JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقاطعات بين الخلايا هي متطلبات الغدة الثديية وظائف مرحلة محددة والتنمية. توفر هذه المخطوطة بروتوكول مفصل لدراسة التفاعلات البروتين البروتين (بي) والمشاركة في التعريب باستخدام الغدد الثديية الفئران. هذه التقنيات تسمح للتحقيق في ديناميات الارتباط الجسدي بين التقاطعات بين الخلايا في مراحل تنموية مختلفة.

Abstract

التفاعلات خلية خلية تلعب دورا محوريا في الحفاظ على سلامة الأنسجة والحاجز بين المقصورات المختلفة للغدة الثديية. يتم توفير هذه التفاعلات من قبل البروتينات الوصلي التي تشكل الروابط بين الخلايا المجاورة. ويمكن أن يؤدي سوء توصيف البروتين الوصلي وتقليل الروابط الجسدية مع الشركاء الملتزمين إلى فقدان الوظيفة، وبالتالي إلى اختلال وظيفي في الجهاز. وبالتالي، تحديد توطين البروتين والتفاعلات البروتين البروتين (بي) في الأنسجة الطبيعية والمرض ذات الصلة أمر ضروري لإيجاد أدلة جديدة وآليات تؤدي إلى تطور الأمراض أو تغييرات في الوضع التنموي. تقدم هذه المخطوطة طريقة من خطوتين لتقييم مؤشر أسعار المنتجين في الغدد الثديية الفئران. في القسم بروتوكول 1، يتم وصف طريقة لأداء المناعي المشترك (شارك إف) باستخدام الأجسام المضادة التي تثار ضد البروتينات ذات الفائدة، تليها الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع فلوروكروميس. على الرغم من شارك في إف جميعويعود إلى مظاهرة من قرب من البروتينات، فإنه يجعل من الممكن لدراسة التفاعلات المادية. لذلك، يتم توفير بروتوكول مفصل لالمناعي المشترك (إب المشترك) في القسم بروتوكول 2. وتستخدم هذه الطريقة لتحديد التفاعلات المادية بين البروتينات، دون التأكد مما إذا كانت هذه التفاعلات مباشرة أو غير مباشرة. في السنوات القليلة الماضية، وقد أثبتت إف شارك وتقنيات الملكية الفكرية المشتركة أن مكونات معينة من تقاطعات بين الخلايا تشارك في توطين والتفاعل معا، وخلق العلاقات التي تعتمد على مرحلة وظيفية التي تختلف أثناء تطوير الغدة الثديية.

Introduction

نمو الغدة الثديية والتنمية يحدث أساسا بعد الولادة. هذا الجهاز يعيد باستمرار نفسه في جميع أنحاء الحياة الإنجابية للثدييات 1 . وتتكون ظهارة الغدة الثديية الكبار من الطبقة الداخلية من الخلايا الظهارية اللمعية وطبقة خارجية من الخلايا القاعدية، وتتكون أساسا من الخلايا الظهارية، وتحيط بها غشاء الطابق السفلي 2 . لمراجعة جيدة على بنية الغدة الثديية والتنمية، يمكن للقارئ الرجوع إلى سترنليشت 1 . خلية الخلايا التفاعلات عبر الفجوة (غ)، ضيق (تي)، و تلتصق (آج) تقاطعات ضرورية للتطور الطبيعي وظيفة الغدة 1 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . المكونات الرئيسية لهذه التقاطعات في الغدة الثديية الفئران هي Cx26، Cx30، Cx32، و Cx43 (غ). كلودين -1، -3، -4، و -7 وزو-1 (تي)؛ و E-كادهيرين، P-كادهيرين، و β-كاتينين (آج) 7 ، 8 . مستويات التعبير عن هذه البروتينات متعددة وظيفية تختلف في طريقة تعتمد على مرحلة أثناء تطور الغدة الثديية، مما يشير إلى متطلبات التفاعل خلية خلية التفاضلية 9 . غ، تي، و آج ترتبط هيكليا ووظيفيا وحبل البروتينات الهيكلية أو التنظيمية الأخرى إلى المواقع المجاورة من الخلايا المجاورة، وبالتالي خلق علاقة الوصلية 10 . تكوين العلاقة الوصلية يمكن أن تؤثر على سد مع الهيكل الخلوي الكامنة، فضلا عن نفاذية العلاقة والاستقرار، ويمكن بالتالي تؤثر على وظيفة الغدة 8 ، 9 ، 10 ، 11 . مكونات تقاطعات بين الخلايا المقيمين في الوصلات الوصلي أو التفاعل مع بعضها البعض في ديفوقد تم تحليل مراحل النمو المتخلفة من تنمية الغدد الثديية مؤخرا باستخدام المناعي المشترك (شارك في إف) وشارك في مناعي (المشارك إب) 9 . في حين تسمح تقنيات أخرى لتقييم الارتباط الوظيفي بين البروتينات، لا يتم عرض هذه الأساليب في هذه المخطوطة.

كما البروتينات مجرد التصرف وحده للعمل، ودراسة التفاعلات البروتين البروتين (بي)، مثل نقل الإشارات والتسلسل الكيميائي الحيوي، أمر ضروري لكثير من الباحثين ويمكن أن توفر معلومات هامة عن وظيفة البروتينات. كو-إف والتحليل المجهري يساعد على تقييم عدد قليل من البروتينات التي تشترك في نفس الفضاء تحت الخلوية. ومع ذلك، فإن عدد الأهداف يقتصر على الأجسام المضادة، والتي يجب أن تثار في الحيوانات المختلفة، ومن خلال الوصول إلى المجهر متحد البؤر مجهزة ليزر مختلفة الطول الموجي وكاشف الطيفي لتعدد الإرسال. المشارك إب يؤكد أو يكشف التفاعلات المادية عالية تقارب بيتوإين اثنين أو أكثر من البروتينات المقيمين داخل مجمع البروتين. على الرغم من تطوير تقنيات جديدة، مثل مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) 12 وقرب ربط مقايسة (جيش التحرير الشعبى الصينى) 13 ، والتي يمكن أن تكتشف في وقت واحد توطين وتفاعلات البروتينات، إب المشترك يبقى تقنية مناسبة وبأسعار معقولة لدراسة التفاعلات بين البروتينات الذاتية.

طريقة خطوة بخطوة وصفها في هذه المخطوطة سيسهل دراسة توطين البروتين ومؤشرات الأداء القياسية، وتشير إلى المزالق لتجنب عند دراسة مؤشرات الأداء القياسية الذاتية في الغدد الثديية. تبدأ المنهجية مع عرض إجراءات المحافظة المختلفة للأنسجة المطلوبة لكل تقنية. الجزء 1 يعرض كيفية دراسة البروتين المشارك في توطين في ثلاث خطوات: ط) سيكتيونينغ من الغدد الثديية، إي) وضع علامات مزدوجة أو ثلاثية من البروتينات المختلفة باستخدام تقنية شارك في إف، و 3) التصوير منتوطين البروتين. الجزء 2 يبين كيفية ترسب البروتين الذاتية وتحديد البروتينات المتفاعلة في ثلاث خطوات: ط) إعداد المحللة، إي) غير مباشر مناعي البروتين، و 3) تحديد شريك ملزم من قبل سدز-بادج وغش لطخة الغربية. كل خطوة من هذا البروتوكول هو الأمثل للأنسجة الغدة الثديية القوارض ويولد ذات جودة عالية، محددة، وقابلة للتكرار النتائج. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول كنقطة انطلاق لدراسات مؤشر أسعار المنتجين في الأنسجة الأخرى أو خطوط الخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان في الجامعة (المعهد الوطني للإحصاء - أرماند-فرابير، لافال، كندا).

1. تحديد البروتين المشارك التعريب

  1. من الأنسجة إلى الشرائح المجهرية
    ملاحظة: يجب التعامل مع الأنسجة والأقسام على الجليد الجاف.
    1. استئصال الغدد الثديية من حيوان (للحصول على وصف كامل لهذا الإجراء، الرجوع إلى بلانتي وآخرون ) 14 .
    2. تضمين الأنسجة استئصال في تجميد / تصاعد المتوسطة على الجليد الجاف. إضافة ما يكفي من المتوسطة لتغطية الغدة. عندما يتم تدعيم المتوسطة، ونقل الأنسجة إلى الفريزر في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا 9 .
    3. باستخدام كريوميكروتوم مجموعة في ≤ -35 ​​درجة مئوية، وقطع الأنسجة إلى 7-10 ميكرون سميكة أقسام ووضعها على الشرائح المجهر.
      ملاحظة: عندما يكون ذلك ممكنا، ضع قسمين على كل شريحة. سيتم استخدام القسم الأيسر كالسيطرة إغاتيف للتحقق من خصوصية الأجسام المضادة و أوتوفلورزنس من الأنسجة، في حين سيتم وصف الجانب الأيمن مع الأجسام المضادة.
    4. الحفاظ على أقسام في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
  2. شارك في تلطيخ إف
    1. استرداد الشرائح المجهرية المناسبة من الفريزر وعلى الفور إصلاح المقاطع عن طريق غمر لهم في الفورمالديهايد 4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (رت).
    2. ثم تزج الشرائح في الفوسفات مخزنة المالحة (بس) في رت. ترك الشرائح في برنامج تلفزيوني في رت حتى الشروع في الخطوة التالية.
    3. قم بتدوير كل قسم من الشريحة باستخدام حاجز مسعور متاح تجاريا أو قلم مختبر طارد للماء (انظر جدول المواد ). يجب الحرص على عدم لمس الأنسجة. على الفور إضافة قطرات من برنامج تلفزيوني إلى الأنسجة ووضع الشريحة في غرفة الأنسجة الرطبة لبقية الإجراء.
      ملاحظة: يجب أن تبقى أقسام الأنسجة مرطب. لبديللي، استخدم مربع مع غطاء ومناشف ورقية رطبة في الجزء السفلي.
    4. منع كل قسم الأنسجة مع 100-200 ميكرولتر من 3٪ ألبومين المصل البقري (بسا) -Tris مخزنة المالحة (تبس) -0.1٪ بوليسوربات 20 (انظر جدول المواد ) لمدة 30 دقيقة في رت. في حين أن العينات تمنع، وإعداد الحلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية عن طريق تمييع الأجسام المضادة في تبس 0.1٪ بوليسوربات 20.
      ملاحظة: يتم توفير تركيز المطلوبة للجسم المضاد من قبل الشركة المصنعة. انظر جدول المواد والأشكال 1 و 2 للحصول على أمثلة، وكذلك دياناتي وآخرون. 9 - على الرغم من أنه ليس من الضروري للعمل في الظلام عند استخدام معظم الأجسام المضادة مترافق فلورفور، تجنب تعريض حلول الأجسام المضادة أو الأنسجة الملون إلى مكثفة، ضوء ساطع.
    5. إزالة الحل حجب عن طريق الشفط واحتضان الأقسام في 100-200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخفف لمدة 60 دقيقة في رت. Alternativelذ، احتضان مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    6. إزالة حل الأجسام المضادة الأولية عن طريق الشفط وغسل المقاطع مع 250-500 ميكرولتر من تبس-0.1٪ بوليسوربات 20 لمدة 5 دقائق. إزالة الحل غسل عن طريق الشفط وتكرار غسل مرتين.
    7. إزالة الحل غسل عن طريق الشفط واحتضان المقاطع مع 100-200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية فلورفور مترافق المناسب لمدة 60 دقيقة في رت.
    8. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية عن طريق الشفط وغسل المقاطع مع 250-500 ميكرولتر من تبس-0.1٪ بوليسوربات 20 لمدة 5 دقائق. إزالة الحل غسل وتكرار مرتين.
    9. كرر الخطوة 2.5-2.8 باستخدام مزيج مناسب من الأجسام المضادة الأولية والثانوية للبروتينات التالية من الفائدة.
    10. إزالة الحل غسل عن طريق الشفط وأداء تلطيخ نوى من خلال احتضان القسم مع 100-200 ميكرولتر من 1 ملغ / مل 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (دابي) في تبس 0.1٪ بوليسوربات 20 لمدة 5 دقائق فيRT.
    11. إزالة الحل دابي عن طريق الشفط وتركيب الشرائح باستخدام وسيلة للذوبان في الماء، غير متصاعدة تركيب (انظر جدول المواد ) و كوفرسليبس. المضي قدما شريحة واحدة في وقت واحد.
      ملاحظة: احتضان نواة وصمة عار لأكثر من 5 دقائق لن يغير شدة تلطيخ. بدلا من ذلك، إزالة الحل دابي على جميع الشرائح واحتضان الأنسجة في برنامج تلفزيوني في حين تصاعد الشرائح.
    12. وضع الشرائح شقة في 4 درجة مئوية الثلاجة لمدة 8 ساعة على الأقل. انتقل إلى التصوير المجهري مضان (انظر الشكلين 1 و 2 ).
  3. التصوير المجهري
    1. تصور الأجسام المضادة الثانوية فلورفور مترافق باستخدام المجهر متحد البؤر مجهزة ليزر مختلفة المطلوبة لإثارة فلوروفوريس في موجات محددة.
      ملاحظة: لتكون قادرة على تصور القنوات والحويصلات الهوائية، واقترح هدف 40X مع فتحة عددية من 0.95. امتحانه من الإعدادات المحددة في الشكل 1 .
    2. التحقق من توطين كل بروتين بشكل فردي عن طريق مسح الصورة طول موجة واحدة في ذلك الوقت.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، من المهم تحليل نقدي توطين البروتينات الوصلي. لتكون قادرة على تشكيل الوصلات الوصلية، يجب أن تكون هذه البروتينات مترجمة في غشاء البلازما.
    3. تحديد التوطين المشترك للبروتينات عن طريق دمج الصور الممسوحة ضوئيا مع أشعة الليزر في أطوال موجية مختلفة.
      ملاحظة: يمكن أن تصور البروتين المشارك التعريب عن طريق تغيير اللون الناتجة عن انبعاث اثنين أو أكثر فلوروفوريس في نفس الموقع ويمكن قياسها باستخدام البرنامج المناسب ( الشكلان 1 و 2 ؛ انظر أيضا المرجع 9).

2. دراسة مؤشر أسعار المنتجين

ملاحظة: يجب استخدام الغدد الثديية البطن لدراسة مؤشرات الأداء القياسية، والغدد الصدرية هي في ارتباط وثيق مع الصدريةالعضلات. استئصال الغدد الثديية (للحصول على وصف كامل لهذا الإجراء، راجع بلانتي وآخرون ) 14 والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

  1. إعداد المحللة
    1. وضع وزنها ورقة و 2 مل أنابيب ميكروسنتريفوج على الجليد الجاف لتبريد قبل لهم قبل الشروع في الخطوات التالية.
    2. اتخاذ الأنسجة الغدة الثديية من -80 درجة مئوية والاحتفاظ بها على الجليد الجاف.
    3. تزن الأنسجة على أوراق وزنها قبل المبردة ومن ثم نقل الأنسجة إلى 2 مل أنابيب ميكروسنتريفوج (التعامل مع الجليد الجاف). استخدام ما بين 50 و 100 ملغ من الأنسجة لكل عينة. الحفاظ على الأنسجة على الجليد الجاف حتى الخطوة 2.1.5.
    4. إعداد المبلغ المطلوب من العازلة تحلل المنظفات الثلاثي تستكمل مع ناف، نافو 3 ، ومثبط البروتياز / الفوسفاتيز، كما هو مبين في جدول المواد ، وذلك باستخدام الصيغ التالية. الفئران: العازلة المطلوبة (μL) = وزن الأنسجة الماوس (ملغ) × 3؛ الجرذ: مطلوبالعازلة (μL) = وزن الأنسجة الفئران (ملغ) × 5.
    5. إضافة المبلغ المطلوب من الجليد الباردة تحلل العازلة (المحسوبة في الخطوة 2.1.4) إلى أنبوب 2 مل تحتوي على الأنسجة.
      ملاحظة: في الخطوات 2.1.5-2.1.6، المضي قدما مع أنبوب واحد في وقت واحد.
    6. تجانس الأنسجة لمدة 30-40 ثانية باستخدام التجانس المستمر على طاحونة الأنسجة. دائما الحفاظ على أنبوب على الجليد. ضبط الخالط الأنسجة لسرعة متوسطة وتحريك بلطف طاحونة صعودا وهبوطا داخل الأنبوب.
    7. كرر الخطوات 1.6 و 1.7 مع أنابيب أخرى.
    8. احتضان لستات على الجليد لمدة 10-30 دقيقة.
    9. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 170 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    10. وفي الوقت نفسه، وتحديد 6-10 أنابيب ميكروسنتريفوج (0.6 مل) لكل عينة والاحتفاظ بها على الجليد.
    11. بمجرد الانتهاء من الطرد المركزي، والتحقق من الأنابيب. تأكد من أنها تحتوي على الطبقة العليا من الدهون، واضحة، الأصفر إلى الوردي لستات (اعتمادا على مرحلة من مراحل التنمية) وبيليه.
    12. إنشاء ثقب في طبقة الدهونوذلك باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر للوصول إلى المرحلة السائلة. تغيير غيض وجمع المحللة دون إزعاج بيليه أو الشفط طبقة الدهون. قسامة المحللة في أنابيب المسمى مسبقا على الجليد (الخطوة 2.1.11) وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    13. استخدام قسامة لقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مناسبة تجاريا مناسبة (انظر جدول المواد ).
  2. مناعي غير مباشر
    1. على الجليد، ذوبان الجليد اثنين أليكوتس من إجمالي الغدة الثديية المحللة أعدت سابقا.
      ملاحظة: سيتم استخدام قسامة واحدة ل إب من البروتين المستهدف، في حين أن الآخر سوف تكون بمثابة السيطرة السلبية.
    2. جمع 500-1،000 ميكروغرام من المحللة وتمييع ذلك في برنامج تلفزيوني للوصول إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر في كل أنبوب 1.5 مل.
      ملاحظة: كمية المحللة ليتم استخدامها يعتمد على وفرة البروتين من الفائدة وكفاءة الأجسام المضادة (انظر الشكل 3 للحصول علىمثال، وكذلك جدول المواد ). لتحسين كل هدف، يجب استخدام كميات مختلفة من المحللة ( أي 500 و 750 و 1000 ميكروغرام) والجسم المضاد ( أي 5 و 10 و 20 ميكروغرام). تابع الخطوات التالية (2.2.3-2.3.7.4).
    3. إضافة الأجسام المضادة ضد المستضد من الفائدة إلى الأنبوب الأول من المحللة والحفاظ على الجليد.
      ملاحظة: عادة ما يتم اقتراح المبلغ المطلوب على ورقة التعليمات التي تقدمها كل شركة (انظر جدول المواد ).
    4. في الأنبوب الثاني، وإعداد السيطرة السلبية عن طريق إضافة نفس تركيز السيطرة مفتش النمط إسوي كما الأجسام المضادة المستخدمة في الخطوة 2.2.3.
    5. احتضان الأنابيب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على أنبوب الأسطوانة خلاط في سرعة منخفضة.
    6. في اليوم التالي، إضافة 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى 1.5 مل أنابيب جديدة لغسل قبل.
      1. حدد بروتين A أو البروتين G الخرز المغناطيسي على أساس تقارب النسبي للجسم المضاد.
      2. من المهم تجنب استخدام الخرز المجمعة. مزج بلطف تعليق حبة حتى يتم إعادة تعليق بشكل موحد قبل إضافته إلى الأنابيب.
    7. وضع أنابيب تحتوي على الخرز على موقف المغناطيسي والسماح للخرز للهجرة إلى المغناطيس. إزالة المخزن المؤقت التخزين من الخرز باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
    8. غسل الخرز عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من بس-0.1٪ بوليسوربات 20 ودوامة أنابيب بقوة لمدة 10 ثانية.
    9. وضع الأنابيب مرة أخرى على موقف المغناطيسي والسماح للخرز للهجرة إلى المغناطيس.
    10. إزالة الفائض غسل العازلة التي بيبتينغ مع ماصة 200 ميكرولتر.
    11. إضافة مجمع التفاعل (ليسيت الأجسام المضادة) من الخطوة 2.2.5 إلى الخرز واحتضان لمدة 90 دقيقة في رت على خلاط الأسطوانة.
    12. وضع أنابيب على موقف المغناطيسي والسماح للخرز للهجرة إلى المغناطيس. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر، نضح وتجاهل المحللة ووضع أنابيب على الجليد.
    13. غسل حبةثانية عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، ووضع الأنابيب على موقف المغناطيسي، وإزالة السائل باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. كرر هذه الخطوة غسل. أثناء غسل الخطوات، تجنب فورتيكسينغ والحفاظ على عينات على الجليد.
    14. غسل الخرز مرة واحدة مع بس-0.1٪ بوليسوربات 20 دون فورتيكسينغ وتجاهل العازلة غسل الماضي باستخدام 200 ميكرولتر ماصة طرف.
    15. أزل، إضافة 20 ميكرولتر من 0.2 M جلايسين الحمضية (الرقم الهيدروجيني = 2.5) إلى أنابيب ويهز لهم لمدة 7 دقائق على خلاط الأسطوانة.
    16. الطرد المركزي بسرعة عالية لبضع ثوان (تدور سريع) وجمع طاف في أنبوب الجليد الباردة الجديدة.
    17. كرر الخطوات 2.2.14 و 2.2.15 لكل أنبوب.
      ملاحظة: سيكون حجم النهائي 40 ميكرولتر.
    18. إضافة 10 ميكرولتر من العازلة ليملي 4x إلى العينة ميكرولتر 40 ميكرولتر من الخطوة 2.2.16.
      ملاحظة: اللون سوف تتحول الصفراء بسبب درجة الحموضة الحمضية.
    19. على الفور إضافة 1 M تريس (الرقم الهيدروجيني = 8)، قطرة واحدة في وقت واحد، إلى عينة إلوتد من الخطوة 2.2.18 حتى لونهيتحول إلى اللون الأزرق. انتقل إلى الأنابيب القادمة.
    20. يغلي العينات من الخطوة 2.2.18 في 70-90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. انتقل فورا إلى هلام الكهربائي. بدلا من ذلك، نقل العينات إلى الثلاجة في -80 درجة مئوية حتى التحميل.
  3. تطبيق المصب: هلام الكهربائي تليها لطخة غربية
    1. إعداد فصل والتراص سدز-بادج المواد الهلامية الأكريلاميد (سمك 1.5 مم) بعد الإجراءات القياسية 15 .
      ملاحظة: يجب تحديد اختيار هلام (8-15٪ الأكريلاميد، التدرج: انظر جدول المواد ) على أساس الحجم الجزيئي للبروتين أن عجلت والشركاء ملزمة المحتملة ليتم تحليلها. يجب أن تحل هذه البروتينات من بعضها البعض للسماح لمناعي المناسبة.
    2. ذوبان الجليد المناعي (إب) - عينات المزالة (الخطوة 2.2.20) على الجليد.
    3. إعداد بروتين ليسيتس من نفس العينات (المستخدمة لإجراء إب أعلاه). استخدام 50ميكروغرام من مجموع المحللة وإضافة 4X العازلة عينة ليملي. يغلي العينات في 70-90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ومكان على الجليد حتى التحميل.
      ملاحظة: سيتم تحميل هذه العينات بجانب عينة إب إلوتد لإثبات وجود البروتينات عجلت في المحللة الكلي.
    4. تحميل ليسيتس استعداد من الخطوة 2.3.3 وعينات عجلت من الخطوة 2.2.20 جنبا إلى جنب في هلام الأكريلاميد وتشغيلها في تشغيل العازلة (10X العازلة تشغيل: 30.3 غرام من تريس، 144.1 غرام من الجلايسين، و 10 ز من سدز في 1 لتر من الماء المقطر) في 100 V لمدة تقريبية 95 دقيقة، أو حتى حافة البروتينات المهاجرة تصل إلى الجزء السفلي من هلام.
    5. نقل المواد الهلامية إلى نيتروسليلوز أو بفدف الغشاء باستخدام بروتوكول قياسي 9 ، 15 .
    6. منع الغشاء لمدة 1 ساعة على الروك على سرعة منخفضة في 5٪ الحليب الجاف تبس (20 ملي تريس، 500 ملي كلوريد الصوديوم، و 0.05٪ بوليسوربات 20).
    7. تحديد ما إذا كان هطول الأمطار هو النجاحcessful.
      1. دقق الغشاء باستخدام الأجسام المضادة الأولى ضد البروتين عجل، المخفف في 5٪ الجافة الحليب تبس في التركيز الموصى بها من قبل الشركة المصنعة، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على منصة هزاز مع التحريض بطيئة.
        ملاحظة: انظر جدول المواد للتوصيات.
      2. في اليوم التالي، وغسل الغشاء 3 مرات لمدة 5 دقائق مع كل تبس على منصة هزاز مع ارتفاع الإثارة.
      3. احتضان الغشاء في الأجسام المضادة الثانوية المناسبة مترافق مع البيروكسيديز الفجل (هرب)، المخفف في تبس، لمدة 1 ساعة في رت على منصة هزاز مع التحريض بطيئة.
        ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع فلوريكروم إذا كان جهاز مناسب للكشف عن إشارة متاحة.
      4. أداء 3 إلى 6 يغسل، كل لمدة 5 دقائق، مع تبس على منصة هزاز مع التحريض عالية. تحليل إشارة الأجسام المضادة الثانوية من خلال احتضان الغشاء مع تجاريا أمحلول لومينول قابل للفشل (انظر جدول المواد ) واتبع إرشادات الشركة المصنعة. كشف إشارة باستخدام نظام التصوير توهج (انظر جدول المواد ).
        ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصل على تحليل لطخة غربية، انظر المرجع 16.
    8. لتحديد البروتينات المتفاعلة، تنفيذ الخطوات 2.3.7.1-2.3.7.4 باستخدام الأجسام المضادة المناسبة على نفس لطخة.
      ملاحظة: إذا البروتينات تتفاعل، والشركاء ملزم سيتم إيمونوبريسيبيتاتد المشارك مع البروتين المستهدف، وبالتالي سوف تكون قابلة للكشف عن طريق النشاف الغربية. يمكن تكرار الخطوة 2.3.8 مع المزيد من الأجسام المضادة لتحديد ما إذا كانت البروتينات الأخرى تقيم في نفس البروتينات المعقدة، طالما الأوزان الجزيئية للبروتينات تختلف بما فيه الكفاية لتكون منفصلة جيدا على هلام والغشاء.
    9. وللتأكد من أن الشركاء الملزمين الذين تم تحديدهم ليسوا أفعالا، ينبغي تنفيذ الملكية الفكرية المتبادلة.
      ملاحظة: يتم تنفيذ هذا عن طريق تكرارالخطوات 2.2.1-2.2.20 مع نفس المحللة ولكن يعجل أحد الشركاء الملزم المحدد في الخطوة 3.8. ثم، يتم تكرار الخطوات 3،1-3،8 باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد البروتين الأول من الفائدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لتحديد ما إذا كان غ، آج، و مكونات تي يمكن أن تتفاعل معا في الغدة الثديية، تم تنفيذ المقايسات شارك إف أولا. وقد تم البحث عن Cx26، بروتين غ، و β- كاتينين، بروتين آج، مع الأجسام المضادة المحددة وكشف باستخدام فلوروفور مترافق الماوس 647 (الأخضر، بسيودوكولور) ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

خلية الخلايا التفاعلات عن طريق تقاطعات مطلوبة للوظيفة المناسبة وتطوير العديد من الأجهزة، مثل الغدة الثديية. وقد أظهرت الدراسات أن البروتينات الوصفي يمكن أن تنظم وظيفة واستقرار بعضها البعض وتفعيل تنبيغ الإشارة عن طريق الربط بعضها البعض في غشاء الخلية 10...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفين ليس لديهم ما يعلن.

Acknowledgements

يتم تمويل إب من قبل مجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث في كندا منحة (نسيرك # 418233-2012)؛ (فروز دي ريشيرتش دو كيبيك-Santé (فروس)، وهي جائزة مهنية لمؤسسة سرطان الثدي في كيبيك، ومنحة ليدر فونز من منحة المؤسسة الكندية للابتكار. حصل إد على منحة دراسية من مؤسسة ونيفرزيتير أرماند-فرابير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Mice strain and stageSt. Constant, Quebec, CanadaC57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock)1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock)1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing mediaVWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada95067-840VMR frozen sections compound 
MicrotomeMississauga, ON, Canada956640Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
BladesC.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, CanadaBLM1001CHigh profile gold coated blades
Pap penCedarlane, Burlington, ON, Canada8899Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slidesFisher Scientific, Burlington, ON, Canada12-550-15Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
FormaldehydeBioShop Canada Inc, Burlington, ON, CanadaFOR201.1Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA)Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution3% BSA in TBS
Wash solutionTBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20Oakville, ON, CanadaP 9416Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting mediaCedarlane, Burlington, ON17984-25(EM)Fluoromount-G
First & secondary antibodiesCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsE-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsClaudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada See Commentsβ-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsConnexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stainFisher Scientific, Burlington, ON, CanadaD1306DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscopeNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysisNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.01) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitorFisher Scientific, Burlington, ON78441Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosageThermo Scientific, Rockford, Illinois, USA23225Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinderFisher Scientific, Burlington, ONFTH-115Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and standMillipore, Etobicoke, ON, CanadaPureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IPPBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsIgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsIgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationSigma-Aldrich, Oakville, ON, CanadaSee CommentsConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsE-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada16107474x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine Fisher Scientific, Burlington, ONPB381-50.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris Fisher Scientific, Burlington, ONBP152-11 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1610180 -5TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
MembranesBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer methodBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704155Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry MilkSmucker Food of Canada Co, Markham, ON, CanadaFat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blotsTBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsE-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsClaudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsClaudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1705061Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1708280ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, CanadaImageLab 5.2 software 

References

  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074(2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

123

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved