ضبط في الحصين ثيتا الفرقة<em&gt; في المختبر</em&gt;: منهجيات لتسجيل من القوارض معزولة سيبوهيبوكامبال الدائرة

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لتسجيل الإيقاعي ثيتا شبكة العصبية وتذبذبات غاما من إعداد الحصين كله معزولة. نحن تصف الخطوات التجريبية من استخراج الحصين إلى تفاصيل الميدان، وحدوية وكل خلية التصحيح المشبك التسجيلات فضلا عن سرعة أوبتوجينيتيك من إيقاع ثيتا.

Abstract

هذا البروتوكول يحدد إجراءات لإعداد وتسجيل من الحصين كله معزولة، من وت والفئران المعدلة وراثيا، جنبا إلى جنب مع التحسينات الأخيرة في المنهجيات والتطبيقات لدراسة التذبذبات ثيتا. يتم عرض توصيف بسيط لإعداد الحصين معزولة حيث يتم فحص العلاقة بين مؤشرات التذبذب الحصين ثيتا الداخلية جنبا إلى جنب مع نشاط الخلايا الهرمية، و غابايرجيك إنترنيورونس، من كورنو أمونيس -1 (CA1) والمناطق الفرعية (سوب) المناطق. عموما، وتبين لنا أن الحصين معزولة قادر على توليد التذبذبات ثيتا الجوهرية في المختبر ، وأن الإيقاع ولدت داخل الحصين يمكن التلاعب بها بدقة من قبل التحفيز أوبتوجينيتيك من البارفالبومين إيجابية (بف) إنترنيورونس. في المختبر معزولة إعداد الحصين يوفر فرصة فريدة لاستخدام في وقت واحد والتسجيلات داخل المشبك بين الخلايا من المشاهد بصريا تحديدها نيورونس لفهم أفضل للآليات الكامنة وراء جيل إيقاع ثيتا.

Introduction

هيبوكامبال ثيتا التذبذبات (4-12 هرتز) هي من بين الأشكال الأكثر سائدة من النشاط الإيقاعي في الدماغ الثدييات ويعتقد أن تلعب أدوارا رئيسية في الوظائف المعرفية مثل معالجة المعلومات المكانية الزمانية وتشكيل ذكريات عرضية ^{1 ، 2 ، 3} . في حين أن العديد من الدراسات في الجسم الحي التي تسلط الضوء على العلاقة بين خلايا المكان ثيتا التضمين مع الملاحة المكانية والدراسات الآفة، وكذلك الأدلة السريرية، ودعم الرأي القائل بأن التذبذبات الحصين ثيتا تشارك في تشكيل الذاكرة ^{4 ، 5 ، 6} ، والآليات المرتبطة مع جيل من التذبذبات ثيتو الحصين لا تزال غير مفهومة تماما. في وقت مبكر من التحقيقات في الجسم الحي تشير إلى أن النشاط ثيتا تعتمد أساسا على مؤشرات التذبذب الخارجية، ولا سيما الإدخال الإيقاعيمن هياكل الدماغ وارد مثل الحاجز والقشرة المخية ^{7 ، 8 ، 9 ، 10} . تم أيضا افتراض دور العوامل الجوهرية - الربط الداخلي للشبكات العصبية قرن آمون مع خصائص الخلايا العصبية قرن آمون - استنادا إلى الملاحظات في المختبر ^{11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 ، 18} . ومع ذلك، وبصرف النظر عن عدد قليل من الدراسات التاريخية ^{19 ، 20 ، 21} ، والصعوبات في تطوير النهج التي يمكن أن تكرر الأنشطة السكانية واقعية من الناحية الفسيولوجية في بسيطة في إعداد شريحة المختبرق، لفترة طويلة، تأخر الفحص التجريبي أكثر تفصيلا للقدرات الجوهرية للحصين والمناطق ذات الصلة لتوليد الذات التذبذبات ثيتا.

ومن الجوانب السلبية الهامة للمعيار في المختبر التجريبي شريحة رقيقة التجريبية هو أن التنظيم الخلوي 3D ومشبك من هياكل الدماغ وعادة ما يتعرض للخطر. وهذا يعني أنه لا يمكن دعم العديد من أشكال أنشطة الشبكات المتضافرة على أساس تجمعات الخلايا الموزعة مكانيا، والتي تتراوح بين المجموعات المحلية (نصف قطرها ≤1 ملم) لسكان الخلايا العصبية المنتشرة عبر واحد أو أكثر من مناطق المخ (> 1 مم). وبالنظر إلى هذه الاعتبارات، هناك حاجة إلى نوع مختلف من النهج لدراسة كيفية ظهور التذبذبات ثيتا في الحصين ونشرها إلى هياكل الانتاج القشرية والقشرية تحت القشرية ذات الصلة.

في السنوات الأخيرة، والتطور الأولي لل "كامل سيبتو الحصين" إعداد لدراسة إنتيرا ثنائي الاتجاهكتابات من اثنين من الهياكل ²² ، والتطور الذي أعقب ذلك من "الحصين معزولة" إعداد، كشفت أن تذبذبات ثيتا الجوهرية تحدث بشكل عفوي في الحصين تفتقر إلى المدخلات الإيقاعية الخارجية ²³ . وتكمن قيمة هذه النهج في الرؤية الأولية التي مفادها أن الهيكل الوظيفي الكامل لهذه المناطق كان لا بد من الحفاظ عليه لكي يعمل كمولد إيقاع ثيتا في المختبر ²² .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للبروتوكولات والمبادئ التوجيهية التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان جامعة ماكجيل والمجلس الكندي لرعاية الحيوان.

1. الحصين الحاد في إعداد المختبر

ملاحظة: عزل إعداد الحصين سليمة ينطوي على ثلاث خطوات رئيسية: (1) إعداد الحلول والمعدات، (2) تشريح الحصين و (3) إعداد نظام معدل نضح سريع اللازمة لتوليد التذبذبات ثيتا جوهرية. في هذا البروتوكول، والأداء في الوقت المناسب من الإجراءات - من تشريح لتسجيل - أهمية خاصة لأن الحصين معزولة يشكل مثل كثيفة، ولكن حساسة، وإعداد أن الحفاظ على الاتصال الوظيفي للهيكل في المختبر يتطلب عناية كبيرة. إعداد كل شيء مسبقا يضمن أن مستوى كاف من نضح متاح في أقرب وقت ممكن للحد من الخلية دأميج والحفاظ على وظيفة فسيولوجية.

1. سوكروز الاصطناعي السائل الشوكي الدماغي (أسف) الحل
   1. إعداد 1X الأسهم حل السكروز لاستخدامها لتشريح وحضانة ما بعد تشريح. الجمع بين جميع المكونات المدرجة في الجدول 1 ، باستثناء كاكل ₂ ، إلى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات، وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
2. حل أسف القياسية
   1. إعداد أسف القياسية لارتفاع معدل نضح تدفق الحصين معزولة خلال التسجيلات الكهربية. لجعل المركزة (5X) الأسهم أسف، حل جميع المكونات المدرجة في الجدول 2 ، باستثناء كاكل ₂ ، في 2 لتر من الماء منزوع الأيونات وتخزينها في 4 درجات مئوية.
3. إعداد المعدات
   1. قبل البدء في التشريح، إعداد منطقة مقاعد البدلاء مع علبة بلاستيكية مليئة الجليد (30 × 20 × 5 سم)، وخطوط أنابيب الكربوجين متصلة وثرإي الزجاج أطباق بتري (10 × 2 سم) (انظر الشكل 1 ).
   2. إضافة 300 مل من محلول السكروز (1X الأسهم) إلى كوب 500 مل، فقاعة مع الكربوجين (95٪ O ₂ ، 5٪ كو ₂ ) وإضافة كا ^{2 +} [1.2 ملم].
   3. نقل 60 مل من محلول السكروز هذا إلى طبق بيتري الزجاج وترك في درجة حرارة الغرفة. وضع الباقي في الفريزر 4 درجة مئوية لمدة 10 - 15 دقيقة.
   4. فقاعة حل السكروز الجليد الباردة مع كاربوجين في جميع أنحاء تشريح.
   5. ملء طبق بتري الثاني (غرفة عقد الباردة) مع حل السكروز (4 درجة مئوية) والحفاظ على الجليد.
   6. إضافة 30 مل من محلول السكروز الجليد الباردة إلى كوب 50 مل.

2. كله الحصين تشريح

ملاحظة: طريقة لتشريح الحصين معزولة متطابقة أساسا إلى واحد وضعت ووصف في الأصل ²² ، ولكن مع تفاصيل إضافية والتغيرات المتعلقة بيمعدل رفوس وتقنيات التسجيل.

1. تشريح الدماغ
   1. تخدير الماوس (P20 - 35) تحت غطاء الدخان مع منشفة ورقية صغيرة غارقة مع 1 مل من إيسوفلوران (100٪) التي تضاف إلى القفص.
   2. قطع رأس الماوس تخدير وغمر بسرعة الرأس في محلول السكروز الجليد الباردة (50 مل كوب، ~ 5 ق). نقل على منشفة ورقية.
   3. استخدام مشرط لجعل شق الجلد الإنسي (الذيلية إلى منقاري) ودفع الجلد على الجانبين لفضح الجمجمة.
   4. قطع فتح الجمجمة مع مقص صغير واستخدام ملعقة لاستخراج بسرعة الدماغ وإسقاطه في طبق بتري تحتوي على حل السكروز الجليد الباردة. السماح 1-2 دقيقة للدماغ لتبرد.
   5. في حين أن الدماغ يتعافى، إضافة 2 - 3 مل من محلول السكروز على ورقة عدسة تغطي بيتري (تشريح) طبق على الجليد.
2. عزل الحصين
   1. وضع الدماغ على طبق تشريح في بوسيتيو تستقيمن.
   2. إزالة المخيخ والقشرة الأمامية مع شفرة حلاقة. قطع الدماغ في نصف على طول الطائرة ميدساجيتال وعودة نصف الكرة الأرضية معزولة إلى غرفة عقد. السماح 1-2 دقائق أخرى للاسترداد.
   3. مكان واحد هيميسكتد الدماغ تستقيم على طبق تشريح.
   4. تدوير الطبق حتى تواجه الهياكل ميدساجيتال المراقب والمخطط جزءا لا يتجزأ من مجمع الحاجز مرئية كما طبقة رقيقة على شكل كمثرى من الأنسجة الأمامية إلى المهاد.
   5. عقد الدماغ شقي نصبت ثابتة مع ميكروسباتولا ووضع نهاية صغيرة من ملعقة المغلفة بوليتيترافلوروإيثيلين (بتف) مباشرة وراء (الذيلية إلى) منطقة الحاجز.
   6. إدراج ملعقة المغلفة تحت الحاجز ونقل طرف أسفل حتى يتم التوصل إلى طبق تشريح. فصل الألياف التي تربط منطقة الحاجز كودالي. كرر نفس العملية على طول الحافة الأمامية للحاجز وقطع الألياف التي تصل إلى الجزء الأمامي من الدماغ.
   7. مع ملعقة تحمل برفق الجزء الداخلي من القشرة فوق الحصين فقط في وضع مستقيم، استخدم ميكروسباتولا لسحب بعناية أسفل المهاد، المهاد وبقية نوى جذع الدماغ. استخدام ملعقة لقطع وإزالة الأنسجة انسحب بعيدا.
   8. تحويل نصف الكرة معزولة على جانبها وتحديد الخطوط العريضة للحصين.
   9. إدراج المغلفة المغلفة في البطين الجانبي، تحت نهاية منقاري للحصين الظهرية.
   10. عقد الملعقة محاذاة أفقيا مع الطائرة ميدساجيتال من الدماغ تشبه نصفه والانزلاق من خلال كفاف السلس من جدران البطين حتى غيض يظهر كودالي.
   11. عقد ملعقة تحت الحصين واضغط برفق على الألياف ربط، على طول الطبقة الداخلية حيث ينضم الحصين مع القشرة المغطي. تطبيق ميكروسباتولا على الجانب الخارجي من هذه الطبقة والانزلاق ضد ملعقة المغلفة لشريحة من خلال ربط فايBERS.
   12. لاستكمال استخراج، وتناوب طبق تشريح وإدراج ملعقة المغلفة تحت الحصين البطني. عقد برفق داخل القشرة أضعاف مع ملعقة وقطع من خلال اتصالات إنتورهينال باستخدام حركة تشريح ضد ميكروسباتولا.
       ملاحظة: مجمع سيبوهيبوكامبال كله يمكن إزالتها عن طريق وضع ملعقة المغلفة تحت الحصين بأكمله، وسحب الأنسجة الدماغ المتبقية من تحت.
   13. بمجرد اكتمال العزلة، والحفاظ على الحصين يستريح على الطبق وإضافة قطرة من محلول السكروز الجليد الباردة للحفاظ على باردة. تقليم بعناية قبالة أي القشرة والألياف المتبقية وفصل الحصين من الحاجز عن طريق تطبيق بلطف شفرة حلاقة من خلال فورنيكس.
       ملاحظة: إذا كان التسجيلات المشبك التصحيح هي التي يتعين القيام بها من الخلايا الهرمية (انظر القسم 4.6 السيطرة أوبتوجينيتيك)، الحصين معزولة يمكن قطع عرضية في زاوية 45 درجة لفضح طبقة هرمية من CA1 ("أنغلe- قص "إعداد)، دون المساومة على الدوائر الشبكة المحلية في الجزء المتبقي من الحصين.
   14. نقل إعداد إلى حل درجة حرارة الغرفة السكروز والسماح لها استرداد لمدة 15 - 30 دقيقة قبل نقل إلى غرفة التسجيل.

3. إعداد الإرواء السريع لتسجيل الحصين معزولة

1. إعداد نظام التغذية نضح الجاذبية لتمكين تدفق عالية السرعة المستمر من أكسف المؤكسج في 20-25 مل / دقيقة.
   1. إعداد أسف (1X) قوارير مقدما وتزجها في حمام الاحترار (~ 30 درجة مئوية) على الأقل 15 دقيقة قبل بدء التجربة. بدوره على خط نظام سخان الحل (30 درجة مئوية).
   2. استخدام بوبلرز الحوض وخطوط أنابيب متصلة خزان الكربوجين إلى أكسجين أسف طوال التجربة، وإضافة كاكل ₂ [2 ملم] قبل بدء نضح.
   3. وقف تدفق أسف ونقل الحصين إلى غرفة تسجيل باستخدام واسعةنهاية ماصة الزجاج. السماح للتحضير المشبعة السكروز لتغرق وتستقر في الأسفل.
   4. وضع إعداد في وسط غرفة التسجيل (تمشيا مع مدخل مدخل محور) مع سطح أملس CA1 و سوب على القمة. استقرار الحصين مع أوزان صغيرة في الأطراف الحاجز والزماني وإعادة تدفق أسف.

4. الفيزيولوجيا الكهربية في الحصين معزولة

1. تسجيل خارج الخلية من في المختبر التذبذبات الحصين ثيتا
   1. لرصد خارج الخلية من إمكانات الحقل المحلي (لفب) أو نشاط وحدة واحدة من الحصين معزولة في المختبر ، واستخدام ميكروبيبيتس الزجاج (1 - 3 MΩ) مليئة أسف. سجل إشارة منخفضة الضوضاء أس إشارة المجال المحتملة مع مكبر للصوت التصحيح المشبك من كسب X1000، على الانترنت الفرقة تمرير تصفية 0.1-500 هرتز ومعدل أخذ العينات من 5-20 كيلو هرتز.
      ملاحظة: المجهر مخصص بنيت المستخدمة في هذا البروتوكولوقد تم تجهيز مع منخفضة ((2.5X) وارتفاع التكبير (40X) أهداف للعرض منخفضة التكبير من الحصين، وكذلك الأشعة تحت الحمراء المجهر الفيديو و إبيفلورزنس للتعرف على خلية واحدة. وتشمل مكونات هذا النظام المجهر مضان تستقيم، مكعبات مرشح مضان، وكاميرا الفيديو التناظرية والإطار الرقمي المنتزع مع برنامج التصوير، على مرحلة مخصصة غرفة نضح ( الشكل 2A ، أقحم ط) و ميكرومانيبولاتورس عالية الدقة لتسجيلات العصبية و الألياف البصرية التنسيب.
   2. استخدام الكاميرا التي شنت على المجهر وتوصيلها إلى شاشة الكمبيوتر لتفقد إعداد الحصين تحت التكبير المنخفض (2.5X) والتحقق بسرعة أنه لا يوجد نقص أو تلف السطح الخارجي. يجب أن يكون الترتيب الموجه قطريا من الألياف ألفيوس على طول سطح أملس CA1 مرئية ( الشكل 2A ، أقحم الثاني) عندما مشرقة ضوء تنتقل من خلال هيبوكامصديد.
   3. استخدام منخفضة التكبير هدف واسع المجال لعرض الحصين معزولة ووضع أقطاب لفب في مواقع تسجيل محددة.
      ملاحظة: ويوضح تخطيط إعداد الحصين معزولة مع أقطاب متعددة وضعت في مواقع تسجيل مختلفة في الشكل 2A .
   4. خفض القطب لفب في الحمام حتى يلمس سطح (ألفيوس) من منطقة CA1.
      ملاحظة: هذا عادة ما تنتج عابرة سريعة في تسجيل أس المقترنة مماثلة لما يحدث عندما يأتي القطب في اتصال مع وسائل الإعلام تسجيل. يمكن أن تكون شاشة الصوت مفيدة للاستماع إلى إشارة قناة لفب بعد هذه الخطوة.
      ملاحظة: في كثير من الأحيان، والعلامات المبكرة للنشاط تظهر فقط بعد 10 - 15 دقيقة، وبالتالي فمن المهم عدم التقدم بسرعة في التحضير. إذا بعد هذه الفترة القطب لفب السطح لا يزال غير التقاط النشاط، تقدم أبعد قليلا إلى أسفل من خلال الطبقة أورينزوقفة بشكل دوري لمعرفة ما إذا كان أي شكل من أشكال النشاط تنشأ أثناء الاقتراب من طبقة الخلية الرئيسية. إذا لم يتم الكشف عن أي شيء بعد 5 - 10 دقائق أخرى، سحب بعناية القطب ووضعه في مكان آخر على نفس المنطقة.
   5. دفع القطب لفب من خلال طبقة هرمية. لاحظ أن النشاط زيادة خارج الخلية زيادة في البداية كما تم الكشف عن وحدة واحدة التفريغ من الخلايا العصبية الفردية (ومعظمهم من الهرمية وخلايا سلة المثبطة). خفض القطب أكثر ونلاحظ أن تسلق يبدأ لتتلاشى مرة أخرى كما طرف يعبر إلى مشع. لاحظ أن التذبذب شبكة واضحة للعيان في نطاق ثيتا التردد (4-12 هرتز) يصبح واضحا ويصل إلى أقصى قدر من السعة (~ 100 - 300 μV) كما يتم تخفيض موقع التسجيل من خلال رادياتوم.
2. ثيتا التذبذبات عبر منطقة واحدة
   1. لاختبار الخصائص المكانية للتذبذبات ثيتا عفوية عبر منطقة CA1، ضع غيض سفا المرجعي لفب القطب في موقع CA1 الإنسي (يقع وسطيا على طول محور سيبتو الزماني الطولية) وانخفاضه في راديتوم كما هو موضح سابقا.
   2. وضع القطب لفب الثاني في موقع CA1 (200 - 800 ميكرون الحاجز أو الزمانية من أول لفب) ومراقبة أن CA1 ثيتا التذبذبات يمكن مزامنة على مسافات كبيرة نسبيا.
3. ثيتا التذبذبات عبر الطبقات
   1. لاختبار خصائص التذبذبات ثيتا عبر طبقات قرن آمون، وترك القطب المرجعي لفب في موقع راديتوم CA1. بدءا من مجرد فوق أوريينز الطبقة، وانخفاض القطب الثاني في طبقة الخلايا الهرمية، ومن خلال راديتوم. مراقبة انعكاس تدريجي للإشارة لفب (عكس المرحلة النسبية) عبر طبقة هرمية.
      ملاحظة: للحصول على أمثلة تمثيلية لهذه الأنواع من النشاط، انظر الشكل 2B . أمثلة لملامح الصفح / العمق وكثافة المصدر الحالي (كسد) أناليسهو توضيح موقع الانعكاس المرحلة في الحصين معزولة قد نشرت سابقا ^{23 ، 24 ، 25} .
4. تذبذبات غاما و ثيتا-غاما اقتران في الحصين سليمة
   1. وضع القطب الحقل في الحدود CA1 / سوب وخفضه حتى يجلس على واجهة بين الطبقات الهرمية والجزيئية. على هذا المستوى، يمكن تسجيل إمكانية الحقل عرض تذبذبات غاما واضحة مع التغيرات في السعة التي قفل الطور إلى إيقاع ثيتا المحلية ²⁴ . ضبط التحجيم لمراقبة بطيئة مقياس الوقت من ثيتا-غاما اقتران. وتجدر الإشارة إلى أن رشقات غاما تحدث في نطاقين مختلفين من الترددات، يمكن الكشف عنهما من خلال ترشيح النطاق الترددي لإشارة لفب الجارية في المدى البطيء (25 - 50 هرتز) ونطاق غاما سريع (150 - 250 هز) (انظر الشكل 2C للممثل الذي تم تصفيته آثار).
5. كامل خلية التصحيح المشبك تسجيل أثناء المختبر في التذبذب الحصين ثيتا
   ملاحظة: في هذا الجزء من البروتوكول، والهدف من ذلك هو الحصول على بصريا الموجهة كله خلية التصحيح المشبك التسجيلات من إنتيرنيورونس المحددة في الحصين معزولة من الفئران المعدلة وراثيا بف-توم معربا عن البروتين الفلوري، تدتوماتو، تحت سيطرة المروج بف (ل مزيد من التفاصيل انظر المواد و المرجع ²⁶ ).
   1. استخدام مضان الفيديو المجهر مع انخفاض (2.5X) وارتفاع الطاقة (40X) التكبير لتصور إنتيرونيونس تدتوماتو إيجابية تقع بالقرب من سطح إعداد الحصين من بف-توم الماوس ( الشكل 3 ). لاحظ أنه على الرغم من الخلايا العصبية بف-توم يمكن تصور بنجاح وتستهدف التصحيح من خلال ألفيوس (تصل إلى 100 ميكرون)، ويمكن أيضا أن يتم الوصول إلى الخلايا الهرمية غير الفلورسنت بسهولة نسبيا عندما يتم إعداد الحصين مع تقنية زاوية قطع (انظر القسم 2.2.14 ملاحظة).
   2. تحت عرض التكبير منخفضة من الحصين، وضع القطب لفب في CA1 / سوب لمراقبة ثيتا التذبذبات أثناء التحضير للتجارب المشبك التصحيح.
   3. التبديل إلى التكبير 40X وتزج الهدف على المنطقة المستهدفة؛ خفضه حتى تصبح الطبقات العليا مرئية. التلاعب في موقف المجهر لضمان الوصول المفتوح كافية لماصة التصحيح نهج ماصة من الجانب الآخر.
   4. تحت المجهر مضان، حدد خلية الفلورسنت الفلورسنت توم ونهج مع ماصة التصحيح (2 - 3 MΩ) مليئة الحل داخل الخلايا القياسية.
   5. استخدام قطعة الفم لتطبيق الضغط الإيجابي الضوء على ماصة ورصد المقاومة كما يتم خفض القطب على الخلية. عندما يلتقي طرف الخلية المستهدفة، ومقاومة زيادة ماصة ويظهر ديمبل واضح كما يدفع الضغط الإيجابي على الغشاء. الافراج عن الضغط والتحقق من أن نبض الحالية تتسطح كما يبدأ ختم لتشكيل. على الفور كلأمبير إلى إمكانات فرط القطبية (-70 مف)، ومرة ​​واحدة يتم تحقيق ختم G،، تمزق غشاء الخلية مع كمية صغيرة من الضغط السلبي تطبيقها من خلال حامل ماصة.
   6. مرة واحدة في تكوين خلية كاملة، ودراسة الخصائص الفسيولوجية للخلايا الكهروضوئية التي تم تحديدها خلال التذبذبات الحصين عفوية ( الشكل 3B ).
   7. لاحظ أن تسجيل الغشاء المحتمل داخل الخلايا من الخلايا الكهروضوئية يتميز بسلوك سريع الانسياب و رشقات من إمكانات العمل متزامنة مع إيقاع ثيتا CA1 / سوب المستمر.
   8. التبديل إلى الجهد المشبك وعقد الخلية في إمكانات غشاء مختلفة لتوصيف نسبة مثيرا مقابل مثبطات التيارات المشبكية المثبطة الناتجة عن النشاط الإيقاعي جوهري. ويرد مثال على تسجيل المشبك التصحيح من خلية هرمية في الشكل 3A للمقارنة.
6. السيطرة أوبتوجينيتيك في الحصين معزولة
   ملاحظة: للتحكم أوبتوجينيتيك من نشاط شبكة الحصين، وتستخدم استراتيجية من نوع خلية محددة تنطوي على تفعيل الإيقاعي من الخلايا التي تحتوي على بف غابايرجيك هنا كما تم عرض هذه الخلايا للعب دورا رئيسيا في مزامنة السكان الخلية الرئيسية في الحصين معزولة ²⁵ . ويتحقق التعبير الانتقائي من تشانترودوبسين 2 مثيرة (CHR2) في الخلايا الكهروضوئية من خلال عبور خط الفأر- بف كري مع الفئران تعبر بشكل أساسي CHR2 كري-ديبندنتلي (Ai32)، وبالتالي توليد الفئران بف-تشي. بدلا من ذلك، يبني ناقلات الفيروسية (على سبيل المثال ، أفدج-تشيتا-إيف) يمكن حقنه في الحصين من بف-كري أو بف-توم الفئران (P15-16) لدفع التعبير عن أوبسين مثير في CA1 / سوب إنتيرنيونس ( الشكل 4A ).
   ملاحظة: تم وصف هذه الاستراتيجية سابقا ²⁵ .
   1. وضع القطب لفب في منطقة CA1 / سوب وتصحيح خلية هرمية القريبة في الحصين معزولةأمبوس، بسبب، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، الفأر، معبر، ال التعريف، بلو-ليت، حساس، حساس، أوبسين، CHR2، إلى داخل، بف، إنترنيورونس.
   2. وضع دليل ضوء الألياف البصرية (0،2-1 ملم قطر) فوق إعداد الحصين ومركز على المنطقة المسجلة. استخدام الضوء الأزرق (473 نانومتر) من مصدر ليد لتحفيز أوبتوجينيتيك، تتكون من نبضات الضوء (10-20 مللي ثانية، الناجمة عن إشارة الترانزستور الترانزستور المنطق) أو موجة جيبية أوامر الأوامر تسليمها في تيتا الترددات (4-12 هرتز).
      ملاحظة: وقد وصفت ليد القائم على ضوء التحفيز التجمع في مكان آخر ²⁵ .
   3. التبديل إلى المشبك الحالي وتوصيف نشاط الهرمي خلال التذبذبات ثيتا عفوية.
   4. بدء بروتوكول التحفيز وتسجيل الاستجابات الخفيفة.وبالتأكد من أن التذبذبات الميدانية والنشاط متشابك في الخلايا العصبية المسجلة تصبح متزامنة على نحو متزايد خلال التحفيز أوبتوجينيتيك وأن سرعة الإيقاعي من الخلايا الكهروضوئية النتائج في السيطرة القوية على كل من الترددإنسي وقوة ثيتا التذبذبات ( الشكل 4 ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يوضح هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها من خلال دراسة ثيتا التذبذبات في الماوس معزولة إعداد الحصين في المختبر . ويوضح الإجراء تشريح لاستخراج الحصين معزولة في الشكل 1 . باستخدام هذا التحضير، يمكن فحص التذبذبات ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في حين التسجيلات الكهربية من شرائح الحصين الحاد تشكل معيارا في تقنية المختبر ، والأساليب المعروضة هنا تختلف اختلافا كبيرا عن النهج الكلاسيكي. على عكس الاستعدادات شريحة رقيقة حيث طبقات خلية محددة مرئية على السطح ويمكن فحصها مباشرة، الاستعدادات الحصين سليم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9625
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S8282
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M7506
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P3911
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7528
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C5080
Sodium Ascorbate	Sigma Aldrich	A7631-25G
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Standard Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-951-25	brain extraction
Scalpel Handle #4, 14 cm	WPI	500237	brain extraction
Filter forceps, flat jaws, straight (11 cm)	WPI	500456	brain extraction
Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20	Ultident	02-90010-20	brain extraction
Fine Point Curved Dissecting Scissors	Thermo Fisher Scientific	711999	brain extraction
Teflon (PTFE) -coated thin spatula	VWR	82027-534	hippocampal preparation
Hayman Style Microspatula	Fisher Scientific	21-401-25A	hippocampal preparation
Lab spoon	Fisher Scientific	14-375-20	hippocampal preparation
Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A	hippocampal preparation
Droper	Fisher Scientific		hippocampal preparation
Razor blades Single edged	VWR	55411-055	hippocampal preparation
Lens paper (4 x 6")	VWR	52846-001	hippocampal preparation
Glass petri dishes (100 x 20 mm)	VWR	25354-080	hippocampal preparation
Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm	n.a.	n.a.	hippocampal preparation
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	SH-27B	perfusion system
Aquarium air stones for bubbling	n.a.	n.a.	perfusion system
Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8)	Fisherbrand	14-171-129	perfusion system
Electric Skillet	Black & Decker	n.a.	perfusion system
95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen)	Vitalaire	SG466204A	perfusion system
Glass bottles/flasks (4 x 1 L)	n.a.	n.a.	perfusion system
Submerged recording Chamber	custom design (FM)	n.a.	Commercial alternative may be used
Glass pipettes (1.5/0.84 OD/ID (mm) )	WPI	1B150F-4	electrophysiology
Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator	Quest Scientific	Q-Humbug	electrophysiology
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular devices	MULTICLAMP	electrophysiology
Multiclamp 700B Commander Program	Molecular devices	MULTICLAMP	electrophysiology
Digital/Analogue converter	Molecular devices	DDI440	electrophysiology
PCLAMP10	Molecular devices	PCLAMP10	electrophysiology
Vibration isolation table	Newport	n.a.	electrophysiology
Micromanipulators (manually operated )	Siskiyou	MX130	electrophysiology (LFP)
Micromanipulators (automated)	Siskiyou	MC1000e	electrophysiology (patch)
Audio monitor	A-M Systems	Model 3300	electrophysiology
Micropipette/Patch pipette puller	Sutter	P-97	electrophysiology
Custom-built upright fluorescence microscope	Siskiyou	n.a.	Imaging
Analogue video camera	COHU	4912-2000/0000	Imaging
Digital frame grabber with imaging software	EPIX, Inc	PIXCI-SV7	Imaging
Olympus 2.5X objective	Olympus	MPLFLN	Imaging
Olympus 40X water immersion objective	Olympus	UIS2 LUMPLFLN	Imaging
Custom-made Light-Emitting Diode (LED) system	custom	n.a.	optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
PV::Cre (KI) mice	Jackson Laboratory	stock number 008069	Allow  Cre-directed gene expression in PV interneurons
Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	Jackson Laboratory	stock number 007905	Express TdTomato following Cre-mediated recombination
Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	Jackson Laboratory	stock number 012569	Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase
PVChY mice	In house breeding	n.a.	Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP