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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir berichten über zwei Zellsynchronisationsprotokolle, die einen Kontext für das Studium von Ereignissen im Zusammenhang mit bestimmten Phasen des Zellzyklus bieten. Wir zeigen, dass dieser Ansatz für die Analyse der Regulation von spezifischen Genen in einem ungestörten Zellzyklus oder bei Exposition gegenüber Mitteln, die den Zellzyklus beeinflussen, nützlich ist.

Zusammenfassung

Das Genexpressionsprogramm des Zellzyklus stellt einen kritischen Schritt zum Verständnis von zellzyklusabhängigen Prozessen und deren Rolle bei Krankheiten wie Krebs dar. Die zellzyklusregulierte Genexpressionsanalyse hängt von der Zellsynchronisation in spezifische Phasen ab. Hier beschreiben wir eine Methode, die zwei komplementäre Synchronisationsprotokolle verwendet, die üblicherweise zum Studieren einer periodischen Variation der Genexpression während des Zellzyklus verwendet werden. Beide Verfahren basieren auf einer vorübergehenden Blockierung des Zellzyklus in einem definierten Punkt. Das Synchronisationsprotokoll durch Hydroxyharnstoffbehandlung (HU) führt zu einem zellulären Arrest in der späten G1 / frühen S-Phase, und die Freisetzung aus dem HU-vermittelten Arrest liefert eine zelluläre Population, die gleichmäßig durch S und G2 / M fortschreitet. Das Synchronisationsprotokoll durch Thymidin- und Nocodazol (Thy-Noc) -Behandlung blockiert Zellen in der frühen Mitose und die Freisetzung von Thy-Noc-vermittelten Arrest liefert eine synchronisierte zelluläre Population, die für die G1-Phase und die S-Phase-en geeignet istVersuche Studien. Die Anwendung beider Verfahren erfordert die Überwachung der Zellzyklusverteilungsprofile, die typischerweise nach der Propidiumjodid (PI) -Färbung der Zellen und der Durchflusszytometrie-vermittelten Analyse des DNA-Gehalts durchgeführt wird. Wir zeigen, dass die kombinierte Verwendung von zwei Synchronisationsprotokollen ein robuster Ansatz ist, um die Transkriptionsprofile von Genen, die im Zellzyklus unterschiedlich reguliert sind ( dh E2F1 und E2F7), klar zu bestimmen und folglich ein besseres Verständnis ihrer Rolle im Zellzyklus zu haben Prozesse. Darüber hinaus zeigen wir, dass dieser Ansatz für die Untersuchung von Mechanismen, die Drogen-basierten Therapien ( dh Mitomycin C, ein Antikrebsmittel) zugrunde liegen, nützlich ist, da es erlaubt, Gene zu unterscheiden, die auf das genotoxische Mittel reagieren, von denen, die nur von Zellzyklus-Störungen betroffen sind Verhängt durch den agent

Einleitung

Der Übergang durch alle Phasen des Zellzyklus ist an ein streng reguliertes Genexpressionsprogramm gekoppelt. Dieses koordinierte "On und Off" der Gen-Transkription im gesamten Zellzyklus wird vermutlich unter der Kontrolle von komplexen Transkriptionsregulationssystemen liegen, was nicht nur das Timing, sondern auch die Ebenen der Genexpression reguliert. Die Deregulierung von Schlüssel-Zell-Zyklus-Komponenten ist bekannt, um zur Entwicklung von mehreren Krankheiten beitragen und ist ein etabliertes Kennzeichen der Tumorigenese 1 , 2 . Genom-weite transkriptomische Analysen, die in Hefe- und Säugetierzellen durchgeführt wurden, haben ergeben, dass eine große Anzahl von Genen periodische Genexpressionsmuster im Zellzyklus aufweisen, was darauf hindeutet, dass die Transkriptionsfluktuation während des Zellzyklus eine Reflexion der zeitlichen Anforderung eines gegebenen Genprodukts ist In einer präzisen Phase 3 , 4 , 5

Eine wesentliche Aufgabe bei der Untersuchung der zellzyklusregulierten Genexpression ist die Synchronisation von Zellen in spezifische Zellzyklusphasen. Die Zellsynchronisation hilft, die Assoziation eines Genexpressionsmusters auf einen bestimmten Zellzyklus-Phasenübergang zu interpretieren, und es hat zu einem besseren Verständnis der Regulation und Funktion zahlreicher Gene geführt. Die Zellsynchronisation ist auch wichtig für die Untersuchung des Wirkmechanismus von Antikrebsarzneimitteln, da bekannt ist, dass Chemotherapeutika sowohl die Genexpression als auch die Zellzykluskinetik 6 , 7 beeinflussen. Trotzdem ist es oft schwierig zu bestimmen, ob die aus der Behandlung mit diesen Mitteln resultierenden Genexpressionsdifferenzen eine direkte Reaktion auf die Behandlung sind oder lediglich die Folge von Veränderungen der Zellzyklusprofile sind. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, sollte die Genexpression in Zellen analysiert werden, die s gewesen sindYnchronisiert vor der Zugabe des chemotherapeutischen Arzneimittels.

Mit Ausnahme von einigen primären Zellen wie frisch isolierten lymphatischen Zellen, die eine homogene Zellpopulation darstellen, die in G0 8 synchronisiert ist, wachsen in vitro etablierte Zelllinien asynchron in Kultur. Unter regelmäßigen Wachstumsbedingungen finden sich diese asynchron zyklischen Zellen in allen Phasen des Zellzyklus, aber bevorzugt in G1 9 . Daher bietet dieser Kontext kein optimales Szenario für Funktions- oder Genexpressionsanalysen in einer bestimmten Zellzyklusphase ( zB G1, S etc.). Nicht transformierte immortalisierte Zelllinien ( zB Fibroblasten) können mit sogenannten physiologischen Methoden synchronisiert werden 10 . Diese Methoden basieren auf den beibehaltenen primären Zellmerkmalen von nicht-transformierten Zellen, wie z. B. Zell-Kontakt-Inhibition und Wachstumsfaktor-Abhängigkeit, um den Zyklus fortzusetzen. EntfernungDes Serums in Kombination mit Kontaktinhibierung macht nicht-transformierte Zellen bei G0 / G1 verhaftet. Der synchronisierte Zellzykluseintrag und die Progression erfordert jedoch oft eine Subkultur, die auch eine künstliche Ablösung der Zellen und eine erneute Plattierung beinhaltet. Am wichtigsten ist, dass dieses Verfahren nicht für die Synchronisation von transformierten Zelllinien geeignet ist, wobei die überwiegende Mehrheit der etablierten Zelllinien, die gegenwärtig verwendet werden, dadurch gekennzeichnet ist, dass sie keine Zellkontakt-vermittelte Wachstumshemmung oder Reaktion auf Wachstumsfaktorentzug haben. So ist es klar, dass alternative Verfahren für eine effiziente Zellsynchronisation in bestimmten Phasen des Zellzyklus erforderlich sind. Im Allgemeinen basieren die am häufigsten verwendeten Synchronisationsmethoden auf einer transienten chemischen oder pharmakologischen Hemmung eines definierten Punktes des Zellzyklus, typischerweise DNA-Synthese oder mitotischer Spindelbildung. Die Hemmung der DNA-Synthese synchronisiert die Zellen, indem sie sie in der späten G1- oder frühen S-Phase festnehmen. Das kann achi seinDurch die Zugabe von Verbindungen wie Mimosin, einem Inhibitor der Nukleotidbiosynthese 11 , 12 , Aphidicolin, einem Inhibitor der DNA-Polymerasen 13 , 14 , Hydroxyharnstoff, einem Inhibitor der Ribonukleotidreduktase 15 , 16 oder durch überschüssige Mengen an Thymidin 17 , 18, Andererseits sind Inhibitoren der Mikrotubuluspolymerisation, wie Colchicin oder Nocodazol, in der Lage, die mitotische Spindelbildung zu blockieren, die zu einer Zellsynchronisation in der frühen M-Phase 19 , 20 , 21 führt .

In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode, die zwei komplementäre Synchronisationsprotokolle umfasst, die auf einer transienten chemischen Inhibition basieren, um die Expression von zellzyklusregulierten Genen an der mRNA zu untersuchenEbene. Diese Methode ist grundlegend für die Definition der Rolle von Zellzyklus-Genen in bestimmten Zellzyklus-Prozesse. Darüber hinaus bietet es einen allgemeinen Rahmen für das Studium der Auswirkungen von Antikrebs-Behandlungen, um genau zu erkennen, Droge reagierende Gene und zu minimieren Fehlinterpretationen aus Störungen in Zellzyklus Progression von diesen Medikamenten generiert abgeleitet.

Protokoll

1. Zelluläre Synchronisation, Freigabe und Überwachung der Zellzyklusprogression

  1. Thymidin- und Nocodazol-basierte (Thy-Noc) Synchronisation und Freisetzung von U2OS-Zellen aus Mitose
    1. Bereiten Sie das erforderliche Zellkulturmedium vor. U2OS-Zellen werden routinemäßig in DMEM-Glutamin-Medium, ergänzt mit 10% (vol / vol) FBS (optional: 1% Penicillin / Streptomycin), gezüchtet. Führen Sie die mittlere Vorbereitung und Manipulation unter sterilen Bedingungen durch und erwärmen Sie das komplementierte Medium (von nun an als "komplettes Medium") bis 37 ° C vor dem Gebrauch aufwärmen.
    2. Samen 2 x 10 6 U2OS Zellen pro 100 mm Schale in 10 ml vollständigem Kulturmedium. Um die Anzahl der benötigten Speisen zu berechnen, ist zu berücksichtigen, dass jede 100-mm-Schale typischerweise genügend mitotische Zellen bereitstellt, um etwa 5 Vertiefungen einer 6-Well-Platte (0,2 - 0,25 x 10 & sup6; Zellen / Vertiefung) wieder aufzubauen (siehe Fig 1B ). Zwei Brunnen pro ausgewählter Zeitpunkt sind requirIm Experiment (1 Well für RNA Extraktion und 1 Well für Zellzyklusüberwachung). Zusätzlich kann eine dritte Vertiefung pro Zeitpunkt für die Proteinanalyse gesammelt werden.
      HINWEIS: Tellerzellen am Abend (ca. 19 Uhr), so dass nachfolgende Schritte während der Arbeitszeit in den folgenden Tagen durchgeführt werden können. Include 2 zusätzliche Brunnen von asynchron wachsenden Zellen, um die FACS-Analysekompensationseinstellungen zu definieren.
    3. Lassen Sie die Zellen durch Inkubieren von 100 mm-Schalen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 für 24 h anhängen.
    4. Für den Thymidinblock wird eine 200 mM Thymidin-Stammlösung durch Auflösen von 145,2 mg Thymidinpulver in 3 ml H 2 O (oder äquivalenten Mengen) hergestellt und die Lösung durch Filtration durch ein 0,2 μm Porengrßenfilter sterilisiert. Leichte Erwärmung könnte helfen, Thymidin aufzulösen. 100 μl des frisch zubereiteten 200 mM Stammes zu jeder 100 mm Kulturschale (Endkonzentration 2 mM) geben. Inkubieren von Zellen mit Thymidin für 20 h bei 3776, C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 .
      HINWEIS: Behandeln Sie Zellen am Abend (um 7 Uhr), um Zeit zu haben, sowohl Thymidin-Freisetzung als auch Nocodazol-Block am nächsten Tag durchzuführen.
    5. Um aus dem Thymidin-Block freizusetzen, entfernen Sie Thymidin-haltiges Wachstumsmedium am Nachmittag des folgenden Tages (15 Uhr); Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmtem 1x PBS und fügen Sie 10 ml vollständiges Medium zu jeder 100 mm Schale hinzu. Inkubieren von Zellen für 5 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 .
    6. Für den mitotischen Zellarrest fügen Sie Nocodazol zu einer Endkonzentration von 50 ng / ml (20 Uhr) hinzu. Eine Stammlösung durch Auflösen von Nocodazolpulver in DMSO ( zB 5 mg / ml) zubereiten und bei -20 ° C gefroren aufbewahren. Inkubieren von Zellen mit Nocodazol für nicht länger als 10 - 11 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 .
    7. Freisetzung aus dem Nocodazol-vermittelten Arrest in der frühen M-Phase (mitotisches Shake-off) und Sammlung von Proben zu mehrmals poiNts (ab 6-7 Uhr).
      1. Abgerundete (mitotische) Zellen durch Schütteln jeder Platte und sanftes Pipettieren von nocodazolhaltigem Wachstumsmedium abziehen. Sammeln Sie das Medium mit abgelösten Zellen von jeder 100 mm-Platte in 50 ml sterile Röhrchen, zentrifugieren Sie (300 xg, 5 min, Raumtemperatur (RT)) und waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie 1x PBS hinzufügen, gefolgt von Zentrifugation. Die Verwendung von kaltem PBS oder PBS plus Nocodazol wird empfohlen, um mitotischen Schlupf zu vermeiden (siehe Diskussionsteil).
      2. Resonieren Sie mitotische Zellen, die aus jeder 100 mm Platte in 10 ml vollständigem Medium gewonnen wurden. Sparen Sie 2 ml für die RNA-Extraktion und 2 ml für die FACS-Analyse für den 0-h-Zeitpunkt (ca. 0,2-0,25 x 10 6 Zellen pro Probe).
      3. Wiederholte verbleibende mitotische Zellen für nachfolgende Zeitpunkte in 6-Well-Platten (2 ml / Vertiefung, 0,2-0,25 x 10 & sup6; Zellen / Vertiefung).
        HINWEIS: Denken Sie daran, dass 2 ausgewählte Zeitpunkte (1 für RNA und 1 für die FACS-Analyse) benötigt werden.
    8. Sammle Proben bei selZeitpunkte. Alle 1,5 bis 3 h werden empfohlen, um ein adäquates Profil der Zellzyklusprogression zu erhalten.
      1. Für die RNA-Extraktion, entfernen Sie das Medium, spülen Sie gut mit 2 ml vorwärmenden 1x PBS aus und fügen Sie 1 ml des geeigneten RNA-Isolationsreagenzes ( zB TRIzol) in den Brunnen hinzu (führen Sie diesen letzten Schritt in einem Sicherheitsschrank für Chemikalien) durch. Pipettieren Sie nach oben und unten, um Zellen zu lindern und zu lysieren, übertragen Sie das Zelllysat in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, inkubieren Sie 5 min bei RT und speichern Sie das Röhrchen bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
      2. Für die FACS-Analyse mit 2 ml vorwärmendem 1x PBS gut ausspülen, vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung (0,3 ml / Vertiefung) abgeben, um Zellen zu entfernen, Trypsin-EDTA zu blockieren, indem man 1 ml vollständiges Medium zugibt und jede Probe in einem separaten sammelt 15 ml Rohr.
        1. Zentrifugen von Zellen (300 xg, 5 min, RT), retten zelluläres Pellet und verwerfen den Überstand. Um Zellen zu fixieren, werden die Zellen in 1 ml gekühltem 70% (v / v) Ethanol in 1x PBS durch sanftes Vortexen von Röhrchen resuspendiert und auf Eis gelegtEtwa 15 min vor der Lagerung bei 4 ° C oder zur Färbung zur weiteren Analyse durch FACS (beschrieben in den Schritten 1.4 - 1.5).
  2. HU-basierte Synchronisation und Freisetzung von U2OS-Zellen aus G1 / S-Grenze
    1. Vorbereiten des vollständigen Zellkulturmediums, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
    2. Samen 0,25 x 10 & sup6; U2OS-Zellen pro Vertiefung in 6-Well-Platten (2 ml vollständiges Kulturmedium pro Vertiefung). Um die für das Experiment benötigte Anzahl von Bohrlöchern zu berechnen, ist zu berücksichtigen, dass für einen ausgewählten Zeitpunkt 2 Vertiefungen erforderlich sind (1 Well für die RNA-Extraktion und 1 Well für die Zellzyklusüberwachung) und dass 2 zusätzliche Wells von asynchron wachsenden Zellen sind Benötigt, um die Einstellungen der FACS-Analyse zu definieren.
    3. Die Zellen werden durch Inkubieren von 6-Well-Platten über Nacht (O / N) bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 gebunden.
    4. Entfernen Sie das komplette Medium aus den Brunnen am nächsten Morgen und fügen Sie 2 ml hinzuVon vorgewärmtem FBS-freiem DMEM-Glutamin-Medium pro Vertiefung. Inkubieren von Zellen für weitere 24 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 .
      HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in allen Vertiefungen mit Ausnahme von 2 (die gespeichert, um FACS-Einstellungen zu definieren). Der Serumentzugsschritt kann weggelassen werden, wenn eine effiziente Synchronisation durch einfaches Inkubieren von Zellen mit HU erreicht wird.
    5. G1 / S-Zellzyklus verhaftet mit HU.
      1. Vor dem Gebrauch eine frische HU-Stammlösung (500 mM) vorbereiten. 2 ml H 2 O zu 76,06 mg HU-Pulver zugeben und mischen, bis es gut aufgelöst ist. Sterilisieren der Lösung durch Filtration durch ein 0,2 μm Porengrßenfilter. Mischen Sie 50 ml vollständiges Medium mit 400 μl Filter-sterilisierter HU-Stammlösung für eine endgültige HU-Konzentration von 4 mM.
      2. Entfernen Sie das Medium aus allen Vertiefungen, außer aus den 2 Vertiefungen, die für die Definition der FACS-Einstellungen erforderlich sind, und ersetzen Sie es durch ein frisch zubereitetes 4 mM HU-haltiges vollständiges Medium (2 ml / Vertiefung).
      3. Inkubieren von Zellen für 24 h inHU-haltiges Medium bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 .
    6. Freisetzung von Zellen aus HU-vermittelter Verhaftung. HU-haltiges Medium aus den Brunnen entfernen und die Wells zweimal mit vorgewärmtem 1x PBS (jeweils 2 ml) abspülen. 2 ml Vollmedium pro Vertiefung zugeben. Sammeln Sie 2 Proben für den 0-h-Zeitpunkt (1 für die RNA-Extraktion und 1 für die Zellzyklus-Verhaftungsüberprüfung durch FACS) sowie 2 Samples, die für die FACS-Einstellungen gespeichert wurden. Legen Sie die restlichen Brunnen in den Inkubator.
    7. Sammle Proben alle 1,5 bis 3 Stunden, um eine adäquate Verteilung der Zellzyklusprogression zu erhalten. Zu jedem Zeitpunkt die Probenverarbeitung durchführen (für die RNA-Extraktion und für die FACS-Analyse), wie in 1.1.8.1-1.1.8.2 beschrieben.
  3. Behandlung mit DNA-schädigenden Mitteln
    HINWEIS: Immer wenn es darum geht, die Wirkung einer Verbindung ( zB DNA-schädigende Agenzien) in Zellzyklus-Ereignissen zu ermitteln, kann jede der zuvor beschriebenen Synchronisationsmethoden seinKombiniert mit der Behandlung von Zellen mit dem genotoxischen Mittel. Um die Synchronisationsmethode zu wählen, ist es wichtig, die Phase des Zellzyklus zu betrachten, die wir analysieren möchten. Im Allgemeinen kann das Thy-Noc-Verfahren geeignet sein, die Wirkung einer Verbindung in der G1-Phase oder des S-Phaseneintrags zu untersuchen, während die HU-vermittelte Synchronisation geeigneter ist, um den Einfluss in S bis G2-Phasen oder im Eintritt zur Mitose zu untersuchen.
    1. Analyse der Wirkung von genotoxischen Mitteln in G1-Phase oder S-Phase-Eintritt
      1. Synchronisieren Sie die Zellen wie in 1.1.2 beschrieben. Bis 1.1.6.
      2. Die Zellen aus Nocodazol freisetzen und wie in 1.1.7 beschrieben wieder aufplatten. Inkubieren sie bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 für 3 h, um sie vor dem Hinzufügen von Mitteln zuzugeben (erforderliche Inkubationszeit kann je nach Zelllinie variieren).
      3. Add Agent und sammeln Proben wie zuvor in 1.1.8 beschrieben.
    2. Analyse der Wirkung von Genotoxika in SG2 Phasen oder M Eintrag
      1. Synchronisieren Sie die Zellen wie in 1.2.2 beschrieben. Bis 1.2.5.
      2. Freisetzen von Zellen aus HU, wie in 1.2.6 beschrieben. Und Agent sofort hinzufügen.
      3. Sammle Proben wie oben in 1.8 beschrieben.
  4. Überwachung der Zellsynchronisation und -progression durch den Zellzyklus durch Propidiumjodid (PI) -Färbung und FACS-Analyse
    HINWEIS: Proben, die zu allen Zeitpunkten gesammelt wurden, zusammen mit denen, die zur Definition von FACS-Einstellungen erforderlich sind, können bei 4 ° C gespeichert werden, sobald sie fixiert sind (wie in 1.1.8.2 erwähnt). Färben Sie die Färbung mit PI-Lösung, gefolgt von der FACS-Analyse für alle Proben des Experiments gleichzeitig. PI interkaliert in die Hauptrille von doppelsträngiger DNA, die ein hochfluoreszierendes Signal erzeugt, wenn sie bei 535 nm mit einem breiten Emissionspeak um 600 nm angeregt wird. Da PI auch an doppelsträngige RNA binden kann, ist es notwendig, die Zellen mit RNase für eine optimale DNA-Auflösung zu behandeln.
    1. Frisch hergestellte PI-Färbelösung vorbereiten. Eine PI-Stammlösung kann durch Auflösen von PI-Pulver in PBS ( zB 5 mg / ml) hergestellt werden. Lagern Sie die Stammlösung bei 4 ° C (in Dunkelheit). Die Färbelösung besteht aus PI (140 μM), Natriumcitrat (38 mM) und Triton X-100 (0,01% v / v).
    2. Aufwärmen einer geeigneten Oberfläche ( zB Backofen) auf 37 ° C.
    3. Zentrifugen feste Zellen (450 xg, 5 min, RT), dekantierender Überstand (Ethanol) und einmal mit 1x PBS waschen.
    4. Zentrifugieren Sie Zellen erneut, entfernen Sie PBS und fügen Sie 300 μl PI-Färbelösung pro Probe hinzu (mit Ausnahme einer der Proben für FACS-Einstellungen), addieren Sie PBS zu dieser Probe stattdessen.
    5. Übertragen von Zellen auf FACS-Röhrchen (5 ml Rundboden-Polystyrol-Röhrchen).
    6. Füge 1 μl RNase A zu jeder Probe hinzu, mischen und inkubiere die Proben für 30 min in Dunkelheit bei 37 ° C. Proben können bei 4 ° C für ein Maximum von 2 - 3 Tagen vor Licht geschützt geschützt werden.
    7. Analysieren Sie den DNA-Gehalt in Proben nach DurchflussZytometrie Definieren Sie die FACS-Analysekompensationseinstellungen mit PI-gefärbten asynchronen Samples. Verwenden Sie eine Blindprobe (ohne PI-Färbelösung), um die Autofluoreszenz zu überprüfen. Grundlagen der PI-färbungsvermittelten Analyse des DNA-Gehalts durch Durchflusszytometrie wurden zuvor beschrieben 9 .
  5. Bestimmung des mitotischen Index durch doppelte Phospho-H3 (Ser 10) / PI-Färbung
    HINWEIS: Zellen, die sich einer Mitose unterziehen, können leicht durch Durchflusszytometrie mit Antikörpern identifiziert werden, die für Phospho-Histon H3 in Serin 10 (pH 3) spezifisch sind. Eine gleichzeitige PI-Färbung ist nützlich, um die DNA-inhaltsbasierte Verteilung der Zellpopulation zu bestimmen. Für die optimalen Konfigurationen der FACS-Einstellungen sind 5 Samples erforderlich: leer, nur PI-nur, pH3-only, sekundärer Antikörper und doppelte Färbung.
    1. Zentrifugierte feste Zellen (450 xg, 5 min, 4 ° C) und verwerfen den Überstand. Die folgenden Schritte werden beschrieben, um eine Färbung in 15 ml Röhrchen durchzuführen.
    2. Waschen von Zellen durch Zugabe von 1Ml PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) zum Pellet und Zentrifuge (450 xg, 5 min, 4 ° C). Den Überstand entfernen.
    3. Füge anti-pH3-Antikörper, verdünnt (1: 500), in 100-200 & mgr; l PBS-T + 3% BSA zu und inkubiere mit einem Kippen für 2 h bei RT (oder O / N bei 4 ° C).
    4. 2 ml PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) zugeben und zentrifugieren (450 xg, 5 min, 4 ° C). Den Überstand entfernen.
    5. Waschen Sie noch einmal durch Zugabe von 2 ml PBS-T zum Pellet, zentrifugieren und verwerfen Sie den Überstand.
    6. Sekundär-Antikörper (Anti-Kaninchen-AlexaFluor 488 im Falle eines ausgewählten pH3-Antikörpers) verdünnt (1: 500) in 100-200 & mgr; l PBS-T + 3% BSA und inkubieren mit Kokern für 1 h bei RT (oder O / N Bei 4 ° C). Schützen Sie die Proben vor Licht.
    7. Waschen Sie zweimal mit PBS-T (2 ml) durch Zentrifugation wie in Schritt 1.5.4 beschrieben.
    8. Führen Sie die PI-Färbung wie beschrieben durch (Schritte 1.4.1 bis 1.4.6).

2. Probenentnahme und -verarbeitung für die Genexpressionsanalyse

  1. Nehmen1,5 mL Mikrozentrifugenproben im RNA-Isolationsreagenz aus dem Gefrierschrank und lassen sie bei RT in einem Sicherheitsschrank für Chemikalien auftauen.
  2. Füge 400 μl Chloroform zu jeder Probe hinzu und schüttele kräftig (aber nicht vortexen) bis zum vollständigen Mischen. Inkubieren Sie die Proben für 5 min bei RT.
  3. Zentrifugenröhrchen für 15 min (≥ 8000 xg, 4 ° C) in einer Tischzentrifuge zentrifugieren.
  4. Übertragen Sie die wässrige (obere) Phase auf ein neues 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und registrieren Sie das übertragene Volumen (um das Verfahren zu vereinfachen, empfiehlt es sich, in allen Proben des Experiments gleiche Volumina zu sammeln).
  5. Füge 1 Volumen von 100% Ethanol langsam (tropfenweise) in die wässrige Phase während des Mischens zu. Nicht zentrifugieren
  6. Führen Sie die nächsten Schritte mit dem kommerziellen RNA Mini Prep Kit. Pipetieren Sie bis zu 700 μl jeder Probe, einschließlich aller Niederschläge, die sich gebildet haben können, in eine Spinsäule in einem 2 ml Sammelröhrchen (vom Hersteller bereitgestellt).
  7. SchließeDeckel und Zentrifuge (≥ 8.000 g, RT) für 15 s. Verwerfe den Durchfluss. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit dem restlichen Sample (falls vorhanden).
  8. Befolgen Sie die Anweisungen der Hersteller für die RNA-Reinigung und Elution (eluieren Sie jede Probe in 30 - 40 μl nukleasefreies H 2 O, um eine geeignete RNA-Konzentration für den nächsten Schritt zu erreichen).
  9. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und die Reinheit der Proben durch Absorptionsmessungen (ein A 260/280 -Verhältnis von 2,0-2,1 zeigt eine gute Reinheit der RNA-Probe an). RNA-Proben bei -80 ° C bis zur Verwendung für RT-qPCR-Analyse aufbewahren.
  10. Für die RNA-Umwandlung in cDNA und nachfolgende quantitative PCR nehmen Sie 1 μg RNA pro Probe und bereiten die Retrotranskriptase-Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Erhaltene cDNA-Proben können bei 4 ° C (für ein paar Tage) oder bei -20 ° C (für längere Zeit) gelagert werden.
    HINWEIS: Probenvorbereitung, Grundierung und andere Überlegungen für Echtzeit-PCR sind exSpannend in der Literatur 22 , 23 beschrieben.

Ergebnisse

Schematische Darstellung von Thy-Noc- und HU-basierten Protokollen zur Zellsynchronisation.

Abbildung 1 fasst die Schritte zusammen, die für die U2OS-Zellsynchronisation und die anschließende Probensammlung erforderlich sind, um die Progression durch den Zellzyklus zu überprüfen und Genexpressionsanalysen durchzuführen.

Phospho-H3 und PI-Färbung sin...

Diskussion

Die Analyse von Feinabstimmungsregulierten Genen, die an transienten und spezifischen Rollen im Zellzyklus beteiligt sind, erfordert eine einheitliche Zellpopulation. Viele Forscher verwenden routinemäßig langjährige Tumorzelllinien für diese Zwecke und es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um synchrone (oder teilweise synchrone) Zellpopulationen zu erhalten, mit dem Ziel, möglichst viele Zellen in definierten Zellzyklusphasen zu akkumulieren. Darüber hinaus wurden starke Anstrengungen unternommen, um bewäh...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern der Zubiaga und den Altmeyer Laboratorien für hilfreiche Diskussionen und für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des spanischen Ministeriums (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), der Baskischen Regierung (IT634-13 und KK-2015/89) und der Universität des Baskenlandes UPV / EHU ( UFI11 / 20).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, high glucose, GutaMAX supplementThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, qualified, E.U.-approved, South America originThermo Fisher Scientific10270-106
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol redThermo Fisher Scientific25200-072
ThymidineSIGMAT1895-5GFreshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine.
NocodazoleSIGMAM-1404Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots
HydroxyureaSIGMAH8627Freshly prepared
Mitomycin C from Streptomyces caespitosusSIGMAM42871.5 mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4 ºC
Dimethyl sulfoxideSIGMAD2650
Propidium iodideSIGMAP4170Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4 º C protected from light.
PBS pH 7.6Home made
EthanolPANREACA3678,2500
ChloroformSIGMAC2432
Sodium CitratePANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAse AThermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol ReagentLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher Scientific4368814
Anti-Cyclin E1 antibodyCell Signaling41291:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-Cyclin B1 antibodyCell Signaling41351:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-β-actinSIGMAA-54411:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antibotyMillipore06-570Specified in the protocol
Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibodyInvitrogenR37116Specified in the protocol
Secondary anti-mouse-HRP antibodySanta Cruz Biotechnologysc-36971:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Forward E2F1 antibody (human)                    TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F1 antibody (human)                    CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward E2F7 antibody (human)                    GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F7 antibody (human)                    TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 antibody (human)                    AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 antibody (human)                    TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP antibody (human) reference gene                    BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse TBP antibody (human)                    BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L antibody (human) reference gene   CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                 BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L  antibody (human)    CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
FACS Tubes Sarstedt551578
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher ScientificN8010560
Corning 100 mm TC-Treated Culture DishCorning
Corning Costar cell culture plates 6 wellCorning3506
Refrigerated Bench-Top MicrocentrifugeEppendorf5415 R
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop Lite SpectrophotometerThermo ScientificND-LITE-PR
BD FACSCalibur Flow CytometerBD Bioscience
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificA28567

Referenzen

  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, R. J., et al. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. Nat Genet. 27 (1), 48-54 (2001).
  4. Peña-Diaz, J., et al. Transcription profiling during the cell cycle shows that a subset of Polycomb-targeted genes is upregulated during DNA replication. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2846-2856 (2013).
  5. Grant, G. D., et al. Identification of cell cycle-regulated genes periodically expressed in U2OS cells and their regulation by FOXM1 and E2F transcription factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3634-3650 (2013).
  6. Minderman, H., et al. In vitro and in vivo irinotecan-induced changes in expression profiles of cell cycle and apoptosis-associated genes in acute myeloid leukemia cells. Mol Cancer Ther. 4 (6), 885-900 (2005).
  7. McKenna, E., Traganos, F., Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence. Cell Cycle. 11 (16), 3132-3140 (2012).
  8. Infante, A., et al. E2F2 represses cell cycle regulators to maintain quiescence. Cell Cycle. 7 (24), 3915-3927 (2008).
  9. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of cell cycle position in mammalian cells. J Vis Exp. (59), (2012).
  10. Schorl, C., Sedivy, J. M. Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells. Methods. 41 (2), 143-150 (2007).
  11. Lalande, M. A reversible arrest point in the late G1 phase of the mammalian cell cycle. Exp Cell Res. 186 (2), 332-339 (1990).
  12. Park, S. Y., et al. Mimosine arrests the cell cycle prior to the onset of DNA replication by preventing the binding of human Ctf4/And-1 to chromatin via Hif-1α activation in HeLa cells. Cell Cycle. 11 (4), 761-766 (2012).
  13. Ikegami, S., et al. Aphidicolin prevents mitotic cell division by interfering with the activity of DNA polymerase-alpha. Nature. 275 (5679), 458-460 (1978).
  14. Baranovskiy, A. G., et al. Structural basis for inhibition of DNA replication by aphidicolin. Nucleic Acids Res. 42 (22), 14013-14021 (2014).
  15. Adams, R. L., Lindsay, J. G. Hydroxyurea reversal of inhibition and use as a cell-synchronizing agent. J Biol Chem. 242 (6), 1314-1317 (1967).
  16. Mitxelena, J., Apraiz, A., Vallejo-Rodríguez, J., Malumbres, M., Zubiaga, A. M. E2F7 regulates transcription and maturation of multiple microRNAs to restrain cell proliferation. Nucleic Acids Res. , (2016).
  17. Bootsma, D., Budke, L., Vos, O. Studies on synchronous division of tissue culture cells initiated by excess thymidinE. Exp Cell Res. 33, 301-309 (1964).
  18. Galgano, P. J., Schildkraut, C. L. G1/S Phase Synchronization using Double Thymidine Synchronization. CSH Protoc. (2), (2006).
  19. Edwin Taylor, W. Kinetics of inhibition and the binding of h3-colchicine. J Cell Biol. 25, 145-160 (1965).
  20. Zieve, G. W., Turnbull, D., Mullins, J. M., McIntosh, J. R. Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells. Exp Cell Res. 126 (2), 397-405 (1980).
  21. Matsui, Y., Nakayama, Y., Okamoto, M., Fukumoto, Y., Yamaguchi, N. Enrichment of cell populations in metaphase, anaphase, and telophase by synchronization using nocodazole and blebbistatin: a novel method suitable for examining dynamic changes in proteins during mitotic progression. Eur J Cell Biol. 91 (5), 413-419 (2012).
  22. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  23. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 39 (2), 145-154 (2011).
  24. Abbas, T., Dutta, A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat Rev Cancer. 9 (6), 400-414 (2009).
  25. Kung, A. L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (24), 9553-9557 (1990).
  26. Borel, F., Lacroix, F. B., Margolis, R. L. Prolonged arrest of mammalian cells at the G1/S boundary results in permanent S phase stasis. J Cell Sci. 115 (Pt. 14, 2829-2838 (2002).
  27. Knehr, M., et al. A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in specific cell cycle phases). Exp Cell Res. 217 (2), 546-553 (1995).
  28. Zhu, W., Giangrande, P. H., Nevins, J. R. E2Fs link the control of G1/S and G2/M transcription. EMBO J. 23 (23), 4615-4626 (2004).
  29. Whitcomb, E. A., Dudek, E. J., Liu, Q., Taylor, A. Novel control of S phase of the cell cycle by ubiquitin-conjugating enzyme H7. Mol Biol Cell. 20 (1), 1-9 (2009).
  30. Bruinsma, W., Macurek, L., Freire, R., Lindqvist, A., Medema, R. H. Bora and Aurora-A continue to activate Plk1 in mitosis. J Cell Sci. 127, 801-811 (2014).
  31. Thomas, D. B., Lingwood, C. A. A model of cell cycle control: effects of thymidine on synchronous cell cultures. Cell. 5 (1), 37-42 (1975).
  32. Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol Biol Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  33. Lim, S., Cdks Kaldis, P. cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation. Development. 140 (15), 3079-3093 (2013).
  34. Tapia, C., et al. Two mitosis-specific antibodies, MPM-2 and phospho-histone H3 (Ser28), allow rapid and precise determination of mitotic activity. Am J Surg Pathol. 30 (1), 83-89 (2006).
  35. Andreassen, P. R., Martineau, S. N., Margolis, R. L. Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state. Mutat Res. 372 (2), 181-194 (1996).
  36. Wei, F., Xie, Y., He, L., Tao, L., Tang, D. ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation. Cell Signal. 23 (1), 259-268 (2011).
  37. Kubota, S., et al. Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage. J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).
  38. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  39. St-Denis, N. A., Derksen, D. R., Litchfield, D. W. Evidence for regulation of mitotic progression through temporal phosphorylation and dephosphorylation of CK2alpha. Mol Cell Biol. 29 (8), 2068-2081 (2009).
  40. Min, A., et al. RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib. Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).

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