspitze in 10 μl PBS zum Polycarbonat-Membranfilter in einer 4-Well-Platte.
   HINWEIS: Durch die Oberflächenspannung wird das Explantat mit einer dünnen Schicht von Medium bedeckt. Ein Filter reicht für zwei Nierenanlagen aus.
   1. Legen Sie jedes der beiden Nieren-Anlagen in die Mitte jeder jeweiligen Hälfte des Filters. Übertragen Sie die Platte wieder auf den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO ₂ . Verlasse den Teller im Inkubator bis zum metanephrischen RudIments aus dem nächsten Embryo sind bereit, auf den Filter gelegt zu werden.
10. Wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.9.1 für jeden Embryo.
    ANMERKUNG: Bei einigen Übungen dauert das Dissektionsverfahren etwa 5 min pro Embryo.
11. Inkubation der Niere anlagen für 3 Tage bei 37 ° C / 5% CO ₂ .

3. Vorbereitung der Reagenzien zur Fixierung und Färbung

1. Zur Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS ohne Calcium und Magnesium (w / v), löst man die PFA bei 60 ° C in PBS, kontinuierlich rühren. Auf Raumtemperatur abkühlen und mit einem Papierfilter die restlichen Partikel entfernen. Aliquot und bei 4 ° C zur sofortigen Anwendung aufbewahren oder zur Langzeitlagerung einfrieren.
   ACHTUNG: PFA ist giftig. Tragen Sie die persönliche Schutzausrüstung, die in den örtlichen Sicherheitsnormen angegeben ist, und arbeiten Sie in einer Abzugshaube. Verwerfung von Abfällen nach institutionellen Richtlinien und Verwendung von Abfallbehältern.
2. Zur Vorbereitung der Permeabilisierungslösung verdünnen Sie Triton X-100In PBS ohne Kalzium und Magnesium bis 0,3% (v / v).
3. Zur Herstellung der Blockierungslösung 5% (v / v) Ziegenserum und 0,1% Triton X-100 zu PBS ohne Calcium und Magnesium zugeben. Füge Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% (w / v) hinzu. Bei 4 ° C aufbewahren.
   ACHTUNG: Natriumazid ist giftig. Behandeln Sie Natriumazid gemäß den örtlichen Sicherheits- und Umweltschutzbestimmungen.
   HINWEIS: Bei der Verwendung von Antikörpern für die Färbung, verwenden Sie 5% Serum aus der Spezies der sekundäre Antikörper wurde abgeleitet, um Sperrlösung zu machen.
4. Verdünnen Sie biotinyliertes Dolichorus biflorus Agglutinin 1: 200 in Blockierungslösung. Verdünnen Sie Alexa488-konjugiertes Streptavidin 1: 200 in Blockierungslösung.
5. Zur Herstellung von gebrauchsfertigem Einbettungsmedium (siehe Tabelle der Materialien) werden 0,1 g wasserlösliches Polyvinylalkohol-basiertes Mukoadhäsiv / ml bis 25% (w / v) Glycerin in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) . Unter ständigem Rühren für 1 h auf 50 ° C erhitzen, abkühlen lassen und den pH-Wert auf 8,0-8,5 einstellenM NaOH. Vermeiden Sie höhere NaOH-Konzentrationen. Füge 100 μg / ml N-Propylgallat und Thimerosal zu einer Endkonzentration von 0,02% (w / v) hinzu. 30 min bei Raumtemperatur umrühren.
   ACHTUNG: Thimerosal ist giftig. Behandeln Sie es gemäß den örtlichen Sicherheits- und Umweltschutzbestimmungen.
   1. Füllen Sie das Einbettungsmedium in 50 ml Röhrchen, balancieren Sie den Rotor und zentrifugieren Sie bei 3.200 xg und Raumtemperatur für 10 min. Die klare Lösung in 15 ml Röhrchen dekantieren und das Pellet entsorgen. Aliquot und bei -20 ° C für mehrere Wochen aufbewahren. Einmal aufgetaut, halten Sie die Lösung bei 4 ° C. Warm bis ~ 30 ° C sofort vor Gebrauch.
6. Bereiten Sie so viele Glasrutschen vor, wie Filter mit Explantaten montiert werden sollen. Dazu kleben Sie zwei kleine Deckgläser, 18 x 18 mm, auf beiden Seiten des Glasschiebers mit Instant-Klebstoff, lassen Sie einen Durchmesser von 15 mm für den Filter dazwischen.

4. Fixierung und Färbung

1. Nach einer Kultivierungszeit von 3Tage in vitro (div), entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und sorgfältig aspirieren das Kulturmedium aus jeder Vertiefung mit einer Mikropipette. Achten Sie darauf, den Filter nicht zu berühren und halten Sie die Spitze in Richtung der Wand des Brunnens.
2. Fügen Sie 500 μl 4% PFA / PBS zu jeder Vertiefung hinzu. Die Filter schweben auf dem Fixiermittel. Verwenden Sie eine Mikropipette, fügen Sie vorsichtig das PFA-Fixiermittel hinzu, um die Filter zu tauchen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min.
   HINWEIS: Für alle folgenden Schritte ist darauf zu achten, dass die Explantate nicht aus dem Filter abgewaschen werden. Halten Sie das Öffnen der Pipettenspitze zur Wand des Brunnens.
3. Entfernen Sie die PFA und spülen Sie zweimal mit 500 μl PBS, tauchen Sie den Filter ein. Füge 500 μl Permeabilisierungslösung zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere bei Raumtemperatur für 1 h.
4. Spülen Sie zweimal mit 500 & mgr; l PBS und fügen Sie 500 & mgr; l Blockierungslösung zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 h.
5. Ersetzen Sie die Sperrlösung durch250 μl biotinyliertes Dolichorus biflorus Agglutinin verdünnt 1: 200 in Blockierungslösung und inkubieren bei 4 ° C für 24 h.
6. Die Dolichorus biflorus Agglutininlösung entfernen und zweimal mit 500 μl PBS pro Vertiefung ausspülen.
7. Füge 250 μl Alexa488-konjugiertes Streptavidin hinzu, verdünnt 1: 200 in Blockierungslösung und inkubiere bei 4 ° C für 24 h. Alternativ bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren.
   HINWEIS: Ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis wird erreicht, wenn es bei 4 ° C inkubiert wird.
8. Spülen Sie zweimal mit 500 μl PBS pro Vertiefung. Mit Pinzette, die Filter auf die vorbereiteten Glasrutschen übertragen, mit den Explantaten nach oben. Montage mit ~ 50-100 μl Einbettmedium. Deckel mit 60 mm langen Nr. 1,5 Deckgläschen. Man läßt die Einbettmediumlösung 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln erstarren. Gehen Sie zum Abbilden oder lagern Sie die Folien, in Folie verpackt, bei 4 ° C bis zum Bild.
9. Bild mit einem Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop ^{7 <}/ Sup> gekoppelt an eine Hg-Lampe und verwenden eine Spiegeleinheit für die blaue Anregung (Anregungsbandpass, 460 - 495 nm, dichromatischer Spiegel, 505 nm und Emissionsbandpass, 510 - 550 nm) und 20X Plan-Apochromat-Linsen, 0,75 numerisch Öffnung.

Ergebnisse

Metanephrische Nierenanlagen wurden von schwangeren Black-6-Inzuchtmäusen bei E11.5 abgeleitet und wurden kultiviert. Nach 3 Tagen hatte sich die Harnröhre bis zu 5 Mal verzweigt, was zu einer Verzweigung der anfänglich T-förmigen Harnröhre führte. Jedes Explantat wurde fotografiert, und die Anzahl der Segmente und Endpunkte wurde quantifiziert, um die Verzweigungsgenerationen zu bestimmen und die Anzahl der Endpunkte pro Zweig zu berechnen (Abbildung 1 ). Die Erze...

Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode, um das sich entwickelnde metanephrische Anlagen aus dem Maus-Embryo zu isolieren und die Orgel-Rudimente zu kultivieren. Diese Methode ist eine Standardtechnik, wie sie von Grobstein ⁸ und Saxén ^{9 , 10} entwickelt wurde und von vielen anderen ^{11 , 12} angepasst und modifiziert wurde. Der Erfolg der Methode hängt hauptsächlich von der Dau...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21331020
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140148
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040117	use for dissection
holo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T0665
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x)	Thermo Fisher Scientific	41400045
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Amphotericin B solution	Sigma-Aldrich	A2942
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Thimerosal	Sigma-Aldrich	T5125
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin	Vector Laboratories	B-1035
Alexa488 conjugated Streptavidin	Jackson Immuno Research	016-540-084
Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF	R&D Systems	496-EB
Recombinant Human IgG1 Fc, CF	R&D Systems	110-HG-100
Goat Anti-Human IgG Fc Antibody	R&D Systems	G-102-C
Phosphate buffered saline tablets	Sigma-Aldrich	P4417	use for fixation and immunostaining
Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm	agnthos.se	0208-5-PS	2 pairs of forceps are needed
Iris scissors, straight, 12 cm	agnthos.se	03-320-120
Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm	agnthos.se	08-032-130
Petri dishes Nunclo Delta treated	Thermo Fisher Scientific	150679
TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain	MerckMillipore	TMTP01300
Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom	Sigma-Aldrich	D6789-1CS
Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm	nordicbiolabs	107222
Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm	nordicbiolabs	102032
Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain	nordicbiolabs	1030418
VWR Razor Blades	VWR	55411-055
50 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430828
15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430055
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped	Sigma-Aldrich	WHA1213125
Fixed stage research mircoscope	Olympus	BX61WI
Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac	Taconic	B6-M
Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac	Taconic	B6-F
Greenough Stereo Microscope	Leica	Leica S6 E