JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن تقرير بروتوكولات مزامنة الخلية التي توفر سياق لدراسة الأحداث المتعلقة مراحل محددة من دورة الخلية. وتبين لنا أن هذا النهج مفيد لتحليل تنظيم جينات محددة في دورة الخلية غير المضطربة أو عند التعرض للعوامل التي تؤثر على دورة الخلية.

Abstract

يمثل برنامج التعبير الجيني لدورة الخلية خطوة حاسمة لفهم العمليات المعتمدة على دورة الخلية ودورها في أمراض مثل السرطان. وينظم تحليل التعبير الجيني خلية تنظيم دورة على تزامن الخلية في مراحل محددة. نحن هنا وصف طريقة باستخدام اثنين من بروتوكولات التزامن التكميلية التي تستخدم عادة لدراسة الاختلاف الدوري للتعبير الجيني خلال دورة الخلية. ويستند كلا الإجراءين على عرقلة عابرة دورة الخلية في نقطة واحدة محددة. بروتوكول التزامن من قبل العلاج هيدروكسي يوريا (هو) يؤدي إلى الاعتقال الخلوي في أواخر G1 / مرحلة مبكرة S، والإفراج عن اعتقال بوساطة هو يوفر السكان الخلوية تتقدم بشكل موحد من خلال S و G2 / M. بروتوكول التزامن من قبل ثيميدين و نوكودازول (ثي-نوك) خلايا كتل العلاج في الانقسام المبكر، والإفراج عن ثي-نوك بوساطة اعتقال يوفر السكان الخلوية متزامنة مناسبة ل G1 المرحلة و S المرحلة إنحاول الدراسات. تطبيق كلا الإجراءين يتطلب رصد ملامح توزيع دورة الخلية، والتي يتم تنفيذها عادة بعد بروديبيوم يوديد (بي) تلطيخ الخلايا وتدفق الخلوي تحليل بوساطة محتوى الحمض النووي. وتبين لنا أن الجمع بين استخدام اثنين من بروتوكولات التزامن هو نهج قوي لتحديد واضح ملامح النسخي من الجينات التي تنظم بشكل مختلف في دورة الخلية ( أي E2F1 و E2F7)، وبالتالي للحصول على فهم أفضل لدورها في دورة الخلية العمليات. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن هذا النهج هو مفيد لدراسة الآليات الكامنة وراء العلاجات القائمة على المخدرات ( أي ميتوميسين C، عامل مضاد للسرطان)، لأنه يسمح للتمييز الجينات التي تستجيب لعامل السمية الجينية من تلك المتضررة فقط من اضطرابات دورة الخلية التي يفرضها الوكيل.

Introduction

يقترن الانتقال من خلال جميع مراحل دورة الخلية إلى برنامج التعبير الجيني منظم بإحكام. ويعتقد أن هذا التنسيق "داخل وخارج" من النسخ الجيني في جميع أنحاء دورة الخلية لتكون تحت سيطرة النظم التنظيمية النسخي المعقدة، وتنظيم ليس فقط توقيت ولكن أيضا مستويات التعبير الجيني. ومن المعروف أن إزالة الضوابط من مكونات دورة الخلية الرئيسية للمساهمة في تطوير العديد من الأمراض وهو سمة راسخة جيدا من الأورام 1 ، 2 . كشفت التحاليل ترانسكريبتوميك على نطاق الجينوم التي أجريت في الخميرة وخلايا الثدييات أن عددا كبيرا من الجينات تظهر أنماط التعبير الجيني الدوري في دورة الخلية، مما يشير إلى أن التذبذب النسخي خلال دورة الخلية هو انعكاس للمتطلبات الزمنية لمنتج معين الجينات في مرحلة دقيقة 3 ، 4 ، 5 .

وهناك مهمة رئيسية في دراسة التعبير الجيني تنظيم دورة الخلية هو تزامن الخلايا في مراحل دورة الخلية محددة. تزامن الخلية يساعد على تفسير ارتباط نمط التعبير الجيني إلى مرحلة معينة مرحلة الانتقال الخلية، وقد أدى إلى فهم أفضل لتنظيم ووظيفة العديد من الجينات. تزامن الخلية هو أيضا مهم لدراسة آلية عمل الأدوية المضادة للسرطان، كما هي معروفة وكلاء العلاج الكيميائي لتؤثر على كل من التعبير الجيني وكذلك حركية دورة الخلية 6 ، 7 . ومع ذلك، فإنه غالبا ما يكون من الصعب تحديد ما إذا كانت الاختلافات التعبير الجيني الناتجة عن العلاج مع هذه العوامل هي استجابة مباشرة للعلاج أو هي مجرد نتيجة للتغيرات في ملامح دورة الخلية. للتمييز بين هذه الاحتمالات، يجب تحليل التعبير الجيني في الخلايا التي تم قينكرونيزد قبل إضافة الدواء العلاج الكيميائي.

وباستثناء بعض الخلايا الأولية مثل الخلايا اللمفاوية المعزولة حديثا، والتي تشكل خلية متجانسة من السكان متزامنة في G08 -، في المختبر أنشئت خطوط الخلايا تنمو بشكل غير متزامن في الثقافة. في ظل ظروف النمو العادية، يتم العثور على هذه الخلايا الدراجات غير متزامنة في جميع مراحل دورة الخلية ولكن، بشكل تفضيلي في G1 9 . ولذلك، فإن هذا السياق لا يوفر سيناريو الأمثل لتحليل وظيفي أو التعبير الجيني في مرحلة دورة الخلية محددة (على سبيل المثال G1، S الخ). خطوط الخلايا الخلود غير المتحولة ( مثل الخلايا الليفية) يمكن أن تكون متزامنة مع ما يسمى الأساليب الفسيولوجية 10 . وتستند هذه الأساليب على ميزات الخلية الأولية الاحتفاظ الخلايا غير المحولة، مثل تثبيط الاتصال الخلية وعامل الاعتماد الاعتماد من أجل مواصلة ركوب الدراجات. إزالةمن المصل في تركيبة مع تثبيط الاتصال يجعل الخلايا غير المحولة القبض على G0 / G1. ومع ذلك، متزامن دخول دورة الخلية والتقدم غالبا ما يتطلب ثقافة فرعية، والذي ينطوي أيضا انفصال الاصطناعي من الخلايا وإعادة طلاء 10 . الأهم من ذلك، هذه الطريقة ليست مناسبة لمزامنة خطوط الخلايا المحولة، فإن الغالبية العظمى من خطوط الخلايا المعمول بها في الوقت الحاضر في الاستخدام، تتميز لعدم وجود خلية الاتصال بوساطة تثبيط النمو أو الاستجابة لانسحاب عامل النمو. وبالتالي، فمن الواضح أن هناك حاجة إلى أساليب بديلة لتزامن الخلايا كفاءة في مراحل محددة من دورة الخلية. وبصفة عامة، فإن أساليب المزامنة الأكثر استخداما تعتمد على تثبيط كيميائي أو دوائي عابر لنقطة واحدة محددة من دورة الخلية، وعادة ما تكون تخليق الحمض النووي أو تشكيل المغزل الانقسامي. تثبيط تخليق الحمض النووي تزامن الخلايا عن طريق اعتقالهم في أواخر G1 أو مرحلة S في وقت مبكر. هذا يمكن أن يكون أتشيالتي تم تثبيتها من خلال إضافة مركبات مثل ميموسين، مثبط من النيوكليوتيدات الحيوي 11 ، 12 ، أفيديكولين، مثبط من بوليمراتس الحمض النووي 13 ، 14 ، هيدروكسيوريا، مثبط ريبوكتاز ريبونوكليوتيد 15 ، 16 أو كميات زائدة من ثيميدين 17 ، 18 . من ناحية أخرى، مثبطات البلمرة أنيبيب، مثل الكولشيسين أو نوكودازول، قادرة على منع تشكيل المغزل الانقسامية مما يؤدي إلى تزامن الخلية في وقت مبكر M المرحلة 19 ، 20 ، 21 .

في هذا العمل وصفنا طريقة تنطوي على اثنين من بروتوكولات التزامن التكميلية على أساس تثبيط الكيميائية عابرة لدراسة التعبير عن الجينات تنظيم دورة الخلية في مرنامستوى. هذه الطريقة أساسية لتحديد دور الجينات دورة الخلية في عمليات دورة الخلية محددة. وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر إطارا عاما لدراسة تأثير العلاجات المضادة للسرطان من أجل الكشف بدقة عن الجينات التي تستجيب المخدرات والتقليل من التفسيرات الخاطئة المستمدة من الاضطرابات في تطور دورة الخلية الناتجة عن هذه الأدوية.

Protocol

1. الخلوية التزامن والإفراج عن ورصد دورة الخلية التقدم

  1. Thymidine- و نوكودازول القائم (ثي-نوك) تزامن والإفراج عن خلايا U2OS من ميتوسيس
    1. إعداد المطلوبة وسط ثقافة الخلية. وتزرع الخلايا U2OS بشكل روتيني في وسط دمم الجلوتامين تكمل مع 10٪ (فول / فول) فبس (اختياري: 1٪ البنسلين / الستربتومايسين). تنفيذ جميع التحضير المتوسطة والتلاعب تحت ظروف معقمة والاحماء تكملة المتوسطة (من الآن فصاعدا المشار إليها باسم "المتوسطة كاملة") إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.
    2. البذور 2 × 10 6 خلايا U2OS لكل 100 ملم طبق في 10 مل وسط ثقافة كاملة. من أجل حساب عدد الأطباق اللازمة، تأخذ في الاعتبار أن كل طبق 100 ملم عادة ما يوفر ما يكفي من الخلايا الانقسامية لإعادة لوحة حوالي 5 آبار من لوحة 6 جيدا (0.2 - 0.25 × 10 6 خلايا / جيدا) (انظر الشكل 1B ). اثنين من الآبار في نقطة زمنية مختارة هي ريكيرإد في التجربة (1 جيدا لاستخراج الحمض النووي الريبي و 1 جيدا لرصد دورة الخلية). بالإضافة إلى ذلك، بئر ثالث يمكن جمعها في نقطة زمنية لتحليل البروتين.
      ملاحظة: خلايا اللوحة في المساء (حوالي 7 مساء) بحيث الخطوات اللاحقة يمكن القيام بها خلال ساعات العمل في الأيام التالية. قم بتضمين بئرين إضافيين للخلايا المتنامية بشكل غير متزامن لتحديد إعدادات تعويض تحليل فاكس.
    3. اسمحوا الخلايا تعلق عن طريق احتضان أطباق 100 ملم في 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ كو 2 لمدة 24 ساعة.
    4. لكتلة ثيميدين، وإعداد 200 ملي محلول ثيميدين الأسهم عن طريق إذابة 145.2 ملغ ثيميدين مسحوق في 3 مل H 2 O (أو ما يعادلها من المبالغ) وتعقيم الحل عن طريق الترشيح من خلال مرشح حجم المسام 0.2 ميكرون. قد يساعد الاحترار الطفيف على حل الثيميدين. إضافة 100 ميكرولتر من الأسهم الطازجة 200 ملم لكل طبق الثقافة 100 ملم (التركيز النهائي 2 ملم). احتضان الخلايا مع ثيميدين لمدة 20 ساعة في 3776؛ C في جو مرطب مع 5٪ كو 2 .
      ملاحظة: علاج الخلايا في المساء (حوالي 7 مساء)، لديك الوقت لأداء كل من الإفراج ثيميدين وكتلة نوكودازول في اليوم التالي.
    5. للافراج عن كتلة ثيميدين، وإزالة ثيميدين تحتوي على المتوسطة النمو في فترة ما بعد الظهر من اليوم التالي (3 مساء). غسل الخلايا مرتين مع ما قبل تحسنت 1X بس وإضافة 10 مل من المتوسطة كاملة إلى كل طبق 100 ملم. احتضان الخلايا لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ كو 2 .
    6. للاعتقال الخلية الانقسامية، إضافة نوكودازول إلى تركيز النهائي من 50 نانوغرام / مل (8 مساء). إعداد حل الأسهم عن طريق إذابة مسحوق نوكودازول في دمسو (على سبيل المثال 5 ملغ / مل) وتخزينها المجمدة في -20 درجة مئوية. احتضان الخلايا مع نوكودازول لمدة لا تزيد عن 10 - 11 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ كو 2 .
    7. الإفراج عن اعتقال بوساطة نوكودازول في مرحلة M في وقت مبكر (الانقسام الهزالي قبالة) وجمع العينات في عدة مرات البوينتس (ابتداء من الساعة 6 صباحا).
      1. فصل تقريب (الانقسامية) الخلايا عن طريق هز كل لوحة و بيبتينغ بلطف النمو التي تحتوي على نوكودازول. جمع المتوسطة مع خلايا منفصلة من كل 100 ملم لوحة في 50 مل أنابيب معقمة، وأجهزة الطرد المركزي (300 x ج، 5 دقائق، درجة حرارة الغرفة (رت)) وغسل الخلايا مرتين عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني 1X تليها الطرد المركزي. ينصح استخدام برنامج تلفزيوني بارد أو برنامج تلفزيوني زائد نوكودازول لتجنب الانقسام الانقسامي (انظر قسم المناقشة).
      2. ريسوسبيند الخلايا الانقسامية تجمع من كل لوحة 100 ملم في 10 مل من المتوسطة كاملة. حفظ 2 مل لاستخراج الحمض النووي الريبي و 2 مل للتحليل فاكس لنقطة الوقت 0 ساعة (حوالي 0.2-0.25 × 10 6 خلايا لكل عينة).
      3. إعادة لوحة الخلايا الانقسامية المتبقية لنقاط زمنية لاحقة في لوحات 6 جيدا (2 مل / حسنا، 0.2-0.25 × 10 6 خلايا / جيدا).
        ملاحظة: تذكر أنه مطلوب 2 بئر في نقطة زمنية محددة (1 ل رنا و 1 لتحليل فاكس).
    8. جمع العينات في سيلإكتد نقاط الوقت. ويوصى كل 1.5 إلى 3 ح من أجل الحصول على لمحة كافية من دورة الخلية التقدم.
      1. لاستخراج الحمض النووي الريبي، وإزالة المتوسطة، وشطف جيدا مع 2 مل قبل الحارة 1X برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من مناسبة كاشف عزل الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال تريزول) في البئر (تنفيذ هذه الخطوة الأخيرة في مجلس الوزراء سلامة للمواد الكيميائية). ماصة صعودا وهبوطا لفصل وخلايا ليز، ونقل خلية المحللة إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل، احتضان 5 دقائق في رت وتخزين أنبوب في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
      2. لتحليل فاكس، شطف جيدا مع 2 مل قبل الحارة 1X برنامج تلفزيوني، إضافة قبل تحسنت تريبسين-إدتا الحل (0.3 مل / جيدا) لفصل الخلايا، ومنع التربسين إدتا عن طريق إضافة 1 مل المتوسطة كاملة وجمع كل عينة في منفصلة أنبوب 15 مل.
        1. خلايا الطرد المركزي (300 x ج، 5 دقائق، رت)، وحفظ بيليه الخلوية وتجاهل طاف. من أجل إصلاح الخلايا، الخلايا ريسوسبيند في 1 مل من المبردة 70٪ (الخامس / الخامس) الإيثانول في برنامج تلفزيوني 1X بواسطة أنابيب فورتيكسينغ بلطف، ووضعها على الجليد للتطبيقحوالي 15 دقيقة قبل التخزين في 4 درجات مئوية أو تلطيخ لمزيد من التحليل من قبل فاكس (الموصوفة في الخطوات 1.4 - 1.5).
  2. تزامن القائم على هو وإطلاق خلايا U2OS من حدود G1 / S
    1. إعداد كامل ثقافة زراعة الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.1.
    2. بذور 0.25 × 10 6 خلايا U2OS لكل بئر في 6 لوحات جيدا (2 مل وسط ثقافة كاملة لكل بئر). من أجل حساب عدد الآبار اللازمة للتجربة، تأخذ في الاعتبار أنه سيكون مطلوبا 2 بئر في نقطة زمنية مختارة (1 بئر لاستخراج الحمض النووي الريبي و 1 بئر لرصد دورة الخلية) وأن 2 بئر إضافية من الخلايا المتنامية بشكل غير متزامن تحتاج إلى تحديد إعدادات تعويض تحليل فاكس.
    3. السماح للخلايا تعلق عن طريق احتضان لوحات 6 جيدا بين عشية وضحاها (O / N) عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ كو 2 .
    4. إزالة المتوسطة كاملة من الآبار صباح اليوم التالي وإضافة 2 ملمن قبل تحسنت فبس خالية دمم الجلوتامين المتوسطة لكل بئر. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ كو 2 .
      ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة في جميع الآبار باستثناء 2 (تلك المحفوظة لتعريف إعدادات فاكس). يمكن حذف خطوة انسحاب المصل إذا تم تحقيق التزامن الفعال عن طريق ببساطة احتضان الخلايا مع هو.
    5. G1 / S اعتقال دورة الخلية مع هو.
      1. إعداد الطازجة حل الأسهم هو (500 ملم) قبل كل استخدام. إضافة 2 مل H 2 O إلى 76.06 ملغ من مسحوق هو وتخلط حتى يذوب تماما. تعقيم الحل عن طريق الترشيح من خلال 0.2 ميكرون مرشح حجم المسام. مزيج 50 مل من المتوسطة كاملة مع 400 ميكرولتر من مرشح تعقيم هو حل الأسهم لتركيز النهائي هو من 4 ملم.
      2. إزالة المتوسطة من جميع الآبار باستثناء من اثنين من الآبار اللازمة لتحديد إعدادات نظام مراقبة الأصول الميدانية واستبدالها مع الطازجة 4 ملي هو يحتوي على المتوسطة الكاملة (2 مل / بئر).
      3. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة فيهو التي تحتوي على المتوسطة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ كو 2 .
    6. الافراج عن الخلايا من اعتقال بوساطة هو. إزالة المتوسطة التي تحتوي على هو من الآبار وشطف الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت 1X بس (2 مل في كل مرة). إضافة 2 مل من المتوسطة كاملة لكل بئر. جمع 2 عينات لنقطة الوقت 0 ساعة (1 لاستخراج الحمض النووي الريبي و 1 للتحقق من دورة الخلية التحقق من قبل فاكس) فضلا عن 2 عينات حفظها لإعدادات فاكس. مكان الآبار المتبقية في الحاضنة.
    7. جمع عينات كل 1.5 إلى 3 ساعة من أجل الحصول على توزيع كاف من دورة الخلية التقدم. في كل نقطة زمنية، إجراء معالجة العينات (لاستخراج الحمض النووي الريبي وتحليل فاكس) كما هو موضح في 1.1.8.1-1.1.8.2.
  3. العلاج مع العوامل الضارة دنا
    ملاحظة: كلما كان الهدف هو توضيح تأثير مركب (على سبيل المثال عوامل دنا الضارة) في أحداث دورة الخلية، يمكن لأي من أساليب المزامنة الموصوفة سابقا أن تكونجنبا إلى جنب مع علاج الخلايا مع وكيل السمية الجينية. من أجل اختيار طريقة التزامن، من المهم النظر في مرحلة من دورة الخلية التي نود أن تحليلها. بشكل عام، قد يكون الإجراء ثي-نوك مناسب لدراسة تأثير مركب في مرحلة G1 أو مرحلة S دخول بينما المزامنة بوساطة هو قد تكون أكثر ملاءمة لدراسة تأثير في S إلى G2 مراحل أو في دخول إلى الانقسام.
    1. تحليل تأثير العوامل السمية الجينية في مرحلة G1 أو دخول المرحلة S
      1. مزامنة الخلايا كما هو موضح في 1.1.2. إلى 1.1.6.
      2. إطلاق الخلايا من نوكودازول وإعادة لوحة لهم كما هو موضح في 1.1.7. احتضان لهم عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ كو 2 لمدة 3 ساعات للسماح لهم إرفاق قبل إضافة عامل (فترة الحضانة المطلوبة قد تختلف اعتمادا على خط الخلية).
      3. إضافة وكيل وجمع العينات كما هو موضح سابقا في 1.1.8.
    2. تحليل تأثير العوامل السامة في سغ2 مراحل أو M دخول
      1. مزامنة الخلايا كما هو موضح في 1.2.2. إلى 1.2.5.
      2. الافراج عن الخلايا من هو كما هو موضح في 1.2.6. وإضافة وكيل على الفور.
      3. جمع العينات كما هو موضح سابقا في 1.8.
  4. رصد تزامن الخلية والتقدم من خلال دورة الخلية بواسطة يوديد بروبيديوم (بي) تلطيخ وتحليل فاكس
    مالحظة: يمكن تخزين العينات التي يتم جمعها في كل األوقات جنبا إلى جنب مع العينات المطلوبة لتحديد إعدادات فاكس عند درجة حرارة 4 مئوية بمجرد أن تكون ثابتة) كما هو مذكور في 1.1.8.2 (. أداء تلطيخ مع حل بي تليها تحليل فاكس لجميع العينات من التجربة في وقت واحد. بي يقحم في الأخدود الرئيسي من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل إنتاج إشارة الفلورسنت عالية عندما متحمس في 535 نانومتر مع ذروة انبعاث واسع حوالي 600 نانومتر. منذ بي يمكن أيضا ربط رنا المزدوج تقطعت بهم السبل، فمن الضروري لعلاج الخلايا مع ريبونوكلياز لقرار الحمض النووي الأمثل.
    1. إعداد طازجة بي حل تلطيخ. ويمكن إعداد حل الأسهم بي عن طريق حل مسحوق بي في برنامج تلفزيوني (على سبيل المثال 5 ملغ / مل). تخزين محلول المخزون في 4 درجات مئوية (في الظلام). ويتكون حل تلطيخ من بي (140 ميكرومتر)، سيترات الصوديوم (38 ملم) و تريتون X-100 (0.01٪ الخامس / الخامس).
    2. الاحماء سطح مناسب ( مثل الفرن) إلى 37 درجة مئوية.
    3. خلايا الطرد المركزي الثابتة (450 x ج، 5 دقائق، رت)، طاف صب (الإيثانول) ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X.
    4. خلايا الطرد المركزي مرة أخرى، وإزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 300 ميكرولتر من حل تلطيخ بي لكل عينة (باستثناء واحد من عينات لإعدادات فاكس؛ إضافة برنامج تلفزيوني لهذه العينة بدلا من ذلك).
    5. نقل الخلايا إلى أنابيب فاكس (5 مل أنابيب البوليسترين جولة القاع).
    6. إضافة 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز لكل عينة، مزيج واحتضان عينات لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 37 درجة مئوية. يمكن تخزين العينات محمية من الضوء في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 2 - 3 أيام.
    7. تحليل محتوى الحمض النووي في العينات عن طريق التدفقالخلوي. تحديد إعدادات تعويض تحليل فاكس مع عينة غير متزامنة بي المتلألئة. استخدام عينة فارغة (دون حل تلطيخ بي) للتحقق من تألق ذاتي. أساسيات بي تلطيخ بوساطة تحليل محتوى الحمض النووي عن طريق التدفق الخلوي وقد سبق وصفها 9 .
  5. تحديد مؤشر الانقسامية من قبل المزدوج فسفو-H3 (سر 10) / بي تلطيخ
    ملاحظة: الخلايا التي تمر الانقسام يمكن الكشف عنها بسهولة عن طريق التدفق الخلوي مع الأجسام المضادة المحددة ل H3 فوسفو هيستون في سيرين 10 (pH3). تلطيخ بي يصاحب ذلك هو مفيد لتحديد توزيع الحمض النووي على أساس المحتوى من السكان الخلية. مطلوب 5 عينات من أجل التشكيلات المثلى لإعدادات فاكس: فارغة، بي فقط، pH3 فقط، الثانوية الأجسام المضادة فقط وتلطيخ مزدوج.
    1. خلايا الطرد المركزي الثابتة (450 x ج، 5 دقائق، 4 درجات مئوية) وتجاهل طاف. يتم وصف الخطوات التالية لأداء تلطيخ في أنابيب 15 مل.
    2. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1مل بس-T (بس + 0.05٪ توين -20) إلى بيليه وأجهزة الطرد المركزي (450 x ج، 5 دقائق، 4 درجات مئوية). إزالة طاف.
    3. إضافة الأجسام المضادة المضادة لل PH3 المخفف (1: 500) في 100-200 ميكرولتر من بس-T + 3٪ بسا، واحتضان مع هزاز لمدة 2 ساعة في رت (أو O / N عند 4 درجات مئوية).
    4. إضافة 2 مل بس-T (بس + 0.05٪ توين -20) وأجهزة الطرد المركزي (450 x ج، 5 دقائق، 4 درجات مئوية). إزالة طاف.
    5. يغسل مرة أخرى عن طريق إضافة 2 مل بس-T إلى بيليه، وأجهزة الطرد المركزي وتجاهل طاف.
    6. إضافة الأجسام المضادة الثانوية (المضادة للأرنب أليكسافلور 488 في حالة الجسم المضاد PH3 المحدد) المخفف (1: 500) في 100-200 ميكرولتر من بس-T + 3٪ بسا واحتضان مع هزاز لمدة 1 ساعة في رت (أو O / N في 4 درجات مئوية). حماية عينات من الضوء.
    7. غسل مرتين مع بس-T (2 مل) بواسطة الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 1.5.4.
    8. أداء تلطيخ بي كما هو موضح (الخطوات 1.4.1 إلى 1.4.6).

2. جمع العينات والعمليات لتحليل الجينات التعبير

  1. يأخذ1.5 مل عينات ميكروسنتريفوج في كاشف العزلة الحمض النووي الريبي من الفريزر والسماح لهم ذوبان الجليد في رت داخل مجلس الوزراء السلامة للمواد الكيميائية.
  2. إضافة 400 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل عينة ويهز بقوة (ولكن لا دوامة) حتى خلط كامل. احتضان عينات لمدة 5 دقائق في رت.
  3. أنابيب الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة (≥8،000 x ج، 4 درجات مئوية) في ميكروسنتريفوج بينشتوب.
  4. نقل المرحلة المائية (العليا) إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل جديد وتسجيل حجم نقلها (من أجل تبسيط الإجراء، فمن المستحسن لجمع كميات متساوية في جميع عينات من التجربة).
  5. إضافة 1 حجم من الايثانول بنسبة 100٪ ببطء (قطرة عن طريق قطرة) إلى المرحلة المائية أثناء الخلط. لا أجهزة الطرد المركزي.
  6. قم بتنفيذ الخطوات التالية مع مجموعة الإعدادية ميني رنا. الماصة تصل إلى 700 ميكرولتر من كل عينة، بما في ذلك أي راسب التي قد تشكلت، في عمود تدور في أنبوب جمع 2 مل (المقدمة من قبل الشركة المصنعة).
  7. أقفل الغطاء وطرد مركزي (≥ 8000 غرام، رت) لمدة 15 ثانية. تجاهل تدفق من خلال. كرر الخطوة السابقة مع العينة المتبقية (إن وجدت).
  8. اتبع مانوفاتوريتس 'تعليمات لغسل الحمض النووي الريبي وشطف (أزل كل عينة في 30 - 40 ميكرولتر نوكليس خالية H 2 O من أجل تحقيق تركيز الحمض النووي الريبي المناسب للخطوة التالية).
  9. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي ونقاء العينات عن طريق قياسات الامتصاصية ( A 260/280 نسبة 2.0-2.1 يدل على نقاء جيد من عينة الحمض النووي الريبي). تخزين عينات الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية حتى استخدام تحليل رت-قر.
  10. لتحويل الحمض النووي الريبي إلى [كدنا] واللاحقة الكمي ير، واتخاذ 1 ميكروغرام رنا لكل عينة وإعداد رد فعل ريتروترانسكريبتاس وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. الحصول على عينات [كدنا] يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية (لبضعة أيام) أو في -20 درجة مئوية (لفترات أطول من الزمن).
    ملاحظة: إعداد عينة، تصميم التمهيدي واعتبارات أخرى في الوقت الحقيقي ير تم السابقينوصفت بشكل مكثف في الأدب 22 ، 23 .

النتائج

تمثيل تخطيطي للبروتوكولات الخاصة بك و هي-هو لتزامن الخلية.

يلخص الشكل 1 الخطوات المطلوبة لتزامن خلية U2OS وجمع العينات اللاحقة من أجل التحقق من التقدم من خلال دورة الخلية وإجراء تحليلات ا...

Discussion

ويتطلب تحليل الجينات المنظمة الدقيقة التي تنطوي على أدوار عابرة ومحددة في دورة الخلية وجود خلية موحدة. يستخدم العديد من الباحثين بشكل روتيني خطوط الخلايا السرطانية الطويلة الأمد لهذه الأغراض، وقد تم تطوير مجموعة متنوعة من الأساليب للحصول على سكان الخلية المتزامنة ...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

ونشكر أعضاء مختبرات زوبياغا ومختبرات ألتمير على المناقشات المفيدة والدعم التقني. وأيد هذا العمل من خلال منح مقدمة من الوزارة الإسبانية (SAF2015-67562-R، مينيكو / فيدر، إي)، وحكومة الباسك (IT634-13 و كك-2015/89)، وجامعة الباسك أوب / إهو ( UFI11 / 20).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, high glucose, GutaMAX supplementThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, qualified, E.U.-approved, South America originThermo Fisher Scientific10270-106
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol redThermo Fisher Scientific25200-072
ThymidineSIGMAT1895-5GFreshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine.
NocodazoleSIGMAM-1404Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots
HydroxyureaSIGMAH8627Freshly prepared
Mitomycin C from Streptomyces caespitosusSIGMAM42871.5 mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4 ºC
Dimethyl sulfoxideSIGMAD2650
Propidium iodideSIGMAP4170Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4 º C protected from light.
PBS pH 7.6Home made
EthanolPANREACA3678,2500
ChloroformSIGMAC2432
Sodium CitratePANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAse AThermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol ReagentLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher Scientific4368814
Anti-Cyclin E1 antibodyCell Signaling41291:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-Cyclin B1 antibodyCell Signaling41351:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-β-actinSIGMAA-54411:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antibotyMillipore06-570Specified in the protocol
Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibodyInvitrogenR37116Specified in the protocol
Secondary anti-mouse-HRP antibodySanta Cruz Biotechnologysc-36971:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Forward E2F1 antibody (human)                    TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F1 antibody (human)                    CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward E2F7 antibody (human)                    GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F7 antibody (human)                    TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 antibody (human)                    AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 antibody (human)                    TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP antibody (human) reference gene                    BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse TBP antibody (human)                    BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L antibody (human) reference gene   CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                 BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L  antibody (human)    CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
FACS Tubes Sarstedt551578
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher ScientificN8010560
Corning 100 mm TC-Treated Culture DishCorning
Corning Costar cell culture plates 6 wellCorning3506
Refrigerated Bench-Top MicrocentrifugeEppendorf5415 R
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop Lite SpectrophotometerThermo ScientificND-LITE-PR
BD FACSCalibur Flow CytometerBD Bioscience
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificA28567

References

  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, R. J., et al. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. Nat Genet. 27 (1), 48-54 (2001).
  4. Peña-Diaz, J., et al. Transcription profiling during the cell cycle shows that a subset of Polycomb-targeted genes is upregulated during DNA replication. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2846-2856 (2013).
  5. Grant, G. D., et al. Identification of cell cycle-regulated genes periodically expressed in U2OS cells and their regulation by FOXM1 and E2F transcription factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3634-3650 (2013).
  6. Minderman, H., et al. In vitro and in vivo irinotecan-induced changes in expression profiles of cell cycle and apoptosis-associated genes in acute myeloid leukemia cells. Mol Cancer Ther. 4 (6), 885-900 (2005).
  7. McKenna, E., Traganos, F., Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence. Cell Cycle. 11 (16), 3132-3140 (2012).
  8. Infante, A., et al. E2F2 represses cell cycle regulators to maintain quiescence. Cell Cycle. 7 (24), 3915-3927 (2008).
  9. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of cell cycle position in mammalian cells. J Vis Exp. (59), (2012).
  10. Schorl, C., Sedivy, J. M. Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells. Methods. 41 (2), 143-150 (2007).
  11. Lalande, M. A reversible arrest point in the late G1 phase of the mammalian cell cycle. Exp Cell Res. 186 (2), 332-339 (1990).
  12. Park, S. Y., et al. Mimosine arrests the cell cycle prior to the onset of DNA replication by preventing the binding of human Ctf4/And-1 to chromatin via Hif-1α activation in HeLa cells. Cell Cycle. 11 (4), 761-766 (2012).
  13. Ikegami, S., et al. Aphidicolin prevents mitotic cell division by interfering with the activity of DNA polymerase-alpha. Nature. 275 (5679), 458-460 (1978).
  14. Baranovskiy, A. G., et al. Structural basis for inhibition of DNA replication by aphidicolin. Nucleic Acids Res. 42 (22), 14013-14021 (2014).
  15. Adams, R. L., Lindsay, J. G. Hydroxyurea reversal of inhibition and use as a cell-synchronizing agent. J Biol Chem. 242 (6), 1314-1317 (1967).
  16. Mitxelena, J., Apraiz, A., Vallejo-Rodríguez, J., Malumbres, M., Zubiaga, A. M. E2F7 regulates transcription and maturation of multiple microRNAs to restrain cell proliferation. Nucleic Acids Res. , (2016).
  17. Bootsma, D., Budke, L., Vos, O. Studies on synchronous division of tissue culture cells initiated by excess thymidinE. Exp Cell Res. 33, 301-309 (1964).
  18. Galgano, P. J., Schildkraut, C. L. G1/S Phase Synchronization using Double Thymidine Synchronization. CSH Protoc. (2), (2006).
  19. Edwin Taylor, W. Kinetics of inhibition and the binding of h3-colchicine. J Cell Biol. 25, 145-160 (1965).
  20. Zieve, G. W., Turnbull, D., Mullins, J. M., McIntosh, J. R. Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells. Exp Cell Res. 126 (2), 397-405 (1980).
  21. Matsui, Y., Nakayama, Y., Okamoto, M., Fukumoto, Y., Yamaguchi, N. Enrichment of cell populations in metaphase, anaphase, and telophase by synchronization using nocodazole and blebbistatin: a novel method suitable for examining dynamic changes in proteins during mitotic progression. Eur J Cell Biol. 91 (5), 413-419 (2012).
  22. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  23. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 39 (2), 145-154 (2011).
  24. Abbas, T., Dutta, A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat Rev Cancer. 9 (6), 400-414 (2009).
  25. Kung, A. L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (24), 9553-9557 (1990).
  26. Borel, F., Lacroix, F. B., Margolis, R. L. Prolonged arrest of mammalian cells at the G1/S boundary results in permanent S phase stasis. J Cell Sci. 115 (Pt. 14, 2829-2838 (2002).
  27. Knehr, M., et al. A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in specific cell cycle phases). Exp Cell Res. 217 (2), 546-553 (1995).
  28. Zhu, W., Giangrande, P. H., Nevins, J. R. E2Fs link the control of G1/S and G2/M transcription. EMBO J. 23 (23), 4615-4626 (2004).
  29. Whitcomb, E. A., Dudek, E. J., Liu, Q., Taylor, A. Novel control of S phase of the cell cycle by ubiquitin-conjugating enzyme H7. Mol Biol Cell. 20 (1), 1-9 (2009).
  30. Bruinsma, W., Macurek, L., Freire, R., Lindqvist, A., Medema, R. H. Bora and Aurora-A continue to activate Plk1 in mitosis. J Cell Sci. 127, 801-811 (2014).
  31. Thomas, D. B., Lingwood, C. A. A model of cell cycle control: effects of thymidine on synchronous cell cultures. Cell. 5 (1), 37-42 (1975).
  32. Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol Biol Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  33. Lim, S., Cdks Kaldis, P. cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation. Development. 140 (15), 3079-3093 (2013).
  34. Tapia, C., et al. Two mitosis-specific antibodies, MPM-2 and phospho-histone H3 (Ser28), allow rapid and precise determination of mitotic activity. Am J Surg Pathol. 30 (1), 83-89 (2006).
  35. Andreassen, P. R., Martineau, S. N., Margolis, R. L. Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state. Mutat Res. 372 (2), 181-194 (1996).
  36. Wei, F., Xie, Y., He, L., Tao, L., Tang, D. ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation. Cell Signal. 23 (1), 259-268 (2011).
  37. Kubota, S., et al. Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage. J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).
  38. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  39. St-Denis, N. A., Derksen, D. R., Litchfield, D. W. Evidence for regulation of mitotic progression through temporal phosphorylation and dephosphorylation of CK2alpha. Mol Cell Biol. 29 (8), 2068-2081 (2009).
  40. Min, A., et al. RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib. Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124 E2F

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved