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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Interzelluläre Übergänge sind Requisiten für Brustdrüsen-Bühnenspezifische Funktionen und Entwicklung. Dieses Manuskript liefert ein detailliertes Protokoll für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) und Co-Lokalisierung mit Hilfe von murinen Brustdrüsen. Diese Techniken erlauben die Untersuchung der Dynamik der physikalischen Assoziation zwischen interzellulären Übergängen in verschiedenen Entwicklungsstadien.

Zusammenfassung

Zell-Zell-Interaktionen spielen eine zentrale Rolle bei der Erhaltung der Gewebeintegrität und der Barriere zwischen den verschiedenen Kompartimenten der Brustdrüse. Diese Wechselwirkungen werden durch junctionale Proteine ​​bereitgestellt, die Nexus zwischen benachbarten Zellen bilden. Junctional Protein-Mislocalisierung und reduzierte physikalische Assoziationen mit ihren Bindungspartnern können zum Verlust der Funktion und damit zur Organ-Dysfunktion führen. Somit ist die Identifizierung von Proteinlokalisierung und Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) in normalen und krankheitsbezogenen Geweben unerlässlich, um neue Beweise und Mechanismen zu finden, die zum Fortschreiten von Krankheiten oder Veränderungen im Entwicklungsstatus führen. Dieses Manuskript stellt eine zweistufige Methode zur Beurteilung von PPIs in murinen Brustdrüsen dar. Im Protokollabschnitt 1 wird ein Verfahren zur Durchführung von Co-Immunfluoreszenz (Co-IF) unter Verwendung von Antikörpern, die gegen die interessierenden Proteine ​​angehoben werden, gefolgt von sekundären Antikörpern, die mit Fluorochromen markiert sind, beschrieben. Obwohl Co-IF alleOws für die Demonstration der Nähe der Proteine, macht es möglich, ihre physikalischen Wechselwirkungen zu studieren. Daher wird im Protokollabschnitt 2 ein detailliertes Protokoll zur Co-Immunpräzipitation (Co-IP) bereitgestellt. Dieses Verfahren wird verwendet, um die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu bestimmen, ohne zu bestätigen, ob diese Wechselwirkungen direkt oder indirekt sind. In den letzten Jahren haben Co-IF- und Co-IP-Techniken gezeigt, dass bestimmte Komponenten von interzellulären Knotenpunkten zusammen lokalisieren und miteinander interagieren, wodurch stadienabhängige Junction-Nexusen entstehen, die während der Brustdrüsenentwicklung variieren.

Einleitung

Mamma-Drüsenwachstum und -entwicklung erfolgt vor allem nach der Geburt. Dieses Organ umgibt sich ständig während des Fortpflanzungslebens eines Säugetiers 1 . Das erwachsene Brustdrüsenepithel besteht aus einer inneren Schicht von luminalen Epithelzellen und einer äußeren Schicht von Basalzellen, die hauptsächlich aus Myoepithelzellen besteht und von einer Basalmembran 2 umgeben ist. Für eine gute Übersicht über die Brustdrüsenstruktur und -entwicklung kann sich der Leser auf Sternlicht 1 beziehen. Für die normale Entwicklung und Funktion der Drüse 1 , 3 , 4 , 5 , 6 sind Zell-Zell-Wechselwirkungen über Lücke (GJ), enge (TJ) und Adhärens (AJ) -Knoten erforderlich. Die Hauptbestandteile dieser Übergänge in der Mäuse-Brustdrüse sind Cx26, Cx30, Cx32 und Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 und -7 undZO-1 (TJ); Und E-Cadherin, P-Cadherin und β-Catenin (AJ) 7 , 8 . Die Expressionsniveaus dieser verschiedenen junctionalen Proteine ​​variieren in einer stadienabhängigen Weise während der Brustdrüsenentwicklung, was auf differentielle Zell-Zell-Interaktionsanforderungen hindeutet. GJ, TJ und AJ sind strukturell und funktionell verknüpft und fesseln andere strukturelle oder regulatorische Proteine ​​an die benachbarten Stellen benachbarter Zellen und schaffen so einen Junction-Nexus 10 . Die Zusammensetzung des Junction-Nexus kann die Überbrückung mit dem darunter liegenden Zytoskelett sowie die Nexus-Permeabilität und -Stabilität beeinflussen und kann folglich die Funktion der Drüse 8 , 9 , 10 , 11 beeinflussen. Die Bestandteile von interzellulären Übergängen, die sich in junctionalen Nexusionen befinden oder miteinander in difDie Entwicklungsstadien der Entwicklung der Brustdrüsen wurden vor kurzem mit Co-Immunfluoreszenz (Co-IF) und Co-Immunpräzipitation (Co-IP) 9 analysiert. Während andere Techniken die Auswertung der funktionalen Assoziation zwischen Proteinen erlauben, werden diese Methoden in diesem Manuskript nicht dargestellt.

Da Proteine ​​nur alleine funktionieren, ist das Studium von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs), wie Signaltransduktionen und biochemischen Kaskaden, für viele Forscher von wesentlicher Bedeutung und kann signifikante Informationen über die Funktion von Proteinen liefern. Co-IF und mikroskopische Analyse helfen, einige Proteine ​​zu bewerten, die denselben subzellulären Raum teilen. Allerdings ist die Anzahl der Ziele durch die Antikörper begrenzt, die bei verschiedenen Tieren angehoben werden müssen, und durch den Zugang zu einem konfokalen Mikroskop, das mit verschiedenen Wellenlängenlasern und einem Spektraldetektor zum Multiplexen ausgestattet ist. Co-IP bestätigt oder zeigt hochaffine physikalische Wechselwirkungen zwischenZwei oder mehr Proteine, die sich innerhalb eines Proteinkomplexes befinden Trotz der Entwicklung neuartiger Techniken wie der Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragung (FRET) 12 und dem Proximity-Ligation Assay (PLA) 13 , die gleichzeitig die Lokalisierung und Interaktionen von Proteinen nachweisen können, bleibt Co-IP eine geeignete und erschwingliche Technik, um Wechselwirkungen zwischen ihnen zu untersuchen Endogene Proteine.

Die Schritt-für-Schritt-Methode, die in diesem Manuskript beschrieben wird, erleichtert das Studium der Proteinlokalisierung und der PPIs und weist auf Fallstricke hin, um beim Studium endogener PPIs in den Brustdrüsen zu vermeiden. Die Methodik beginnt mit der Präsentation der verschiedenen Konservierungsverfahren für die für jede Technik benötigten Gewebe. Teil 1 präsentiert, wie man die Protein-Co-Lokalisation in drei Schritten untersucht: i) die Sektion von Milchdrüsen, ii) die Doppel- oder Dreifachmarkierung verschiedener Proteine ​​unter Verwendung der Co-IF-Technik und iii) die Abbildung vonProteinlokalisierung Teil 2 zeigt, wie man ein endogenes Protein ausfällt und seine interagierenden Proteine ​​in drei Schritten identifiziert: i) Lysatpräparation, ii) indirekte Proteinimmunpräzipitation und iii) Bindungspartneridentifikation durch SDS-PAGE und Western Blot. Jeder Schritt dieses Protokolls ist für Nagetier-Brustdrüsengewebe optimiert und erzeugt qualitativ hochwertige, spezifische und reproduzierbare Ergebnisse. Dieses Protokoll kann auch als Ausgangspunkt für PPI-Studien in anderen Geweben oder Zelllinien verwendet werden.

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Protokoll

Alle Tierprotokolle, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom Universitäts-Tierpflege-Komitee (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Kanada) genehmigt.

1. Identifizierung der Protein-Co-Lokalisation

  1. Vom Gewebe bis zu mikroskopischen Objektträgern
    HINWEIS: Gewebe und Abschnitte sollten auf Trockeneis gehandhabt werden.
    1. Heben Sie die Brustdrüsen von einem Tier an (für eine vollständige Beschreibung dieses Verfahrens, siehe Plante et al. ) 14 .
    2. Das ausgeschnittene Gewebe im Gefrier- / Montagemedium auf Trockeneis einbetten. Füge genug Medium hinzu, um die Drüse zu bedecken. Wenn das Medium verfestigt ist, übergeben Sie das Gewebe in einen Gefrierschrank bei -80 ° C für die spätere Verwendung 9 .
    3. Unter Verwendung eines Kryomikrotoms bei ≤ -35 ​​° C schneiden Sie die Gewebe in 7-10 μm dicke Abschnitte und legen sie auf Mikroskop-Objektträger.
      HINWEIS: Wenn möglich, legen Sie zwei Abschnitte auf jede Folie. Der linke Abschnitt wird als verwendetUm die Spezifität der Antikörper und die Autofluoreszenz des Gewebes zu verifizieren, während die rechte Seite mit den Antikörpern markiert wird.
    4. Halten Sie die Abschnitte bei -80 ° C für späteren Gebrauch.
  2. Co-IF-Färbung
    1. Die entsprechenden mikroskopischen Objektträger aus dem Gefrierschrank abholen und sofort die Abschnitte durch Eintauchen in Formaldehyd 4% für 15 min bei Raumtemperatur (RT) fixieren.
    2. Dann tauchen Sie die Folien in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei RT ein. Lassen Sie die Folien in PBS bei RT, bis Sie zum nächsten Schritt gehen.
    3. Umkreisen Sie jeden Abschnitt des Objektträgers mit einer handelsüblichen hydrophoben Barriere oder einem wasserabweisenden Laborstift (siehe Tabelle der Materialien ). Achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu berühren. Fügen Sie sofort Tropfen PBS in das Gewebe und legen Sie die Folie in eine feuchte Histologie Kammer für den Rest des Verfahrens.
      HINWEIS: Die Gewebeabschnitte müssen befeuchtet bleiben. AlternativeLy, verwenden Sie eine Schachtel mit einem Deckel und legen Sie nasse Papiertücher auf den Boden.
    4. Blockieren Sie jeden Gewebeabschnitt mit 100-200 μl 3% Rinderserumalbumin (BSA) -Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) -0,1% Polysorbat 20 (siehe Tabelle der Materialien ) für 30 min bei RT. Während die Proben blockieren, werden die primären und sekundären Antikörperlösungen durch Verdünnen der Antikörper in TBS-0,1% Polysorbat 20 hergestellt.
      HINWEIS: Die erforderliche Konzentration für den Antikörper wird vom Hersteller bereitgestellt; Siehe die Tabelle der Materialien und die Abbildungen 1 und 2 für Beispiele, sowie Dianati et al. 9 Obwohl es nicht notwendig ist, im Dunkeln zu arbeiten, wenn man die meisten Fluorophor-konjugierten Antikörper verwendet, vermeiden Sie, die Antikörper-Lösungen oder gefärbten Gewebe einem intensiven, hellen Licht auszusetzen.
    5. Entfernen Sie die Blockierungslösung durch Absaugen und inkubieren Sie die Abschnitte in 100-200 & mgr; l des verdünnten primären Antikörpers für 60 min bei RT. AlternativY mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
    6. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung durch Absaugen und waschen Sie die Abschnitte mit 250-500 μl TBS-0,1% Polysorbat 20 für 5 min. Entfernen Sie die Waschlösung durch Absaugen und wiederholen Sie die Wäsche zweimal.
    7. Entfernen Sie die Waschlösung durch Absaugen und inkubieren Sie die Abschnitte mit 100-200 & mgr; l des geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers für 60 min bei RT.
    8. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung durch Absaugen und waschen Sie die Abschnitte mit 250-500 μl TBS-0,1% Polysorbat 20 für 5 min. Die Waschlösung entfernen und zweimal wiederholen.
    9. Wiederholen Sie Schritt 2.5-2.8 mit der entsprechenden Kombination von primären und sekundären Antikörpern für die nachfolgenden Proteine ​​(n) von Interesse.
    10. Entfernen Sie die Waschlösung durch Absaugen und führen Sie die Kernfärbung durch Inkubieren des Abschnitts mit 100-200 & mgr; l 1 mg / ml 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in TBS-0,1% Polysorbat 20 für 5 min beiRT
    11. Entfernen Sie die DAPI-Lösung durch Absaugen und montieren Sie die Objektträger mit einem wasserlöslichen, nicht fluoreszierenden Montagemedium (siehe Tabelle der Materialien ) und Deckgläschen. Gehen Sie jeweils eine Folie vor.
      HINWEIS: Die Inkubation des Kernflecks für mehr als 5 min wird nicht die Intensität der Färbung verändern. Alternativ entfernen Sie die DAPI-Lösung auf allen Folien und inkubieren die Gewebe in PBS bei der Montage der Folien.
    12. Legen Sie die Objektträger für mindestens 8 Stunden in einen 4 ° C-Kühlschrank. Gehen Sie zur fluoreszenzmikroskopischen Bildgebung vor (siehe Abb. 1 und 2 ).
  3. Mikroskopische Bildgebung
    1. Visualisierung der fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops, das mit den verschiedenen Lasern ausgestattet ist, die erforderlich sind, um die Fluorophore bei ihren spezifischen Wellenlängen anzuregen.
      Hinweis: Um Kanäle und Alveolen visualisieren zu können, wird ein 40X Objektiv mit einer numerischen Blende von 0,95 vorgeschlagen. Ein BeispielE der spezifischen Einstellungen ist in Abbildung 1 dargestellt .
    2. Überprüfen Sie die Lokalisierung jedes Proteins einzeln durch Scannen des Bildes eine Wellenlänge zu der Zeit.
      Anmerkung: In diesem Stadium ist es wichtig, die Lokalisation der junctionalen Proteine ​​kritisch zu analysieren. Um junctionale Nexusse bilden zu können, müssen diese Proteine ​​an der Plasmamembran lokalisiert werden.
    3. Bestimmen Sie die Co-Lokalisierung von Proteinen durch Zusammenführen der mit den Lasern gescannten Bilder bei den verschiedenen Wellenlängen.
      Anmerkung: Die Protein-Co-Lokalisierung kann durch die Veränderung der Farbe, die sich aus der Emission von zwei oder mehr Fluorophoren an der gleichen Stelle ergibt, visualisiert werden und kann mit der entsprechenden Software gemessen werden ( Abb. 1 und 2 , siehe auch Referenz 9).

2. Studieren von PPIs

ANMERKUNG: Bauchdrüsendrüsen sollten verwendet werden, um PPIs zu studieren, da Thoraxdrüsen in enger Verbindung mit dem Brustkorb sindMuskeln Heben Sie die Milchdrüsen an (für eine vollständige Beschreibung dieses Verfahrens, siehe Plante et al .) 14 und halten Sie sie bei -80 ° C für spätere Verwendung.

  1. Lysatvorbereitung
    1. Legen Sie das Wägepapier und 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Trockeneis, um sie vorzukühlen, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren.
    2. Nehmen Sie das Brustdrüsengewebe von -80 ° C und halten Sie sie auf Trockeneis.
    3. Die Gewebe auf den vorgekühlten Wägepapieren wiegen und dann das Gewebe auf 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen (Griff auf Trockeneis). Verwenden Sie zwischen 50 und 100 mg Gewebe pro Probe. Halten Sie das Gewebe auf Trockeneis bis Schritt 2.1.5.
    4. Bereiten Sie die erforderliche Menge an Triple-Detergens-Lyse-Puffer, ergänzt mit NaF, NaVO & sub3 ; und Protease / Phosphatase-Inhibitor, wie in der Tabelle der Materialien , unter Verwendung der folgenden Formeln angegeben. Mäuse: erforderlicher Puffer (μL) = Mausgewebegewicht (mg) x 3; Ratte: erforderlichPuffer (μL) = Rattengewebegewicht (mg) x 5.
    5. Fügen Sie die erforderliche Menge an eiskaltem Lysepuffer (berechnet in Schritt 2.1.4) dem 2-ml-Röhrchen, das das Gewebe enthält, hinzu.
      HINWEIS: In den Schritten 2.1.5-2.1.6 fahren Sie mit einem einzigen Schlauch zu einem Zeitpunkt fort.
    6. Homogenisieren des Gewebes für 30-40 s unter kontinuierlicher Homogenisierung auf einer Gewebemühle; Halten Sie immer die Tube auf Eis. Stellen Sie den Gewebehomogenisator auf mittlere Geschwindigkeit ein und bewegen Sie den Schleifer vorsichtig nach oben und unten.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 mit den anderen Röhren.
    8. Inkubieren Sie die Lysate auf Eis für 10-30 min.
    9. Die Röhrchen bei 170 xg für 10 min bei 4 ° C zentrifugieren.
    10. Mittlerweile 6-10 Mikrozentrifugenröhrchen (0,6 ml) für jede Probe identifizieren und auf Eis aufbewahren.
    11. Sobald die Zentrifugation durchgeführt ist, überprüfen Sie die Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass sie eine obere Schicht von Fett, klare, gelb-rosa-Lysate (je nach Entwicklungsstadium) und ein Pellet enthalten.
    12. Erstellen Sie ein Loch in der LipidschichtMit einer 200-μl-Pipettenspitze, um auf die flüssige Phase zuzugreifen. Ändern Sie die Spitze und sammeln Sie das Lysat, ohne das Pellet zu stören oder die Lipidschicht zu saugen. Aliquot das Lysat in vorbeschrifteten Röhrchen auf Eis (Schritt 2.1.11) und lagern bei -80 ° C.
    13. Verwenden Sie ein Aliquot, um die Proteinkonzentration mit einem geeigneten handelsüblichen Kit zu quantifizieren (siehe Tabelle der Materialien ).
  2. Indirekte Immunpräzipitation
    1. Auf Eis, Tauwetter zwei Aliquots der gesamten Brustdrüsen-Lysate vorbereitet vor.
      HINWEIS: Ein Aliquot wird für die IP des Zielproteins verwendet, während das andere als Negativkontrolle dienen wird.
    2. Sammle 500-1000 μg des Lysats und verdünne es in PBS, um ein Endvolumen von 200 & mgr; l in jedem 1,5 ml Röhrchen zu erreichen.
      ANMERKUNG: Die Menge des zu verwendenden Lysats hängt von der Häufigkeit des Proteins von Interesse und der Effizienz des Antikörpers ab (siehe Abbildung 3 für aN Beispiel, sowie die Tabelle der Materialien ). Zur Optimierung für jedes Ziel sollten unterschiedliche Mengen an Lysat ( dh 500, 750 und 1.000 μg) und Antikörper ( dh 5, 10 und 20 μg) verwendet werden. Gehen Sie mit den folgenden Schritten vor (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Füge den Antikörper gegen das Antigen von Interesse zum ersten Röhrchen des Lysats hinzu und halte es auf Eis.
      HINWEIS: Der erforderliche Betrag wird in der Regel auf dem von jedem Unternehmen zur Verfügung gestellten Gebrauchsanweisung empfohlen (siehe Tabelle der Materialien ).
    4. In der zweiten Röhre eine negative Kontrolle durch Zugabe der gleichen Konzentration der Isotyp-IgG-Kontrolle wie der in Schritt 2.2.3 verwendete Antikörper herstellen.
    5. Die Röhrchen über Nacht bei 4 ° C auf einem Rohrwalzenmischer bei niedriger Geschwindigkeit inkubieren.
    6. Am nächsten Tag werden 50 μl magnetische Perlen zu neuen 1,5 mL Röhrchen zum Vorspülen gegeben.
      1. Wählen Sie entweder Protein A oder Protein G magnetische Perlen auf der Grundlage der relativen Affinität zum Antikörper.
      2. Es ist wichtig, die Verwendung von aggregierten Perlen zu vermeiden. Die Wulstsuspension vorsichtig mischen, bis sie gleichmäßig wieder suspendiert ist, bevor sie den Röhrchen zugesetzt wird.
    7. Legen Sie die Röhrchen mit den Perlen auf den Magnetständer und lassen Sie die Perlen auf den Magneten wandern. Entfernen Sie den Speicherpuffer aus den Perlen mit einer 200 μl Pipette.
    8. Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie 500 μl PBS-0,1% Polysorbat 20 zugeben und die Röhrchen für 10 s kräftig vortexen.
    9. Setzen Sie die Röhren wieder auf den Magnetständer und lassen Sie die Perlen auf den Magneten wandern.
    10. Den überschüssigen Waschpuffer durch Pipettieren mit einer 200 μl Pipette entfernen.
    11. Den Reaktionskomplex (Lysat-Antikörper) aus Schritt 2.2.5 zu den Perlen zugeben und für 90 min bei RT auf dem Walzenmischer inkubieren.
    12. Legen Sie die Röhrchen auf den Magnetständer und lassen Sie die Perlen auf den Magneten wandern. Mit einer 200 μl Pipette aspirieren und das Lysat entsorgen und die Röhrchen auf Eis stellen.
    13. Waschen Sie die PerleS durch Zugabe von 500 & mgr; l PBS, Aufbringen der Röhrchen auf den Magnetständer und Entfernen der Flüssigkeit unter Verwendung einer 200 & mgr; l Pipette. Wiederholen Sie diesen Waschschritt. Während der Waschstufen vermeiden Sie Vortexen und halten die Proben auf Eis.
    14. Waschen Sie die Perlen einmal mit PBS-0,1% Polysorbat 20 ohne Vortexen und verwerfen Sie den letzten Waschpuffer mit einer 200 μl Pipettenspitze.
    15. Zur Elution werden 20 μl 0,2 M saures Glycin (pH = 2,5) zu den Röhrchen gegeben und 7 min auf dem Walzenmischer geschüttelt.
    16. Zentrifugieren Sie mit hoher Geschwindigkeit für ein paar Sekunden (schnelles Spin) und sammeln Sie den Überstand in einem frischen eiskalten Rohr.
    17. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.14 und 2.2.15 für jedes Rohr.
      HINWEIS: Das Endvolumen beträgt 40 μl.
    18. Füge 10 μl 4x Laemmli-Puffer zu der 40 μl eluierten Probe aus Schritt 2.2.16 hinzu.
      HINWEIS: Die Farbe wird aufgrund des sauren pH-Werts gelb.
    19. Fügen Sie sofort 1 M Tris (pH = 8), ein Tropfen zu einer Zeit, zu der eluierten Probe von Schritt 2.2.18 bis zu seiner Farbe hinzuWird blau. Fahren Sie zu den nächsten Röhren.
    20. Die Proben aus Schritt 2.2.18 bei 70-90 ° C für 10 min kochen. Gehen Sie sofort zur Gelelektrophorese vor. Alternativ die Proben in einen Gefrierschrank bei -80 ° C bis zum Beladen transportieren.
  3. Downstream Anwendung: Gelelektrophorese gefolgt von Western Blot
    1. Trennung und Stapelung von SDS-PAGE-Acrylamidgelen (1,5 mm Dicke) nach Standardverfahren vorbereiten 15 .
      HINWEIS: Die Wahl des Gels (8-15% Acrylamid, Gradient: siehe Tabelle der Materialien ) sollte auf der Grundlage der Molekulargröße des zu präzipitierenden Proteins und der zu analysierenden potentiellen Bindungspartner bestimmt werden. Diese Proteine ​​müssen voneinander gelöst werden, um eine ordnungsgemäße Immunodetektion zu ermöglichen.
    2. Tauen Sie die Immunopräzipitation (IP) - unvermittelten Proben (Schritt 2.2.20) auf Eis.
    3. Bereiten Sie Protein-Lysate aus den gleichen Proben (für die IP-Verfahren oben verwendet). Verwenden Sie 50Μg Gesamtlysat und fügt 4X Laemmli Probenpuffer hinzu. Kochen Sie die Proben bei 70-90 ° C für 5 min und legen Sie auf Eis bis zum Laden.
      HINWEIS: Diese Proben werden neben der eluierten IP-Probe geladen, um das Vorhandensein von ausgefällten Proteinen im Gesamtlysat zu demonstrieren.
    4. Laden Sie die vorbereiteten Lysate aus Schritt 2.3.3 und die ausgefällten Proben aus Schritt 2.2.20 Seite an Seite in ein Acrylamidgel und führen sie in laufenden Puffer (10x Laufpuffer: 30,3 g Tris, 144,1 g Glycin und 10 G SDS in 1 l destilliertem Wasser) bei 100 V für ca. 95 min oder bis der Rand der wandernden Proteine ​​den Boden des Gels erreicht.
    5. Übertragen Sie die Gele auf eine Nitrozellulose- oder PVDF-Membran unter Verwendung eines Standardprotokolls 9 , 15 .
    6. Blockieren Sie die Membran für 1 h auf einer Wippe bei niedriger Geschwindigkeit in 5% Trockenmilch-TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl und 0,05% Polysorbat 20).
    7. Identifizieren Sie, ob der Niederschlag erfolgreich warSchüchtern
      1. Sonde die Membran unter Verwendung des ersten Antikörpers gegen das ausgefällte Protein, verdünnt in 5% Trockenmilch-TTBS in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration über Nacht bei 4 ° C auf einer Schaukelplattform mit langsamer Bewegung.
        HINWEIS: Siehe die Tabelle der Materialien für Empfehlungen.
      2. Am nächsten Tag die Membran 3 mal für jeweils 5 min mit TTBS auf einer Schaukelplattform mit hoher Rührung waschen.
      3. Inkubieren Sie die Membran in dem geeigneten sekundären Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP), verdünnt in TTBS, für 1 h bei RT auf einer Schaukelplattform mit langsamen Rühren.
        ANMERKUNG: Alternativ kann ein mit einem Fluorochrom konjugiertes sekundäres Antikörper verwendet werden, wenn eine entsprechende Vorrichtung zur Erkennung des Signals verfügbar ist.
      4. Führen Sie 3 bis 6 Wäschen, jeweils für 5 min, mit TTBS auf einer Schaukelplattform mit hoher Bewegung. Analysieren Sie das Signal des sekundären Antikörpers durch Inkubieren der Membran mit einem kommerziellen aVailable luminol solution (siehe Tabelle der Materialien ) und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Erfassen Sie das Signal mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem (siehe Tabelle der Materialien ).
        HINWEIS: Für ein detailliertes Protokoll zur Western-Blot-Analyse siehe Referenz 16.
    8. Um interagierende Proteine ​​zu identifizieren, führen Sie die Schritte 2.3.7.1-2.3.7.4 mit den entsprechenden Antikörpern auf dem gleichen Blot durch.
      HINWEIS: Wenn die Proteine ​​interagieren, werden die Bindungspartner mit dem Zielprotein co-immunpräzipitiert und sind somit durch Western-Blotting nachweisbar. Schritt 2.3.8 kann mit mehr Antikörpern wiederholt werden, um festzustellen, ob sich andere Proteine ​​in demselben Protein-Komplex befinden, solange sich die Molekulargewichte der Proteine ​​so stark unterscheiden, dass sie auf dem Gel und der Membran gut getrennt sind.
    9. Um zu bestätigen, dass die identifizierten Bindungspartner keine Artefakte sind, sollte reziproke IP durchgeführt werden.
      HINWEIS: Dies wird durch Wiederholen durchgeführtSchritte 2.2.1-2.2.20 mit dem gleichen Lysat, aber Ausfällen eines der in Schritt 3.8 identifizierten Bindungspartner. Dann werden die Schritte 3.1-3.8 unter Verwendung des primären Antikörpers gegen das erste interessierende Protein wiederholt.

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Ergebnisse

Um zu bestimmen, ob GJ-, AJ- und TJ-Komponenten in der Brustdrüse zusammenwirken können, wurden zuerst Co-IF-Assays durchgeführt. Cx26, ein GJ-Protein und β-Catenin, ein AJ-Protein, wurden mit spezifischen Antikörpern untersucht und unter Verwendung von Fluorophor-konjugierten Maus-647 (Grün-, Pseudofarb-) und Ziegen-568 (roten) Antikörpern ( 1B und C ) . Die Daten zeigten, dass sie sich an der Zellmembran von Epithelzellen in der Mäuse-Brustdrü...

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Diskussion

Zell-Zell-Interaktionen über Kreuzungen sind für die richtige Funktion und Entwicklung von vielen Organen, wie die Brustdrüse erforderlich. Studien haben gezeigt, dass junctionale Proteine ​​die Funktion und Stabilität voneinander regulieren und die Signaltransduktion durch die Bindung an der Zellmembran 10 aktivieren können. Die Protokolle, die in der aktuellen Manuskript präsentiert wurden, haben interessante Ergebnisse über die junctionale Protein-Differential-Expression, Lokalisier...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu erklären.

Danksagungen

IP wird von einem Naturwissenschaften und Ingenieurwissenschaftsrat von Kanada finanziert (NSERC # 418233-2012); Ein Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), ein Trainerpreis der Quebec-Brustkrebs-Stiftung und ein Leader Founds-Stipendium der kanadischen Stiftung für Innovationsträger. ED erhielt ein Stipendium der Fondation universitaire Armand-Frappier.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Mice strain and stageSt. Constant, Quebec, CanadaC57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock)1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock)1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing mediaVWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada95067-840VMR frozen sections compound 
MicrotomeMississauga, ON, Canada956640Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
BladesC.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, CanadaBLM1001CHigh profile gold coated blades
Pap penCedarlane, Burlington, ON, Canada8899Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slidesFisher Scientific, Burlington, ON, Canada12-550-15Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
FormaldehydeBioShop Canada Inc, Burlington, ON, CanadaFOR201.1Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA)Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution3% BSA in TBS
Wash solutionTBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20Oakville, ON, CanadaP 9416Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting mediaCedarlane, Burlington, ON17984-25(EM)Fluoromount-G
First & secondary antibodiesCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsE-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsClaudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada See Commentsβ-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsConnexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stainFisher Scientific, Burlington, ON, CanadaD1306DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscopeNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysisNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.01) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitorFisher Scientific, Burlington, ON78441Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosageThermo Scientific, Rockford, Illinois, USA23225Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinderFisher Scientific, Burlington, ONFTH-115Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and standMillipore, Etobicoke, ON, CanadaPureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IPPBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsIgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsIgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationSigma-Aldrich, Oakville, ON, CanadaSee CommentsConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsE-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada16107474x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine Fisher Scientific, Burlington, ONPB381-50.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris Fisher Scientific, Burlington, ONBP152-11 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1610180 -5TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
MembranesBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer methodBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704155Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry MilkSmucker Food of Canada Co, Markham, ON, CanadaFat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blotsTBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsE-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsClaudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsClaudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1705061Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1708280ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, CanadaImageLab 5.2 software 

Referenzen

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