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Résumé

Nous rapportons deux protocoles de synchronisation cellulaire qui fournissent un contexte pour étudier les événements liés à des phases spécifiques du cycle cellulaire. Nous montrons que cette approche est utile pour analyser la régulation de gènes spécifiques dans un cycle cellulaire non perturbé ou lors de l'exposition à des agents affectant le cycle cellulaire.

Résumé

Le programme d'expression génique du cycle cellulaire représente une étape critique pour la compréhension des processus dépendants du cycle cellulaire et leur rôle dans des maladies telles que le cancer. L'analyse d'expression génique régulée par un cycle cellulaire dépend de la synchronisation cellulaire en phases spécifiques. Nous décrivons ici une méthode utilisant deux protocoles de synchronisation complémentaires qui sont couramment utilisés pour étudier la variation périodique de l'expression des gènes pendant le cycle cellulaire. Les deux procédures sont basées sur le blocage transitoire du cycle cellulaire dans un point défini. Le protocole de synchronisation par le traitement par l'hydroxyurée (HU) conduit à une arrestation cellulaire à la phase G1 / début S en retard, et la libération de l'arrestation médiée par l'HU fournit une population cellulaire progressant uniformément à travers S et G2 / M. Le protocole de synchronisation par le traitement par la thymidine et le nocodazole (Thy-Noc) bloque les cellules dans la mitose précoce et la libération de l'arrestation médiée par Thy-Noc fournit une population cellulaire synchronisée adaptée à la phase G1 et à la phase S-enEssayer des études. L'application des deux procédures nécessite une surveillance des profils de distribution du cycle cellulaire, qui est habituellement effectuée après la coloration par l'iodure de propidium (PI) des cellules et l'analyse de la teneur en ADN par cytométrie en flux. Nous montrons que l'utilisation combinée de deux protocoles de synchronisation est une approche robuste pour déterminer clairement les profils transcriptionnels des gènes qui sont différentiellement réglementés dans le cycle cellulaire ( c.-à-d. E2F1 et E2F7) et par conséquent avoir une meilleure compréhension de leur rôle dans le cycle cellulaire Processus. En outre, nous montrons que cette approche est utile pour l'étude des mécanismes sous-jacents aux thérapies à base de médicaments ( c'est-à-dire la mitomycine C, un agent anticancéreux), car elle permet de discriminer les gènes qui réagissent à l'agent génotoxique de ceux qui sont uniquement affectés par des perturbations du cycle cellulaire Imposé par l'agent.

Introduction

La transition à travers toutes les phases du cycle cellulaire est couplée à un programme d'expression génique étroitement réglementé. Ce «aller et à quitter» coordonné de la transcription des gènes tout au long du cycle cellulaire est censé être sous le contrôle de systèmes de régulation transcriptionnels complexes, en régulant non seulement le moment mais aussi les niveaux d'expression des gènes. La dérégulation des composants clés du cycle cellulaire est connue pour contribuer au développement de plusieurs maladies et est une caractéristique bien établie de la tumorigénèse 1 , 2 . Les analyses transcriptomiques à l'échelle du génome réalisées dans des cellules de levure et de mammifères ont révélé qu'un grand nombre de gènes présentent des schémas périodiques d'expression des gènes dans le cycle cellulaire, ce qui suggère que la fluctuation de la transcription pendant le cycle cellulaire reflète l'exigence temporelle d'un produit génique donné Dans une phase précise 3 , 4 , 5 .

Une tâche majeure dans l'étude de l'expression des gènes régulés par un cycle cellulaire est la synchronisation des cellules dans des phases spécifiques du cycle cellulaire. La synchronisation cellulaire aide à interpréter l'association d'un motif d'expression génique à une transition de phase de cycle cellulaire particulière et a permis de mieux comprendre la régulation et la fonction de nombreux gènes. La synchronisation cellulaire est également importante pour étudier le mécanisme d'action des médicaments anticancéreux, car les agents chimiothérapeutiques sont connus pour affecter à la fois l'expression des gènes ainsi que la cinétique du cycle cellulaire 6 , 7 . Néanmoins, il est souvent difficile de déterminer si les différences d'expression des gènes résultant du traitement avec ces agents sont une réponse directe au traitement ou sont simplement la conséquence de changements dans les profils du cycle cellulaire. Pour distinguer ces possibilités, l'expression des gènes doit être analysée dans les cellules qui ont été sYnchronisé avant l'addition du médicament chimiothérapeutique.

À l'exception de certaines cellules primaires telles que les cellules lymphoïdes fraîchement isolées - qui constituent une population cellulaire homogène synchronisée dans G0 8 -, les lignées cellulaires établies in vitro croissent de manière asynchrone en culture. Dans des conditions de croissance régulières, ces cellules cycliques asynchrones se retrouvent dans toutes les phases du cycle cellulaire mais, de préférence, dans G1 9 . Par conséquent, ce contexte ne fournit pas un scénario optimal pour les analyses d'expression fonctionnelle ou génétique dans une phase de cycle cellulaire spécifique ( p. Ex. G1, S, etc.). Les lignées cellulaires immortalisées non transformées ( p. Ex . Les fibroblastes) peuvent être synchronisées avec les méthodes dites physiologiques 10 . Ces méthodes sont basées sur les caractéristiques de cellules primaires retenues des cellules non transformées, telles que l'inhibition du contact cellulaire et la dépendance du facteur de croissance afin de continuer à faire du vélo. SuppressionDe sérum en combinaison avec une inhibition de contact rend les cellules non transformées arrêtées à G0 / G1. Cependant, l'entrée et la progression du cycle cellulaire synchronisée nécessitent souvent une sous-culture, qui implique également un détachement artificiel des cellules et une régénération 10 . Plus important encore, cette méthode n'est pas adaptée à la synchronisation des lignées cellulaires transformées, la grande majorité des lignées cellulaires établies actuellement utilisées, caractérisées par manque d'inhibition de la croissance médiée par contact cellulaire ou de réponse au retrait du facteur de croissance. Ainsi, il est clair que des méthodes alternatives sont nécessaires pour une synchronisation cellulaire efficace dans des phases spécifiques du cycle cellulaire. En termes généraux, les méthodes de synchronisation les plus fréquemment utilisées sont basées sur une inhibition chimique ou pharmacologique transitoire d'un point défini du cycle cellulaire, typiquement la synthèse de l'ADN ou la formation de la broche mitotique. L'inhibition de la synthèse de l'ADN synchronise les cellules en les arrêtant à la fin de la phase G1 ou début de la S. Cela peut être achevéPar addition de composés tels que la mimosine, un inhibiteur de la biosynthèse des nucléotides 11 , 12 , de l'aphidicoline, un inhibiteur des ADN polymerases 13 , 14 , de l'hydroxyurée, un inhibiteur de la ribonucléotide réductase 15 , 16 ou des quantités excessives de thymidine 17 , 18 . D'autre part, les inhibiteurs de la polymérisation des microtubules, tels que la colchicine ou le nocodazole, peuvent bloquer la formation de la broche mitotique conduisant à une synchronisation cellulaire au début de la phase M 19 , 20 , 21 .

Dans ce travail, nous décrivons une méthode impliquant deux protocoles de synchronisation complémentaires basés sur l'inhibition chimique transitoire pour étudier l'expression de gènes régulés par cycle cellulaire à l'ARNmniveau. Cette méthode est fondamentale pour définir le rôle des gènes du cycle cellulaire dans les processus spécifiques du cycle cellulaire. En outre, il fournit un cadre général pour étudier l'impact des traitements anticancéreux afin de détecter avec précision les gènes sensibles aux médicaments et de minimiser les mauvaises interprétations dérivées des perturbations de la progression du cycle cellulaire générées par ces médicaments.

Protocole

1. Synchronisation cellulaire, libération et surveillance de la progression du cycle cellulaire

  1. Synchronisation à base de thymidine et de nododazole (Thy-Noc) et libération de cellules U2OS à partir de la mitose
    1. Préparer le milieu de culture cellulaire requis. Les cellules U2OS sont habituellement cultivées dans du milieu DMEM-Glutamine complété par 10% (vol / vol) FBS (facultatif: 1% de pénicilline / streptomycine). Effectuer toute la préparation et la manipulation du milieu dans des conditions stériles et réchauffer le support complémentaire (désormais appelé «support complet») à 37 ° C avant utilisation.
    2. Graine 2 x 10 6 cellules U2OS par plat 100 mm dans 10 mL de milieu de culture complet. Pour calculer le nombre de vaisselles nécessaires, prenez en compte que chaque plat 100 mm fournit généralement suffisamment de cellules mitotiques pour recharger environ 5 puits d'une plaque de 6 puits (0,2 à 0,25 x 10 6 cellules / puits) (voir la figure 1B ). Deux puits par point de temps sélectionné sont requisDans l'expérience (1 puits pour l'extraction de l'ARN et 1 puits pour la surveillance du cycle cellulaire). En outre, un troisième puits peut être collecté par point de temps pour l'analyse des protéines.
      REMARQUE: les cellules de plaque dans la soirée (vers 19 heures) afin que les étapes suivantes puissent être effectuées pendant les heures de travail les jours suivants. Inclure 2 puits supplémentaires de cellules de croissance asynchrone pour définir les paramètres de compensation d'analyse FACS.
    3. Laisser les cellules se fixer en incubant des plats de 100 mm à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 pendant 24 h.
    4. Pour le bloc de thymidine, préparer une solution mère de thymidine 200 mM en dissolvant 145,2 mg de poudre de thymidine dans 3 ml de H2O (ou des quantités équivalentes) et stériliser la solution par filtration à travers un filtre de taille de pores de 0,2 μm. Un léger réchauffement pourrait aider à dissoudre la thymidine. Ajouter 100 μL du stock 200 mM fraîchement préparé à chaque plat de culture 100 mm (concentration finale 2 mM). Incuber les cellules avec de la thymidine pendant 20 h à 37 ° C76; C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 .
      REMARQUE: traiter les cellules le soir (vers 19 heures), avoir le temps d'effectuer la libération de la thymidine et le blocage du nocodazole le lendemain.
    5. Pour libérer du bloc de thymidine, retirer le milieu de croissance contenant de la thymidine dans l'après-midi du lendemain (15 heures); Laver les cellules deux fois avec 1x PBS préchauffé et ajouter 10 ml de milieu complet à chaque plat de 100 mm. Incuber les cellules pendant 5 h à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 .
    6. Pour l'arrêt des cellules mitotiques, ajouter du nocodazole à une concentration finale de 50 ng / mL (20 h). Préparer une solution mère en dissolvant la poudre de nocodazole dans du DMSO ( par ex. 5 mg / mL) et conserver congelé à -20 ° C. Incuber les cellules avec du nocodazole pendant plus de 10 à 11 h à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 .
    7. Libération de l'arrestation médiée par nocodazole au début de la phase M (mitotic shake-off) et collecte d'échantillons à plusieurs reprises poiNts (à partir de 6-7 heures).
      1. Détachez les cellules arrondies (mitotiques) en secouant chaque plaque et en pipetteant doucement le milieu de croissance contenant du nocodazole. Recueillir le milieu avec des cellules détachées de chaque plaque de 100 mm dans des tubes stériles de 50 ml, centrifuger (300 xg, 5 min, température ambiante (RT)) et les cellules de lavage deux fois en ajoutant 1x PBS puis centrifuger. L'utilisation de PBS froid ou PBS plus nocodazole est recommandée pour éviter le glissement mitotique (voir la section Discussion).
      2. Remettre en suspension les cellules mitotiques recueillies à partir de chaque plaque de 100 mm dans 10 ml de milieu complet. Économisez 2 mL pour l'extraction de l'ARN et 2 mL pour l'analyse FACS pour le point de temps 0 h (environ 0,2-0,25 x 10 6 cellules par échantillon).
      3. Remplacer les cellules mitotiques restantes pour les points de temps suivants dans des plaques à 6 puits (2 ml / puits, 0,2-0,25 x 10 6 cellules / puits).
        REMARQUE: Rappelez-vous que 2 puits sont requis par point de temps sélectionné (1 pour l'ARN et 1 pour l'analyse FACS).
    8. Collecter des échantillons à selPoints de temps écoulés. Toutes les 1,5 à 3 h sont recommandées afin d'obtenir un profil adéquat de la progression du cycle cellulaire.
      1. Pour l'extraction de l'ARN, retirer le milieu, rincer bien avec 2 mL de préchauffage 1x PBS et ajouter 1 mL de réactif d'isolement d'ARN approprié ( p. Ex . TRIzol) dans le puits (effectuer cette dernière étape dans une armoire de sécurité pour les produits chimiques). Pipeter vers le haut et vers le bas pour détacher et lyse les cellules, transférer le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL, incuber 5 min à la RT et conserver le tube à -80 ° C jusqu'à l'utilisation ultérieure.
      2. Pour l'analyse FACS, rincer bien avec 2 mL de pré-chaud 1x PBS, ajouter une solution de trypsine-EDTA préalablement chauffée (0,3 mL / puits) pour détacher les cellules, bloquer la trypsine-EDTA en ajoutant 1 mL de milieu complet et collecter chaque échantillon séparément Tube de 15 mL.
        1. Centrifuger les cellules (300 xg, 5 min, RT), sauver la granulation cellulaire et éliminer le surnageant. Afin de corriger les cellules, remettre à neuf les cellules dans 1 ml d'éthanol refroidi à 70% (v / v) dans 1x PBS par des tubes à vortex doux et les placer sur la glace pour l'applicationEnviron 15 min avant le stockage à 4 ° C ou à la coloration pour une analyse plus approfondie par FACS (décrit dans les étapes 1.4 à 1.5).
  2. Synchronisation et publication de cellules U2OS basées sur HU à partir de la frontière G1 / S
    1. Préparer un milieu de culture cellulaire complet comme décrit à l'étape 1.1.
    2. Graine 0,25 x 10 6 cellules U2OS par puits dans des plaques à 6 puits (2 ml de milieu de culture complet par puits). Afin de calculer le nombre de puits nécessaires à l'expérience, prendre en compte que 2 puits seront requis par point de temps sélectionné (1 puits pour l'extraction de l'ARN et 1 puits pour la surveillance du cycle cellulaire) et que 2 puits supplémentaires de cellules de croissance asynchrone sont Nécessaire pour définir les paramètres de compensation d'analyse FACS.
    3. Laisser les cellules se fixer en incubant des plaques à 6 puits pendant une nuit (O / N) à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 .
    4. Enlever le milieu complet des puits le lendemain matin et ajouter 2 mLDe milieu DMEM-Glutamine pré-réchauffé sans FBS par puits. Incuber les cellules pendant 24 h supplémentaires à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 .
      REMARQUE: effectuez cette étape dans tous les puits à l'exception de 2 (ceux sauvegardés pour définir les paramètres FACS). L'étape de retrait du sérum peut être omise si une synchronisation efficace est obtenue en incubant simplement des cellules avec HU.
    5. Arrêt du cycle cellulaire G1 / S avec HU.
      1. Préparer une solution mère de HU fraîche (500 mM) avant chaque utilisation. Ajouter 2 mL de H 2 O à 76,06 mg de poudre HU et mélanger jusqu'à dissolution complète. Stériliser la solution par filtration à travers un filtre de taille de pores de 0,2 μm. Mélanger 50 mL de milieu complet avec 400 μL de solution mère HU stérilisée pour une concentration finale en HU de 4 mM.
      2. Supprimez le milieu de tous les puits, à l'exception des 2 puits nécessaires à la définition des paramètres FACS et remplacez-les par un milieu complet 4 mM contenant de l'HU (2 ml / puits).
      3. Incuber les cellules pendant 24 h dansLe milieu contenant HU à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 .
    6. Libération des cellules de l'arrestation médiée par l'HU. Retirer le milieu contenant HU des puits et rincer les puits deux fois avec 1x PBS préchauffé (2 ml à chaque fois). Ajouter 2 ml de milieu complet par puits. Collectez 2 échantillons pour le point de temps de 0 h (1 pour l'extraction de l'ARN et 1 pour la vérification de l'arrêt du cycle cellulaire par FACS) ainsi que 2 échantillons sauvegardés pour les paramètres FACS. Placez les puits restants dans l'incubateur.
    7. Recueillir des échantillons tous les 1,5 à 3 h afin d'obtenir une répartition adéquate de la progression du cycle cellulaire. À chaque fois, effectuez un traitement d'échantillons (pour l'extraction de l'ARN et pour l'analyse FACS) comme décrit au 1.1.8.1-1.1.8.2.
  3. Traitement avec des agents nuisibles à l'ADN
    REMARQUE: chaque fois que l'objectif est d'élucider l'effet d'un composé ( par exemple , des agents nuisibles à l'ADN) dans les événements du cycle cellulaire, l'une des méthodes de synchronisation décrites précédemment peut êtreCombiné avec le traitement des cellules avec l'agent génotoxique. Afin de sélectionner la méthode de synchronisation, il est important de considérer la phase du cycle cellulaire que nous aimerions analyser. En général, la procédure Thy-Noc peut être appropriée pour étudier l'effet d'un composé en phase G1 ou en entrée de phase S, tandis que la synchronisation médiée par l'HU peut être plus appropriée pour étudier l'impact dans les phases S à G2 ou dans l'entrée à la mitose.
    1. Analyse de l'effet des agents génotoxiques en phase G1 ou en entrée de phase S
      1. Synchronisez les cellules comme décrit dans 1.1.2. À 1.1.6.
      2. Libérer les cellules du nocodazole et les re-plaquer comme décrit au 1.1.7. Incuber les à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 pendant 3 h pour les laisser s'attacher avant l'ajout d'agent (la période d'incubation requise peut varier en fonction de la ligne cellulaire).
      3. Ajouter un agent et collecter des échantillons comme décrit précédemment au 1.1.8.
    2. Analyse de l'effet des agents génotoxiques dans SG2 phases ou M entrée
      1. Synchronisez les cellules comme décrit dans 1.2.2. À 1.2.5.
      2. Libérer les cellules de HU comme décrit dans 1.2.6. Et ajoutez immédiatement l'agent.
      3. Recueillir des échantillons comme décrit précédemment dans 1.8.
  4. Surveillance de la synchronisation cellulaire et de la progression à travers le cycle cellulaire par coloration au iodure de propidium (PI) et analyse FACS
    REMARQUE: les échantillons collectés en tous les temps avec ceux requis pour définir les paramètres FACS peuvent être conservés à 4 ° C une fois qu'ils ont été corrigés (comme indiqué au 1.1.8.2). Effectuer une coloration avec une solution PI suivie d'une analyse FACS pour tous les échantillons de l'expérience simultanément. L'IP s'accumule dans la rainure principale de l'ADN bicaténaire produisant un signal fortement fluorescent lorsqu'il est excité à 535 nm avec un pic d'émission large autour de 600 nm. Puisque l'IP peut également se lier à l'ARN bicaténaire, il est nécessaire de traiter les cellules avec RNase pour une résolution optimale de l'ADN.
    1. Préparez une solution de coloration IP fraîchement préparée. Une solution mère PI peut être préparée en dissolvant de la poudre PI dans du PBS ( par exemple 5 mg / mL). Conserver la solution stock à 4 ° C (dans l'obscurité). La solution de coloration est composée de PI (140 μM), de citrate de sodium (38 mM) et de Triton X-100 (0,01% v / v).
    2. Réchauffer une surface appropriée ( par exemple un four) à 37 ° C.
    3. Centrifuger les cellules fixées (450 xg, 5 min, RT), décanter le surnageant (éthanol) et laver une fois avec 1x PBS.
    4. Centrifuger les cellules à nouveau, enlever PBS et ajouter 300 μL de solution de coloration PI par échantillon (sauf à l'un des échantillons pour les paramètres FACS, ajouter PBS à cet échantillon).
    5. Transférer des cellules dans des tubes FACS (5 ml de tubes en polystyrène à fond rond).
    6. Ajouter 1 μL de RNase A à chaque échantillon, mélanger et incuber les échantillons pendant 30 min dans l'obscurité à 37 ° C. Les échantillons peuvent être stockés protégés contre la lumière à 4 ° C pendant un maximum de 2 à 3 jours.
    7. Analyser le contenu d'ADN dans les échantillons par fluxLa cytométrie. Définir les paramètres de compensation d'analyse FACS avec un échantillon asynchrone coloré par PI. Utilisez un échantillon vide (sans solution de coloration IP) pour vérifier l'autofluorescence. Les bases de l'analyse de la teneur en ADN par la cytométrie en flux ont été décrites précédemment 9 .
  5. Détermination de l'indice mitotique par double coloration phospho-H3 (Ser 10) / PI
    NOTE: Les cellules soumises à la mitoses peuvent être facilement détectées par cytométrie en flux avec des anticorps spécifiques de phospho-histone H3 dans Serine 10 (pH3). Une coloration concomitante de PI est utile pour déterminer la distribution basée sur l'ADN de la population cellulaire. 5 échantillons sont nécessaires pour les configurations optimales des paramètres FACS: blanc, PI-seulement, pH3 seulement, anticorps secondaire et double coloration.
    1. Centrifuger les cellules fixées (450 xg, 5 min, 4 ° C) et jeter le surnageant. Les étapes suivantes sont décrites pour effectuer une coloration dans des tubes de 15 mL.
    2. Nettoyer les cellules en ajoutant 1Ml de PBS-T (PBS + 0,05% de Tween-20) sur la pastille et la centrifugeuse (450 xg, 5 min, 4 ° C). Retirer le surnageant.
    3. Ajouter un anticorps anti-pH3 dilué (1: 500) dans 100-200 μL de PBS-T + 3% de BSA, et incuber avec un balancement pendant 2 h à TA (ou O / N à 4 ° C).
    4. Ajouter 2 ml de PBS-T (PBS + 0,05% de Tween-20) et centrifuger (450 xg, 5 min, 4 ° C). Retirer le surnageant.
    5. Laver encore une fois en ajoutant 2 ml de PBS-T à la pastille, centrifuger et jeter le surnageant.
    6. Ajouter un anticorps secondaire (AlexaFluor 488 anti-lapin dans le cas d'un anticorps pH3 sélectionné) dilué (1: 500) dans 100-200 μL de PBS-T + 3% BSA et incuber avec un balancement pendant 1 h à TA (ou O / N À 4 ° C). Protégez les échantillons de la lumière.
    7. Laver deux fois avec du PBS-T (2 ml) par centrifugation comme décrit à l'étape 1.5.4.
    8. Effectuez la coloration PI comme décrit (étapes 1.4.1 à 1.4.6).

2. Collecte et traitement des échantillons pour l'analyse des expressions génétiques

  1. PrendreDes échantillons de microcentrifugation de 1,5 mL dans le réactif d'isolement de l'ARN hors du congélateur et les laisser décongeler à la RT à l'intérieur d'une armoire de sécurité pour les produits chimiques.
  2. Ajouter 400 μL de chloroforme à chaque échantillon et agiter vigoureusement (mais ne pas tourbillonner) jusqu'à mélange complet. Incuber les échantillons pendant 5 min à la RT.
  3. Centrifuger les tubes pendant 15 min (≥8,000 xg, 4 ° C) dans une microcentrifugeuse de banc.
  4. Transférer la phase aqueuse (supérieure) à un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL et enregistrer le volume transféré (afin de simplifier la procédure, il est recommandé de collecter des volumes égaux dans tous les échantillons de l'expérience).
  5. Ajouter 1 volume d'éthanol à 100% lentement (goutte à goutte) à la phase aqueuse tout en mélangeant. Ne pas centrifuger.
  6. Effectuez les prochaines étapes avec le kit de préparation mini RNA commercial. Pipeter jusqu'à 700 μl de chaque échantillon, y compris tout précipité qui s'est formé, dans une colonne de spin dans un tube de collecte de 2 mL (fourni par le fabricant).
  7. Fermer laCouvercle et centrifugeuse (≥ 8 000 g, RT) pendant 15 s. Jeter l'écoulement. Répétez l'étape précédente avec l'échantillon restant (le cas échéant).
  8. Suivre les instructions de fabrication pour le lavage et l'élimination d'ARN (élucider chaque échantillon dans 30 à 40 μl d'H 2 O sans nucléase pour obtenir une concentration d'ARN appropriée pour l'étape suivante).
  9. Déterminer la concentration d'ARN et la pureté des échantillons par des mesures d'absorbance (un rapport 260/280 de 2,0-2,1 indique une bonne pureté de l'échantillon d'ARN). Stocker les échantillons d'ARN à -80 ° C jusqu'à l'utilisation pour l'analyse RT-qPCR.
  10. Pour la conversion de l'ARN en ADNc et la PCR quantitative subséquente, prendre 1 μg d'ARN par échantillon et préparer une réaction rétrotranscriptase selon les instructions du fabricant. Les échantillons d'ADNc obtenus peuvent être stockés à 4 ° C (pendant quelques jours) ou à -20 ° C (pour de plus longues périodes).
    REMARQUE: la préparation des échantillons, la conception des amorces et d'autres considérations pour le PCR en temps réel ont été exDécrite de manière résolue dans la littérature 22 , 23 .

Résultats

Représentation schématique des protocoles Thy-Noc et HU pour la synchronisation des cellules.

La figure 1 résume les étapes requises pour la synchronisation des cellules U2OS et la collecte ultérieure des échantillons afin de vérifier la progression à travers le cycle cellulaire et d'effectuer des analyses d'expression des gènes.

Les colo...

Discussion

L'analyse des gènes régulés par ajustement précis impliqués dans des rôles transitoires et spécifiques dans le cycle cellulaire nécessite une population cellulaire uniforme. Beaucoup de chercheurs utilisent couramment des lignées de cellules tumorales établies de longue date à cette fin, et une variété de méthodes ont été développées pour obtenir des populations de cellules synchrones (ou partiellement synchrones), dans le but d'accumuler autant de cellules que possible dans des phases de cycle...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous remercions les membres des laboratoires Zubiaga et Altmeyer pour des discussions utiles et pour un soutien technique. Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère espagnol (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), du gouvernement basque (IT634-13 et KK-2015/89) et de l'Université du Pays Basque UPV / EHU ( UFI11 / 20).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, high glucose, GutaMAX supplementThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, qualified, E.U.-approved, South America originThermo Fisher Scientific10270-106
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol redThermo Fisher Scientific25200-072
ThymidineSIGMAT1895-5GFreshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine.
NocodazoleSIGMAM-1404Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots
HydroxyureaSIGMAH8627Freshly prepared
Mitomycin C from Streptomyces caespitosusSIGMAM42871.5 mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4 ºC
Dimethyl sulfoxideSIGMAD2650
Propidium iodideSIGMAP4170Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4 º C protected from light.
PBS pH 7.6Home made
EthanolPANREACA3678,2500
ChloroformSIGMAC2432
Sodium CitratePANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAse AThermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol ReagentLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher Scientific4368814
Anti-Cyclin E1 antibodyCell Signaling41291:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-Cyclin B1 antibodyCell Signaling41351:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-β-actinSIGMAA-54411:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antibotyMillipore06-570Specified in the protocol
Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibodyInvitrogenR37116Specified in the protocol
Secondary anti-mouse-HRP antibodySanta Cruz Biotechnologysc-36971:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Forward E2F1 antibody (human)                    TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F1 antibody (human)                    CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward E2F7 antibody (human)                    GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F7 antibody (human)                    TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 antibody (human)                    AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 antibody (human)                    TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP antibody (human) reference gene                    BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse TBP antibody (human)                    BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L antibody (human) reference gene   CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                 BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L  antibody (human)    CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
FACS Tubes Sarstedt551578
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher ScientificN8010560
Corning 100 mm TC-Treated Culture DishCorning
Corning Costar cell culture plates 6 wellCorning3506
Refrigerated Bench-Top MicrocentrifugeEppendorf5415 R
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop Lite SpectrophotometerThermo ScientificND-LITE-PR
BD FACSCalibur Flow CytometerBD Bioscience
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificA28567

Références

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