Dissection et culture du rein embryonnaire de la souris

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour isoler et cultiver des rudiments métasphoriques à partir d'embryons de souris.

Résumé

Le but de ce protocole est de décrire une méthode de dissection, d'isolement et de culture des rudiments métanéphriques de souris.

Au cours du développement du rein des mammifères, les deux tissus progéniteurs, le bourgeon urétéral et le mésenchyme métasphorique, communiquent et induisent réciproquement des mécanismes cellulaires pour former éventuellement le système collecteur et les néphrons du rein. Au fur et à mesure que les embryons de mammifères se développent par voie intra-utérine et qui sont inaccessibles à l'observateur, une culture d'organe a été développée. Avec cette méthode, il est possible d'étudier les interactions épithéliales-mésenchymateuses et le comportement cellulaire pendant l'organogenèse rénale. En outre, l'origine des malformations rénales congénitales et des voies urogénitales peut être étudiée. Après une dissection minutieuse, les rudiments métanéphriques sont transférés sur un filtre qui flotte sur un milieu de culture et peuvent être conservés dans un incubateur de culture cellulaire pendant plusieurs jours. Cependant, il faut savoir que les conditions sontArtificielle et pourrait influencer le métabolisme dans le tissu. En outre, la pénétration des substances d'essai pourrait être limitée en raison de la matrice extracellulaire et de la membrane basale présents dans l'explant.

Un des principaux avantages de la culture des organes est que l'expérimentateur peut avoir un accès direct à l'organe. Cette technologie est peu coûteuse, simple et permet un grand nombre de modifications, telles que l'ajout de substances biologiquement actives, l'étude des variantes génétiques et l'application de techniques avancées d'imagerie.

Introduction

The mammalian kidney is derived from two primordial structures with mesodermal origin: the tubular epithelial ureteric bud and the metanephric mesenchyme. During nephrogenesis, the ureteric bud invades the metanephric mesenchyme and branches to form the collecting system. The metanephric mesenchyme gives rise to the epithelial elements of the nephrons. These processes occur in a precisely timed and spatially coordinated manner and are initiated by reciprocal inductive mechanisms. Both tissue components communicate and affect the other's cell morphogenesis.

In the 1920s, it was Boyden who performed the in vivo obstruction of the mesonephric duct in chicken, providing the first indication of inductive interactions as separated nephric blastema fail to differentiate¹. At about the same time, the first successful attempts to culture chicken nephric rudiments in a hanging drop were published. Subsequently, the organ culture was developed to study tissue interactions in mammalian organogenesis. In the 1950s, Grobstein developed a technique in which metanephric rudiments could be cultured on a filter. This technique was modified by Saxén, who placed the filter on a Trowell-type screen in a culture dish¹. Over the years, many modifications and applications for organ culture have emerged. The method described here is based on Saxén's technique but is simplified, as the filters float free on the medium and the diameter of the culture well only slightly exceeds the diameter of the filter, limiting unwanted movement of the filter.

Whole-organ culture is a classical, cheap, and simple but powerful tool to investigate cellular processes and intercellular communication during organogenesis. Organ culture allows for treatment with biological agents, such as growth factors, antibodies, antisense oligonucleotides, viruses, and peptides, as well as with pharmaceutical compounds and other chemicals. Also, gene function may be studied using explants derived from genetically modified mice or using inducible gene inactivation technology, such as the Cre-loxP system. This allows for the study of genetic mutations that cause embryonic lethality prior to the development of the kidney. Organ culture can also be combined with fluorescent tagging for gene function or lineage tracing and modern imaging techniques, which enable real-time monitoring of cell behavior².

In the specific example provided here, the effect of EphrinB2-activated Eph-receptor signaling on the branching morphology of the ureteric bud was investigated. The morphology of the EphA4/EphB2 double-knockout mice suggested several severe defects in kidney development, which were detectable as early as embryonic day 11 (E11) and involved the ureteric bud, the ureter, and the common nephric duct³. Signaling via Eph receptors requires the clustering of the ligand-receptor dimer⁴. To over-activate Eph signaling, the kidney rudiments from E11.5 mouse embryos were cultured in the presence of clustered recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is a known ligand for the EphA4 receptor, which is expressed in the ureteric bud tips³.

Protocole

Les souris ont été maintenues selon la réglementation suédoise et la législation de l'Union européenne (2010/63 / UE). Toutes les procédures ont été effectuées selon les directives du Comité suédois d'éthique (permis C79 / 9, C248 / 11 et C135 / 14). Les procédures à l'Université de Heidelberg portant sur des matières animales ont été approuvées par le Regierungspräsidium Karlsruhe et les agents de protection des animaux à l'Université de Heidelberg.

1. Préparation des réactifs et des matériaux pour la culture

REMARQUE: Utilisez un capot à flux laminaire pour minimiser la contamination.

1. Le jour de la dissection, la protéine d'éphrine chimère recombinante Fc seule ou recombinante est fusionnée à Fc humaine en la mélangeant avec des anticorps contre la chèvre Fc anti-humains à un rapport molaire de 1: 5 dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Incuber pendant 1 h à 37 ° C ⁵ .
2. Préparer le milieu de culture en complétant l'Eagle Eagle modifié par Dulbecco: NutrientMélange F-12 (DMEM / F12) avec 1% de pénicilline / streptomycine (v / v), 1% de glutamine (v / v), 1% d'insuline-transferrine-sélénium (v / v), 50 μg / mL d'holo- La transferrine et 1,5 μg / ml d'amphotéricine.
   REMARQUE: 10 ml de milieu sont suffisants pour 16 embryons.
3. Ajouter une solution d'éphrine recombinante en grappe à une concentration finale de 20 μg / ml sur le milieu de culture. Utilisez le Fc humain en cluster comme contrôle.
4. Préparer des plaques de culture en ajoutant 500 μl de milieu de culture à chaque puits d'une plaque stérile, non revêtue, à base de polystyrène à fond plat et à 4 puits.
5. En utilisant des pinces stériles, placez soigneusement un filtre à membrane en polycarbonate avec une taille de pore de 5 μm par puits sur le dessus du milieu. Transférer la plaque préparée à l'incubateur (37 ° C / 5% de CO ₂ ). Assurez-vous que le filtre reste sec sur la surface supérieure et les flotteurs.
   REMARQUE: Un filtre suffit pour deux anilènes rénaux.
6. En utilisant une lame de rasoir, couper environ 30 pointes de pipette (volume: 100 μL) approximatelY 1 mm de la pointe pour aboutir à une ouverture plus large. Placez les embouts dans une crémaillère à pipette.

2. Dissection de Rudiments Metanephriques à E11.5

1. Sacrifiez une souris enceinte chronométrée à E11.5 par dislocation cervicale (ou utilisez une méthode approuvée par le comité local d'éthique).
2. Supprimer l'utérus et les embryons, comme décrit par Brown et al ⁶ . Sur ce point, travailler sous un microscope à dissection.
3. En utilisant la pince à horlogerie n ° 5, couper l'embryon directement sous les pattes antérieures. Utilisez un plat de Petri frais pour chaque embryon. Retirer les jambes et la queue de l'embryon. Pour ce faire, prenez le tissu à enlever avec une paire de pince à horlogerie n ° 5 et utilisez les pointes d'une deuxième paire pour couper.
4. Pour enlever la masse d'organe ventrale, utilisez les pointes d'une pince pour ouvrir latéralement la paroi du corps de l'embryon dans une direction rostrale à caudale.
   1. Couper superficiellement, parallèlement à tL'aorte dorsale. Utilisez l'aorte dorsale remplie de sang et donc visible pour l'orientation. Séparez soigneusement la partie ventrale de la paroi du corps de la partie dorsale en utilisant les pointes de la pince fermée et retournez l'embryon. Coupez la paroi du corps latéralement dans une direction rostral à caudale et utilisez l'aorte dorsale pour l'orientation, comme pour le côté précédent.
5. Une fois que la paroi du ventral a été séparée du corps dorsal, saisissez-la avec une paire de pince et tirez soigneusement pour l'enlever, avec la masse de l'organe.
   REMARQUE: l'anilène métanéphrique reste habituellement attaché à la paroi du corps dorsal. Ce sont des structures ovales, de 200 μm de long situées au niveau des membres postérieurs.
6. Tenez la paroi du corps dorsal avec une paire de pince, avec le côté ventral vers le haut. À l'aide de l'autre pince, saisissez l'aorte dorsale à son extrémité rostrale et épluchez soigneusement l'aorte dorsale de la paroi du corps dorsal.
   NOTE: Les deux reins métasphériques restent habituellement attachésÀ l'aorte dorsale.
7. À l'aide d'une paire de pinces, coupez vers le riz anlagen pour éliminer l'aorte. Ensuite, séparez soigneusement les deux anols du rein en utilisant les pointes de la pince.
8. Éloignez soigneusement les tissus indésirables du rein anlagen en utilisant les pointes de la pince. Veillez à ne pas endommager le mésenchyme, car les dommages peuvent entraîner une mauvaise croissance et l'exclusion de l'explant à partir d'analyses ultérieures.
9. Transférer le rein anlagen séparément à l'aide d'une pipette à microlitres et d'une pointe de pipette large-ouverte dans 10 μL de PBS au filtre à membrane en polycarbonate dans une plaque à 4 puits.
   REMARQUE: En raison de la tension de surface, l'explant sera recouvert d'une mince couche de milieu. Un filtre suffit pour deux anilènes rénaux.
   1. Placez chacun des deux anilènes rénaux au centre de chaque moitié respective du filtre. Transférer la plaque à l'incubateur à 37 ° C / 5% de CO ₂ . Laisser la plaque dans l'incubateur jusqu'à ce que la rud metanephricLes imites du prochain embryon sont prêtes à être placées sur le filtre.
10. Répétez les étapes 2.3-2.9.1 pour chaque embryon.
    REMARQUE: avec une certaine pratique, la procédure de dissection prend environ 5 min par embryon.
11. Incuber le rein anlagen pendant 3 jours à 37 ° C / 5% de CO ₂ .

3. Préparation des réactifs pour la fixation et la coloration

1. Pour préparer 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS sans calcium et magnésium (p / v), dissoudre le PFA à 60 ° C dans du PBS, en agitant continuellement. Refroidissez à température ambiante et utilisez un filtre en papier pour enlever les particules restantes. Aliquote et conservez à 4 ° C pour une utilisation immédiate ou un gel pour un stockage à long terme.
   ATTENTION: le PFA est toxique. Portez l'équipement de protection individuelle spécifié dans les normes de sécurité locales et travaillez dans une hotte aspirante. Jeter les déchets en suivant les directives institutionnelles et en utilisant les conteneurs de déchets désignés.
2. Pour préparer une solution de perméabilisation, diluer Triton X-100Dans du PBS sans calcium et magnésium à 0,3% (v / v).
3. Pour préparer une solution de blocage, ajouter 5% (v / v) de sérum de chèvre et 0,1% de Triton X-100 à PBS sans calcium et magnésium. Ajouter de l'azoture de sodium à une concentration finale de 0,02% (p / v). Conserver à 4 ° C.
   ATTENTION: L'azide de sodium est toxique. Manipuler l'azide de sodium conformément à la réglementation locale sur la sécurité et la protection de l'environnement.
   NOTE: Lorsque vous utilisez des anticorps pour la coloration, utilisez un sérum de 5% parmi les espèces dont l'anticorps secondaire a été dérivé pour obtenir une solution de blocage.
4. Diluer l'agglutinine biotinylée de Dolichorus biflorus 1: 200 dans la solution bloquant. Diluer la streptavidine conjuguée Alexa488 1: 200 dans la solution de blocage.
5. Pour préparer un milieu d'incorporation prêt à l'emploi (voir la table des matériaux), ajouter 0,1 g de mucoadhésif à base d'alcool polyvinylique à l'eau / ml à 25% (p / v) de glycerol dans du Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5) . Chauffer à 50 ° C sous agitation continue pendant 1 h, refroidir et régler le pH à 8,0-8,5 en utilisant 1M NaOH. Évitez les concentrations de NaOH plus élevées. Ajouter 100 μg / mL de N-propylgallate et thimerosal à une concentration finale de 0,02% (p / v). Mélanger pendant 30 minutes à température ambiante.
   ATTENTION: Le thimerosal est toxique. Manipulez-le conformément à la réglementation locale sur la sécurité et la protection de l'environnement.
   1. Remplissez le milieu d'incorporation dans des tubes de 50 ml, équilibrez le rotor et centrifugez à 3,200 xg et la température ambiante pendant 10 min. Décrivez la solution transparente dans des tubes de 15 mL et jeter la pastille. Aliquotez et conservez à -20 ° C pendant plusieurs semaines. Une fois décongelée, maintenir la solution à 4 ° C. Chaud à ~ 30 ° C immédiatement avant utilisation.
6. Préparez autant de diapositives en verre que les filtres avec des explants doivent être montés. Pour cela, collez deux petits lamelles, 18 x 18 mm, de chaque côté de la glissière en verre à l'aide d'un adhésif instantané, laissez un espace de ~ 15 mm pour le filtre entre les deux.

4. Fixation et coloration

1. Après une période de culture de 3Jours in vitro (div), retirer les plaques de l'incubateur et aspirer soigneusement le milieu de culture de chaque puits à l'aide d'une micropipette. Assurez-vous de ne pas toucher le filtre et de garder la pointe en direction de la paroi du puits.
2. Ajouter 500 μL de PFA à 4% / PBS à chaque puits. Les filtres flottent sur le fixateur. À l'aide d'une micropipette, ajoutez soigneusement le fixateur PFA pour immerger les filtres. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
   REMARQUE: Pour toutes les étapes suivantes, il faut prendre soin de ne pas laver les explants du filtre. Gardez l'ouverture de la pointe de la pipette vers le mur du puits.
3. Retirez le PFA et rincez deux fois avec 500 μL de PBS, en immergeant le filtre. Ajouter 500 μL de solution de perméabilisation à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 1 h.
4. Rincer deux fois avec 500 μL de PBS et ajouter 500 μl de solution bloquant à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 1 heure.
5. Remplacez la solution de blocage par250 μL d'agglutinine biotinylée de Dolichorus biflorus diluée à 1: 200 dans une solution bloquant et incubée à 4 ° C pendant 24 h.
6. Enlever la solution d'agglutinine Dolichorus biflorus et rincer deux fois avec 500 μL de PBS par puits.
7. Ajouter 250 μL de streptavidine conjuguée avec Alexa488 dilué 1: 200 dans la solution de blocage et incuber à 4 ° C pendant 24 h. Alternativement, incuber à température ambiante pendant 2 h.
   REMARQUE: Un meilleur rapport signal / bruit est obtenu lorsque l'on incube à 4 ° C.
8. Rincer deux fois avec 500 μL de PBS par puits. En utilisant une pince, transférez les filtres sur les lames de verre préparées, avec les explants vers le haut. Monter avec ~ 50-100 μL de support d'encastrement. Couvrir avec des lamelles de 60 mm de long n ° 1.5. Laisser la solution du milieu d'incorporation se solidifier pendant 2 h à température ambiante dans l'obscurité. Procédez à l'imagerie ou rangez les diapositives, emballées dans du papier d'aluminium, à 4 ° C jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'image.
9. Image avec un microscope épifluorescent large champ ^{7 <}/ Sup> couplé à une lampe Hg et utiliser une unité miroir pour l'excitation bleue (passe-bande d'excitation, 460 - 495 nm, miroir dichromatique, 505 nm et bande passante d'émission, 510 à 550 nm) et 20X lentilles Plan-Apochromat, 0,75 numériques ouverture.

Résultats

L'anlagen rénale métasphorique a été dérivé de souris enceintes enceintes Black-6 chez E11.5 et ont été cultivées. Après 3 jours, le bourgeon urétéral s'est ramifié jusqu'à 5 fois, entraînant une ramification du bourrelet urétéral initialement en forme de T. Chaque explant a été photographié et les nombres de segments et de points d'extrémité ont été quantifiés pour déterminer les générations de ramifications et pour calculer le nombre de point...

Discussion

Ce manuscrit décrit une méthode pour isoler l'anlagen méthanephrique en développement de l'embryon de souris et pour cultiver les rudiments d'organes. Cette méthode est une technique standard, développée par Grobstein ⁸ et Saxén ^{9 , 10} , et a été adaptée et modifiée par beaucoup d'autres ^{11 , 12} . Le succès de la méthode dépend principalement de la d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21331020
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140148
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040117	use for dissection
holo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T0665
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x)	Thermo Fisher Scientific	41400045
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Amphotericin B solution	Sigma-Aldrich	A2942
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Thimerosal	Sigma-Aldrich	T5125
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin	Vector Laboratories	B-1035
Alexa488 conjugated Streptavidin	Jackson Immuno Research	016-540-084
Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF	R&D Systems	496-EB
Recombinant Human IgG1 Fc, CF	R&D Systems	110-HG-100
Goat Anti-Human IgG Fc Antibody	R&D Systems	G-102-C
Phosphate buffered saline tablets	Sigma-Aldrich	P4417	use for fixation and immunostaining
Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm	agnthos.se	0208-5-PS	2 pairs of forceps are needed
Iris scissors, straight, 12 cm	agnthos.se	03-320-120
Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm	agnthos.se	08-032-130
Petri dishes Nunclo Delta treated	Thermo Fisher Scientific	150679
TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain	MerckMillipore	TMTP01300
Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom	Sigma-Aldrich	D6789-1CS
Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm	nordicbiolabs	107222
Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm	nordicbiolabs	102032
Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain	nordicbiolabs	1030418
VWR Razor Blades	VWR	55411-055
50 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430828
15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430055
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped	Sigma-Aldrich	WHA1213125
Fixed stage research mircoscope	Olympus	BX61WI
Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac	Taconic	B6-M
Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac	Taconic	B6-F
Greenough Stereo Microscope	Leica	Leica S6 E