JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Hücre içi kavşak, meme bezi aşamasına özgü fonksiyonlar ve gelişim için şarttır. Bu el yazması, protein-protein etkileşimlerinin (PPI'lar) çalışılması ve murin meme bezlerinin birlikte lokalizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu teknikler, farklı gelişim evrelerinde hücre-içi kavşaklar arasındaki fiziksel ilişkinin dinamiklerinin araştırılmasına olanak tanır.

Özet

Hücre-hücre etkileşimleri doku bütünlüğünü ve meme bezinin farklı bölmeleri arasındaki bariyerin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Bu etkileşimler, komşu hücreler arasında bağlar oluşturan bağlantılı proteinler tarafından sağlanmaktadır. Junctional protein mislokalizasyonu ve bağlanma partnerleriyle fiziksel birleşmelerin azalması, fonksiyon kaybına ve dolayısıyla organ işlev bozukluğuna neden olabilir. Bu nedenle, normal ve hastalıkla ilişkili dokulardaki protein lokalizasyonunu ve protein-protein etkileşimlerini (PPI'leri) tanımlamak, gelişme durumundaki hastalıkların veya değişikliklerin ilerlemesine yol açan yeni kanıt ve mekanizmalar bulmak için gereklidir. Bu el yazması, murin meme bezlerinde PPI'ları değerlendirmek için iki aşamalı bir yöntem sunmaktadır. Protokol bölüm 1'de, ilgilenilen proteinlere karşı geliştirilen antikorları, ardından florokromlarla etiketlenmiş ikincil antikorları kullanarak birlikte immünofloresans (co-IF) gerçekleştirmek için bir yöntem anlatılmıştır. Hep birlikte olsa daProteinlerin yakınlığının gösterilmesi için, fiziksel etkileşimlerini incelemeyi mümkün kılar. Bu nedenle, birlikte immüno çökelme (co-IP) için ayrıntılı bir protokol, protokol bölüm 2'de sağlanmaktadır. Bu yöntem, bu etkileşimlerin doğrudan veya dolaylı olup olmadığını teyit etmeden proteinler arasındaki fiziksel etkileşimleri belirlemek için kullanılır. Son birkaç yılda birlikte-IF ve birlikte IP teknikleri, hücrelerarası kavşaklardaki belirli bileşenlerin birlikte nöbetleşip birbirleriyle etkileşimde bulunduğunu ve meme bezi gelişiminde değişen aşamaya bağlı bileşke bağları oluşturduğunu göstermiştir.

Giriş

Meme bezi büyüme ve gelişme esas olarak doğumdan sonra gerçekleşir. Bu organ, bir memelinin üreme hayatında kendisini sürekli olarak yeniden şekillendirir 1 . Yetişkin meme bezi epitelyumu luminal epitelyal hücrelerin bir iç tabaka ve esasen miyoepitelyal hücrelerden oluşan, bazal membranla çevrili 2 bir bazal hücre tabakasından oluşur. Meme bezi yapısı ve gelişimiyle ilgili iyi bir inceleme için, okuyucu Sternlicht 1'e başvurabilir. Boşluk (GJ), sıkı (TJ) ve adherens (AJ) kavşakları yoluyla hücre-hücre etkileşimleri, bezin normal gelişimi ve fonksiyonu için 1 , 3 , 4 , 5 , 6 için gereklidir. Bu fare bağırsağındaki bu kavşakların ana bileşenleri Cx26, Cx30, Cx32 ve Cx43'tür (GJ); Claudin-1, -3, -4 ve -7 veZ0-1 (TJ); Ve E-cadherin, P-kadherin ve β-katenin (AJ) 7,8. Bu farklı jonksiyonel proteinlerin ekspresyon seviyeleri, meme bezi gelişimi esnasında aşamaya bağlı bir şekilde değişir ve farklı hücre-hücre etkileşim gereksinimlerini önermektedir 9 . GJ, TJ ve AJ yapısal ve işlevsel olarak birbirine bağlanır ve diğer yapısal veya düzenleyici proteinleri komşu hücrelere komşu bölgelere bağlarlar ve böylece bir bağlantılı bağ 10 oluştururlar. Bağlantılı bağın bileşimi, alttaki hücre iskeletiyle köprü oluşturmayı, ayrıca bağın geçirgenliğini ve stabilitesini etkileyebilir ve dolayısıyla bezin işlevini etkileyebilir 8 , 9 , 10 , 11 . Bileşik bağlarda bulunan veya diferansiyel olarak birbirleri ile etkileşen hücrelerarası kavşak bileşenleriMeme bezi gelişiminin gelişmekte olan aşamaları, yakın zamanda, birlikte immünfloresans (co-IF) ve birlikte immüno çöktürme (co-IP) 9 kullanılarak analiz edildi. Diğer teknikler, proteinler arasındaki fonksiyonel ilişkinin değerlendirilmesini sağlarken, bu metotlar bu elyazmasında sunulmamaktadır.

Proteinlerin sadece işlev için tek başına hareket etmesi nedeniyle, sinyal transdüksiyonları ve biyokimyasal kaskadlar gibi protein-protein etkileşimlerinin (PPI'lar) çalışılması birçok araştırmacı için çok önemlidir ve proteinlerin fonksiyonu hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Eş-IF ve mikroskobik analiz, aynı hücre altı alanı paylaşan birkaç proteinin değerlendirilmesine yardımcı olur. Bununla birlikte, hedeflerin sayısı, farklı hayvanlarda yetiştirilmesi gereken antikorlarla ve farklı dalga boylu lazerler ve çoklama için bir spektral dedektör ile donatılmış bir konfokal mikroskopa erişimle sınırlandırılmıştır. Co-IP, yüksek afiniteli fiziksel etkileşimleri teyit eder veya ortaya çıkarırBir protein kompleksinde bulunan iki veya daha fazla protein. Eşzamanlı olarak proteinlerin lokalizasyonunu ve etkileşimlerini saptayabilen floresans rezonans enerji transferi (FRET) 12 ve yakınlık ligasyonu deneyi (PLA) 13 gibi yeni teknikler geliştirilmesine rağmen, co-IP, arasındaki karşılıklı etkileşimleri incelemek için uygun ve uygun bir teknik olarak kalmaya devam etmektedir Endojen proteinler.

Bu el yazmasında anlatılan adım adım yöntem, protein lokalizasyonu ve ÜFE'lerin incelenmesini kolaylaştıracak ve meme bezlerinde endojen PPI'ları incelerken kaçınmak için tuzaklara işaret edecektir. Metodoloji, her bir teknik için gerekli olan dokular için farklı koruma prosedürlerinin sunulmasıyla başlar. Bölüm 1, üç aşamalı olarak protein ortak lokalizasyonu üzerinde çalışmayı göstermektedir: i) meme bezlerinin kesitlenmesi, ii) ko-IF tekniği kullanılarak farklı proteinlerin çift veya üçlü etiketlenmesi ve iii)Protein lokalizasyonu. Bölüm 2, endojen bir proteinin çökeltilmesi ve etkileşen proteinlerin üç aşamada nasıl belirleneceğini göstermektedir: i) lizat hazırlama, ii) dolaylı protein immunopresipitasyonu ve iii) SDS-PAGE ve Western blot ile partner tanımlamanın bağlanması. Bu protokolün her basamağı kemirgen meme bezi dokuları için optimize edilmiştir ve yüksek kaliteli, spesifik ve tekrarlanabilir sonuçlar üretir. Bu protokol, diğer dokulardaki veya hücre hatlarındaki PPI çalışmalarının başlangıç ​​noktası olarak da kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvan protokolleri, Üniversite Hayvan Bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Kanada).

1. Proteinlerin birlikte lokalizasyonunu tanımlama

  1. Dokudan mikroskopik slaytlara
    NOT: Dokular ve bölümler kuru buz üzerinde ele alınmalıdır.
    1. Memede bezlerini bir hayvandan tüketin (bu prosedürün tam açıklaması için, Plante ve diğerlerine başvurun). 14 .
    2. Çıkarılan dokuyu dondurma / kurulum ortamında kuru buz üzerine katıştırın. Bezi kapatacak kadar orta ekleyin. Ortam katılaştığında, dokuları daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de bir dondurucuya aktarın 9 .
    3. ≤ -35 ​​° C'de bir cryomicrotome seti kullanarak, dokuları 7-10 μm kalınlıkta kesitlere bölün ve mikroskop lamlarına yerleştirin.
      NOT: Mümkün olduğunda her slayta iki bölüm yerleştirin; Sol bölüm birAntikorların özgüllüğünü ve dokunun otofloresansını doğrulamak için egal kontrol, sağ taraf antikorlarla etiketlenecek.
    4. Daha sonra kullanmak için bölümleri -80 ° C'de tutun.
  2. Co-IF boyama
    1. Dondurucudan uygun mikroskopik slaytları alın ve bölümleri oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca% 4 formaldehit içine daldırarak hemen sabitleyin.
    2. Daha sonra, slaytları oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) içine daldırın. Bir sonraki adıma geçinceye kadar plakları RT'de bırakın.
    3. Saydamın her bir bölümünü, piyasada bulunan bir hidrofobik bariyer veya su itici bir laboratuar kalemi kullanarak daire içine alın (bkz . Malzeme Tablosu ). Doku dokunmamaya özen gösterin. Hemen dokuya PBS damlası ekleyin ve sondayı prosedürün geri kalan kısmı için nemli bir histoloji odasına yerleştirin.
      NOT: Doku parçaları nemli kalmalıdır. AlternatifLy, kapaklı bir kutu kullanın ve altına ıslak kağıt havlu koyun.
    4. Her bir doku kesitini oda sıcaklığında 30 dakika süreyle 100-200 μL% 3 sığır serum albümini (BSA) -Tris tamponlu salin (TBS) -0.1% polisorbat 20 ile bloke edin (Malzeme Listesine bakın ). Numuneler bloke ederken, antikorları TBS-% 0.1 polisorbat 20'de sulandırarak primer ve sekonder antikor solüsyonlarını hazırlayın.
      NOT: Antikor için gereken konsantrasyon üretici tarafından sağlanır; Örnekler için Malzeme Tablosu ve Şekil 1 ve 2'ye ve Dianati ve ark. 9 . Çoğu fluorofor konjuge antikoru kullanırken karanlık ortamda çalışmanız gerekmese de, antikor solüsyonlarını veya lekelenmiş dokuları yoğun, parlak ışığa maruz bırakmaktan kaçının.
    5. Engelleme solüsyonunu aspirasyonla çıkartın ve 100-200 μL seyreltilmiş primer antikor içindeki bölümleri RT'de 60 dakika inkübe edin. Seçenek olarakY, birincil antikor ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    6. Aspire edilerek birincil antikor çözeltisini çıkarın ve bölümleri 5 dakika için 250-500 μL TBS-% 0.1 polisorbat 20 ile yıkayın. Yıkama solüsyonunu aspirasyonla çıkartın ve yıkamayı iki kez tekrarlayın.
    7. Yıkama solüsyonunu aspirasyonla çıkartın ve bölümleri oda sıcaklığında 60 dakika boyunca uygun florofor konjuge sekonder antikor ile 100-200 μL inkübe edin.
    8. Aspirasyon ile ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve bölümleri 5 dakika için 250-500 mcL TBS-% 0.1 polisorbat 20 ile yıkayın. Yıkama solüsyonunu çıkarın ve iki kez tekrarlayın.
    9. İlgili protein (ler) için birincil ve ikincil antikorların uygun birleşimini kullanarak adım 2.5-2.8'yi tekrarlayın.
    10. Yıkama solüsyonunu aspirasyonla çıkartın ve 100-200 μL 1 mg / mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile TBS-% 0.1 polisorbat 20'de 5 dakika inkübe ederek çekirdekler boyama işlemini gerçekleştirin.RT.
    11. DAPI özümünü aspirasyonla çıkartın ve slaytları, suda çözünür, fluoresan olmayan bir montaj ortamı ( Malzeme Tablosuna bakın ) ve lamelleri kullanarak monte edin. Her seferinde bir slaydı ilerleyin.
      NOT: Çekirdek lekesini 5 dakikadan fazla inkübe ederek lekelenme yoğunluğu değişmez. Alternatif olarak, tüm slaytlardaki DAPI özümünü çıkarın ve slaytları takarken dokuları PBS'de inkübe edin.
    12. Slaytları 4 ° C'lik bir buzdolabında düz olarak en az 8 saat bekletin. Floresan mikroskopik görüntülemeye devam edin (bakınız Şekil 1 ve 2 ).
  3. Mikroskobik görüntüleme
    1. Floroforlara konjuge sekonder antikorları, spesifik dalga boylarında fluoroforları uyarmak için gereken çeşitli lazerlerle donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak görselleştirin.
      Not: Kanalları ve alveolleri görselleştirmek için sayısal açıklık 0.95 olan 40X objektif önerilir. Bir örnekE, Şekil 1'de verilmiştir .
    2. O zaman bir dalga boyundaki görüntüyü tarayarak her bir proteinin lokalizasyonunu tek tek doğrulayın.
      Not: Bu aşamada, bağlantı proteinlerinin lokalizasyonunu eleştirel olarak analiz etmek önemlidir. Jonksiyonel bağları oluşturabilmek için bu proteinlerin plazma membranında lokalize edilmesi gerekir.
    3. Farklı dalga boylarındaki lazerlerle taranan görüntüleri birleştirerek proteinlerin birlikte lokalizasyonunu belirleyin.
      Not: Protein ko-lokalizasyonu, aynı yerde iki veya daha fazla floroforun emisyonundan kaynaklanan renk değişikliği ile görülebilir ve uygun yazılım kullanılarak ölçülebilir ( Şekil 1 ve 2 ; ayrıca bkz. Referans 9).

2. ÜFE'lerin incelenmesi

NOT: Göğüs bezleri pektoral ile yakın ilişki içindedir, PPI'ları incelemek için abdominal meme bezleri kullanılmalıdırkaslar. Memeler bezlerini ayırın (bu prosedürün tam bir açıklaması için, Plante ve ark.na bakın) 14 ve daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de tutun.

  1. Lisat hazırlama
    1. Tartı kağıdı ve 2 mL'lik mikrosantrifüj tüplerini bir sonraki adımlara geçmeden önce soğutmak için kuru buz üzerine yerleştirin.
    2. -80 ° C'den meme bezi dokusunu alın ve kuru buzda tutun.
    3. Dokuları önceden soğutulmuş tartım kağıtlarına tartın ve sonra dokuyu 2 mL mikrosantrifüj tüplerine (kuru buz üzerinde tutun) aktarın. Numune başına 50 ila 100 mg arasında doku kullanın. Doku 2.1.5 adıma kadar kuru buzda tutun.
    4. Aşağıdaki formülleri kullanarak, Malzemelerin Tablosunda belirtildiği üzere, NaF, NaVO3 ve proteaz / fosfataz inhibitörü ile takviye edilmiş gerekli üçlü deterjan liziz tamponunu hazırlayın. Fareler: gerekli tampon maddesi (μL) = fare dokusu ağırlığı (mg) x 3; Sıçan: gerekliTampon (μL) = sıçan doku ağırlığı (mg) x 5.
    5. Doku içeren 2 mL'lik tüp içine gereken miktarda buz gibi lizis tamponu (adım 2.1.4'de hesaplanmıştır) ekleyin.
      NOT: Adım 2.1.5-2.1.6'da, aynı anda tek bir boru ile devam edin.
    6. Doku değirmeni üzerinde sürekli homojenleştirme kullanarak dokuyu 30-40 s boyunca homojenize edin; Tüpü daima buzda tutun. Doku homojenleştiricisini orta hıza ayarlayın ve öğütücü tüpün içinde yukarı ve aşağı hareket ettirin.
    7. Diğer tüplerle birlikte 1.6 ve 1.7 adımlarını tekrarlayın.
    8. Lizatları buz üzerinde 10-30 dakika inkübe edin.
    9. Tüpleri 170 xg'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin.
    10. Bu arada, her numune için 6-10 mikro santrifüj tüpünü (0.6 mL) belirleyin ve buz üzerinde saklayın.
    11. Santrifüj tamamlandıktan sonra tüpleri kontrol edin. Yağların en üst tabakasını, berrak, sarıdan pembe lizatları (gelişme aşamasına bağlı olarak) ve bir pelet içerdiklerinden emin olun.
    12. Lipid tabakasında bir delik açSıvı faza erişmek için 200 μL'lik bir pipet kullanarak. Ucu değiştirin ve pelleti bozmadan veya lipit katmanını aspiremeden lisatı toplayın. Lizatı önceden etiketli tüpler halinde buz üzerinde paylaştırın (adım 2.1.11) ve -80 ° C'de saklayın.
    13. Uygun bir piyasada bulunan kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek için bir kısım kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Dolaylı immüno çökelme
    1. Buz üzerinde, daha önce hazırlanan toplam meme bezi lizatlarının iki alikurosunu çözdürün.
      NOT: Hedef proteinin IP'si için bir alikot kullanılırken diğeri negatif kontrol olarak kullanılır.
    2. Her 1,5 mL'lik tüpte 200 μL'lik nihai bir hacme ulaşmak için 500-1,000 μg lizat toplayın ve PBS'de seyreltin.
      NOT: Kullanılacak lisat miktarı, ilgili proteinin bolluğuna ve antikorun etkinliğine bağlıdır (bakınız Şekil 3N örneği ve Malzeme Tablosu ). Her hedef için optimize etmek için, farklı miktarlarda lizat ( örn., 500, 750 ve 1000 μg) ve antikor ( örn., 5, 10 ve 20 μg) kullanılmalıdır. Aşağıdaki adımları uygulayın (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Antijeni ilgi antijenine karşı lizatın ilk tüpüne ekleyin ve buz üzerinde tutun.
      NOT: Gerekli miktar genellikle her şirket tarafından verilen talimat sayfasında önerilir (Malzeme Tablosuna bakınız ).
    4. İkinci tüpte, adım 2.2.3'te kullanılan antikor ile aynı konsantrasyonda izotip IgG kontrolü ekleyerek negatif bir kontrol hazırlayın.
    5. Tüpleri gece boyunca 4 ° C'de düşük hızda bir tüp makaralı karıştırıcıda inkübe edin.
    6. Ertesi gün, ön yıkama için yeni 1.5 mL tüplere 50 μL manyetik boncuk ekleyin.
      1. Antikora göreceli yakınlık temelinde Protein A veya Protein G manyetik boncuklardan birini seçin.
      2. Birikmiş boncuk kullanmaktan kaçınmak önemlidir; Boncuk süspansiyonunu tüplere eklemeden önce eşit olarak tekrar süspanse edilinceye kadar hafifçe karıştırın.
    7. Boncukları içeren tüpleri manyetik standa yerleştirin ve boncukların mıknatısa geçmesine izin verin. 200 uL'lik bir pipet kullanarak boncuklardan saklama tamponunu çıkarın.
    8. 500 μL PBS-% 0.1 polisorbat 20 ekleyerek boncuk yıkayın ve 10 saniye boyunca şiddetle vorteks tüpleri.
    9. Tüpleri tekrar manyetik standa koyun ve boncukların mıknatısa geçmesine izin verin.
    10. 200 uL'lik bir pipetle pipetle aşırı yıkama tamponunu çıkarın.
    11. Adım 2.2.5'ten gelen reaksiyon kompleksini (lizat-antikor) boncuklara ekleyin ve oda sıcaklığında 90 dakika rulo karıştırıcıda inkübe edin.
    12. Tüpleri manyetik standa yerleştirin ve boncukların mıknatısa geçmesine izin verin. 200 mcL'lik bir pipet kullanarak lisatı aspire edin ve atın ve tüpleri buz üzerine yerleştirin.
    13. Boncuğu yıkaS PBS 500 mcL ekleyerek, manyetik stand tüpler yerleştirerek ve 200 mcL pipet kullanarak sıvı kaldırma. Bu yıkama adımı tekrarlayın. Yıkama basamakları sırasında vorteks oluşumundan kaçının ve örnekleri buzda tutun.
    14. Boncukları bir kez vortekslenmeden PBS-% 0.1 polisorbat 20 ile yıkayın ve 200 μL pipet ucu kullanarak son yıkama tamponunu atın.
    15. Elüte etmek için, tüplere 0.2 M asit glisin (pH = 2.5) 20 uL ekleyin ve silindir mikseri üzerinde 7 dakika boyunca sallayın.
    16. Birkaç saniye yüksek hızda santrifüjleyin (hızlı sıkma) ve süpernatanı taze, buz gibi bir tüp içerisinde toplayın.
    17. Her bir tüp için 2.2.14 ve 2.2.15 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Nihai hacim 40 μL olacaktır.
    18. Adım 2.2.16'dan 40 μL seyreltilmiş numuneye 10 uL 4x Laemmli tamponu ekleyin.
      NOT: Asitik pH nedeniyle renk sarı renge dönecektir.
    19. Hemen adım adım 2.2.18'den çıkan elüsyon örneğine, bir defada bir damla 1 M Tris (pH = 8), renkMaviye dönüyor. Bir sonraki tüplere geçin.
    20. Adım 2.2.18'den 70-90 ° C'de 10 dakika kaynatın. Jel elektroforezine hemen devam edin. Alternatif olarak, numuneleri yükleyene kadar -80 ° C'de bir dondurucuya aktarın.
  3. Aşağı akım uygulaması: jel elektroforezi ardından Western blot
    1. Standart prosedürler izlenerek 15 SDS-PAGE akrilamid jelleri ayırma ve istifleme hazırlayın ( 15 mm kalınlık).
      NOT: Jel seçimi (% 8-15 akrilamid, gradyan: Malzeme Tablosuna bakınız ), çöktürülecek proteinin molekül boyutuna ve analiz edilecek potansiyel bağlanma ortaklarına göre belirlenmelidir. Bu proteinler, uygun bağışıklık tespiti için birbirinden ayrılmalıdır.
    2. İmmünopresipitasyon (IP) ile akıtılmış örnekleri (adım 2.2.20) buz üzerinde çözün.
    3. Aynı numunelerden protein lizatları hazırlayın (yukarıdaki IP prosedürü için kullanılır). 50'yi kullanΜg toplam lizat ilave edin ve 4X Laemmli numune tamponu ilave edin. Numuneleri 70-90 ° C'de 5 dakika kaynatın ve yükleme yapana kadar buz üzerine koyun.
      NOT: Bu numuneler, toplam lisatta çökelen proteinlerin varlığını göstermek için ayrılmış IP örneğinin yanında yüklenecektir.
    4. Adım 2.3.3'ten hazırlanan lizatları ve adım 2.2.20'deki çökelen numuneleri bir akrilamid jeline yükleyin ve akan tamponda (10x akan tampon: 30.3 g Tris, 144.1 g glisin ve 10 G SDS, 1 L damıtılmış su içinde) yaklaşık olarak 95 dakika süreyle 100 V'de veya göç eden proteinlerin kenarı jelin tabanına erişene kadar karıştırın.
    5. Jelleri standart bir protokol 9 , 15 kullanarak bir nitroselüloz veya PVDF zarına aktarın.
    6. Memeyi,% 5 kuru süt-TTBS'de (20 mM Tris, 500 mM NaCl ve% 0.05 polisorbat 20) düşük hızda bir rocker üzerinde 1 saat bloke edin.
    7. Yağışın başarılı olup olmadığını belirleyincessful.
      1. Çökeltilmiş proteine ​​karşı ilk antikoru kullanarak membranı probleyin, üretici tarafından önerilen konsantrasyonda% 5 kuru süt-TTBS'de seyreltin, yavaşça çalkalanarak sallanan bir platformda gece boyunca 4 ° C'de.
        NOT: Öneriler için Malzeme Tablosu'na bakın.
      2. Ertesi gün, membranı yüksek sallanma ile sallanan bir platformda TTBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
      3. Membranı, yavaş çalkalanarak sallanan bir platformda RT'de 1 saat süreyle, TTBS'de seyreltilmiş yaban turbu peroksidazı (HRP) ile konjüge konmuş uygun sekonder antikorda inkübe edin.
        NOT: Alternatif olarak, bir florokrom ile konjuge edilmiş ikincil bir antikor, sinyali algılamak için uygun bir cihaz bulunduğu takdirde kullanılabilir.
      4. Yüksek çalkalamayla sallanan bir platformda TTBS ile, her biri 5 dakika boyunca 3 ila 6 yıkama gerçekleştirin. Memeyi, ticari olarak bir a ile inkübe etmek suretiyle ikincil antikorun sinyalini analiz edin(Bkz . Malzeme Tablosu ) ve üreticinin talimatlarını izleyin. Bir kemilüminesans görüntüleme sistemi kullanarak sinyali algılayın (Malzeme Tablosuna bakın ).
        NOT: Western blot analizi ile ilgili ayrıntılı bir protokol için Referans 16'ya bakın.
    8. Etkileşen proteinleri tanımlamak için aynı leke uygun antikorları kullanarak 2.3.7.1-2.3.7.4 adımlarını uygulayın.
      NOT: Proteinler etkileşime giriyorsa, bağlanma ortakları hedef protein ile birlikte immüno-çökeltilmiş olacak ve bu nedenle Western blotlama ile saptanabilecektir. Adım 2.3.8, proteinlerin moleküler ağırlıkları jel ve zar üzerinde iyi ayrılmaya yetecek kadar farklı olduğu sürece, diğer proteinlerin aynı protein kompleksinde bulunup bulunmadığını belirlemek için daha fazla antikorla tekrarlanabilir.
    9. Tanımlanan bağlayıcı ortakların eserler olmadığını doğrulamak için karşılıklı IP yapılmalıdır.
      NOT: Bu,Adım 2.2.1-2.2.20'de aynı lizata sahip olmakla birlikte adım 3.8'de tanımlanan bağlayıcı ortaklardan birini tırmandı. Ardından, adımlar 3.1-3.8, ilgilenilen ilk proteine ​​karşı birincil antikor kullanılarak tekrarlanır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

GJ, AJ ve TJ bileşenlerinin meme bezinde birlikte etkileşip etkileşip etkileşip değişime uğramayacağını belirlemek için, ilk önce co-IF testleri gerçekleştirildi. Bir GJ protein olan Cx26 ve bir AJ proteini olan β-Catenin, spesifik antikorlarla araştırıldı ve sırasıyla florofor konjuge fare-647 (yeşil, sahte renkler) ve keçi-568 (kırmızı) antikorları kullandıklarını ortaya koydu ( Şekil 1B ve C ) . Veriler, sarı renkli ( <...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bağırsak yoluyla hücre-hücre etkileşimleri, meme bezi gibi birçok organın düzgün işleyişi ve gelişimi için gereklidir. Araştırmalar junctional proteinlerin birbirlerinin işlev ve istikrarını düzenleyebildiğini ve sinyal iletimini hücre zarı 10'da birbirine bağlayarak aktive edebildiğini göstermiştir. Mevcut el yazmasında sunulan protokoller, normal fare bezi gelişiminde junctional protein diferansiyel ifadesi, lokalizasyonu ve etkileşimi hakkında ilginç bulgular...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

IP, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmektedir (NSERC # 418233-2012); Bir Quebec Meme Kanseri Vakfı kariyer ödülü olan bir Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS) ve Canadian Foundation for Innovation hibe için bir Leader Founds yardımı. ED, Fondation universitaire Armand-Frappier'den bir burs aldı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Mice strain and stageSt. Constant, Quebec, CanadaC57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock)1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock)1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing mediaVWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada95067-840VMR frozen sections compound 
MicrotomeMississauga, ON, Canada956640Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
BladesC.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, CanadaBLM1001CHigh profile gold coated blades
Pap penCedarlane, Burlington, ON, Canada8899Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slidesFisher Scientific, Burlington, ON, Canada12-550-15Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
FormaldehydeBioShop Canada Inc, Burlington, ON, CanadaFOR201.1Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA)Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution3% BSA in TBS
Wash solutionTBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20Oakville, ON, CanadaP 9416Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting mediaCedarlane, Burlington, ON17984-25(EM)Fluoromount-G
First & secondary antibodiesCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsE-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsClaudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada See Commentsβ-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsConnexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stainFisher Scientific, Burlington, ON, CanadaD1306DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscopeNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysisNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.01) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitorFisher Scientific, Burlington, ON78441Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosageThermo Scientific, Rockford, Illinois, USA23225Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinderFisher Scientific, Burlington, ONFTH-115Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and standMillipore, Etobicoke, ON, CanadaPureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IPPBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsIgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsIgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationSigma-Aldrich, Oakville, ON, CanadaSee CommentsConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsE-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada16107474x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine Fisher Scientific, Burlington, ONPB381-50.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris Fisher Scientific, Burlington, ONBP152-11 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1610180 -5TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
MembranesBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer methodBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704155Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry MilkSmucker Food of Canada Co, Markham, ON, CanadaFat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blotsTBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsE-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsClaudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsClaudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1705061Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1708280ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, CanadaImageLab 5.2 software 

Referanslar

  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074(2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 123Meme bezi geli imifareprotein protein etkile imibirlikte lokalizasyonh cre h cre etkile imlerijonksiyonel u larconneksinlercadherinlerclaudinscateninler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır