Tuning nella Banda Theta Ippocampale<em&gt; In vitro</em&gt;: Metodologie per la registrazione dal circuito isolante di roditore Septohippocampal

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per registrare la teoria ritmica della rete neuronale e le oscillazioni gamma da una preparazione interamente isolata di ippocampo. Descriviamo le fasi sperimentali dall'estrazione dell'ippocampo ai dettagli del campo, delle registrazioni a blocchi di patch patch unitari e intere cellule, nonché della stimolazione ottogenetica del ritmo theta.

Abstract

Questo protocollo descrive le procedure per la preparazione e la registrazione dall'ippocampo intero isolato, dai topi transgenici e dai topi transgenici, nonché dai recenti miglioramenti nelle metodologie e nelle applicazioni per lo studio delle oscillazioni. Viene presentata una semplice caratterizzazione della preparazione ippocampale isolata, in cui viene analizzata la relazione tra oscillatori ippocampali theta e l'attività delle cellule piramidali e degli interneuroni GABAergici delle aree cornu ammonis-1 (CA1) e subiculum (SUB). Nel complesso mostriamo che l'ippocampo isolato è in grado di generare oscillazioni di theta intrinseche in vitro e che la ritmicità generata all'interno dell'ippocampo può essere manipolata in modo preciso dalla stimolazione ottogenetica di interneuroni parvalbuminici (PV). Il preparato ippocampo isolato in vitro offre un'occasione unica per utilizzare registrazioni simultanee di campo e intracellulari da un patch-clamp da identificazioni visivamente identificatePer capire meglio i meccanismi che sottendono alla generazione del ritmo theta.

Introduzione

Le oscillazioni di theta ippocampali (4-12 Hz) sono tra le forme più prevalenti di attività ritmica nel cervello dei mammiferi e si credono a svolgere ruoli chiave nelle funzioni cognitive quali elaborazione di informazioni spaziali e formazione di memorie episodiche ^{1 , 2 , 3} . Mentre diversi studi in vivo che evidenziano il rapporto delle cellule place-theta modulate con studi di navigazione spaziale e lesioni, nonché prove cliniche, supportano la visione che le oscillazioni ippocampali sono coinvolte nella formazione della memoria ^{4 , 5 , 6} , i meccanismi associati Con generazione di oscillazioni theta ippocampali non sono ancora completamente compresi. Le prime indagini in vivo suggerivano che l'attività theta dipendesse principalmente da oscillatori estrinseci, in particolare l'ingresso ritmicoDa strutture cerebrali afferenti come il settto e la corteccia entorhina ^{7 , 8 , 9 , 10} . È stato anche postulato un ruolo per fattori intrinseci - connettività interna delle reti neuronali ippocampali insieme alle proprietà dei neuroni ippocampali - in base alle osservazioni in vitro ^{11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18} . Tuttavia, a parte alcuni studi di rilievo ^{19 , 20 , 21} , difficoltà nello sviluppo di approcci che potrebbero replicare attività fisiologicamente realistiche di popolazione in una semplice preparazione di fetta in vitroSono stati, per lungo tempo, ritardato un esame sperimentale più dettagliato delle abilità intrinseche dell'ippocampo e delle aree correlate per auto generare oscillazioni di theta.

Un importante inconveniente dell'insieme sperimentale in vitro di sottile fetta è che l'organizzazione cellulare e sinaptica 3D delle strutture cerebrali è di solito compromessa. Ciò significa che non possono essere supportate molte forme di attività di rete concertata basate su gruppi di cellule distribuite spazialmente, che vanno da gruppi localizzati (≤1 mm radius) alle popolazioni di neuroni diffusi in una o più aree del cervello (> 1 mm). Tenuto conto di queste considerazioni, è stato necessario un approccio diverso per studiare come le oscillazioni di theta emergono nell'ippocampo e si propagino alle strutture di uscita corticali e subcorticali correlate.

Negli ultimi anni, lo sviluppo iniziale della preparazione completa "septo-ippocampale" per esaminare l'intero bidirezionaleLe due delle strutture ²² e la conseguente evoluzione della preparazione "ippocampo isolato" hanno rivelato che le oscillazioni di theta intrinseca si verificano spontaneamente nell'ippocampo privo di input ritmico esterno ²³ . Il valore di questi approcci risiede sulla prima comprensione che tutta la struttura funzionale di queste regioni doveva essere conservata per poter funzionare come un ritmo di theta in vitro ²² .

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite secondo protocolli e linee guida approvate dal comitato McGill University Animal Care e dal Canadian Council on Animal Care.

1. Preparazione acuta di ippocampo in vitro

NOTA: L'isolamento della preparazione ippocampale intatta comporta tre fasi principali: (1) Preparazione di soluzioni e attrezzature, (2) Dissection dell'ippocampo e (3) Impostazione del sistema di velocità di perfusione veloce necessaria per la generazione di oscillazioni theta intrinseca. In questo protocollo, la tempestiva esecuzione delle procedure - dalla dissezione alla registrazione - è particolarmente importante perché l'ippocampo isolato costituisce una preparazione così densa, ma delicata che mantenendo la connettività funzionale della struttura in vitro richiede grande cura. Preparare tutto in anticipo assicura che sia disponibile un livello adeguato di perfusione il più presto possibile per ridurre al minimo la cellula dAmage e mantenere la funzione fisiologica.

1. Soluzione cerebrale cerebrale artificiale a base di saccarosio (aCSF)
   1. Preparare la soluzione di saccarosio a base di 1X da utilizzare per la dissezione e l'incubazione post-dissezione. Combinare tutti i componenti elencati nella Tabella 1, tranne per CaCl _2, in 1 L di acqua deionizzata, e conservare a 4 ° C fino a 2 settimane.
2. Soluzione aCSF standard
   1. Preparare l'aCSF standard per la perfusione di portata elevata dell'ippocampo isolato durante le registrazioni elettrofisiologiche. Per rendere il concentrato (5X) stock aCSF, sciogliere tutti i componenti elencati nella Tabella 2, tranne CaCl _2, in 2 L di acqua deionizzata e conservare a 4 ° C.
3. Preparare l'attrezzatura
   1. Prima di iniziare la dissezione, impostare l'area del banco con un vassoio di plastica riempito di ghiaccio (30 x 20 x 5 cm), linee tubo collegate al carbogeno ePiatti di vetro Petri (10 x 2 cm) (vedi figura 1 ).
   2. Aggiungere 300 ml di soluzione di saccarosio (scatola 1X) a un bicchiere da 500 ml, bolle con carbogeno (95% O ₂ , 5% CO ₂ ) e aggiungere Ca ²⁺ [1,2 mM].
   3. Trasferire 60 ml di questa soluzione di saccarosio in un piatto di Petri di vetro e lasciare a temperatura ambiente. Mettere il resto in un congelatore da 4 ° C per 10-15 minuti.
   4. Bolle la soluzione di saccarosio ghiacciata con carbogen durante la dissezione.
   5. Riempire un secondo piatto di Petri (camera fredda di tenuta) con la soluzione di saccarosio (4 ° C) e mantenerlo in ghiaccio.
   6. Aggiungere 30 ml di soluzione di saccarosio ghiacciata a un bicchiere da 50 ml.

2. Tutta la dissezione dell'ippocampo

NOTA: Il metodo per la dissezione dell'ippocampo isolato è sostanzialmente identico a quello sviluppato e descritto in origine ²² , ma con ulteriori dettagli e modifiche riguardanti il ​​peVelocità di rotazione e tecniche di registrazione.

1. Dissezione cerebrale
   1. Anestetizzare il mouse (P20 - 35) sotto un cappuccio con un piccolo tovagliolo di carta imbevuto di 1 ml di isoflurano (100%) che viene aggiunto alla gabbia.
   2. Decapitate il mouse anestetizzato e immergete rapidamente la testa in soluzione di saccarosio ghiacciata (bicchiere da 50 ml, ~ 5 s). Trasferire su un tovagliolo di carta.
   3. Utilizzare un bisturi per effettuare un'incisione mediale della pelle (caudale al rostral) e spingere la pelle ai lati per esporre il cranio.
   4. Tagliare il cranio con una piccola forbice e utilizzare una spatola per estrarre rapidamente il cervello e farlo cadere nel piatto di Petri contenente soluzione ghiacciata di saccarosio. Lasciare 1-2 minuti per raffreddare il cervello.
   5. Mentre il cervello sta recuperando, aggiungere 2 - 3 ml di soluzione di saccarosio su un foglio di carta coperto Petri (dissection) piatto sul ghiaccio.
2. Isolamento dell'ippocampo
   1. Posizionare il cervello sul piatto di dissezione in posizione positivan.
   2. Rimuovere il cervelletto e la corteccia frontale con una lama di rasoio. Tagliare il cervello a metà lungo il piano midsagittale e restituire i due emisferi isolati alla camera di contenimento. Permettono un ulteriore 1 - 2 min per il recupero.
   3. Posizionare il cervello singolo emisfero in posizione verticale sul piatto di dissezione.
   4. Ruotate il piatto finché le strutture midsagittali non si affacciano sull'osservatore e la contorno incorporata del complesso septale è visibile come un sottile strato di pelo a forma di tessuto anteriore al talamo.
   5. Tenere il cervello cromosomico fisso con la microspatola e mettere la piccola estremità della spatola rivestita con PTFE (politetrafluoroetilene) immediatamente dietro (caudale) alla zona septale.
   6. Inserire la spatola rivestita sotto il setto e spostare la punta fino a raggiungere il piatto di dissezione. Eliminare le fibre che collegano caudalmente l'area septale. Ripetere la stessa operazione lungo il bordo anteriore del setto e tagliare le fibre che si collegano alla parte frontale del cervello.
   7. Con la spatola che tiene leggermente la parte interna della corteccia appena sopra l'ippocampo in posizione verticale, utilizza la microspatola per abbassare attentamente i nuclei thalamic, ipotalamici e restanti nuclei del gambo cerebrale. Usate la spatola per tagliare e togliere il tessuto estratto.
   8. Girare l'emisfero isolato sul fianco e identificare il contorno dell'ippocampo.
   9. Inserire la spatola rivestita nel ventricolo laterale, sotto l'estremità rostrale dell'ippocampo dorsale.
   10. Tenere la spatola allineata orizzontalmente con il piano midsagittale del cervello ematico e farlo scorrere attraverso il contorno liscio delle pareti ventricolari finché la punta non emerge caudalmente.
   11. Tieni la spatola sotto l'ippocampo e premete leggermente sulle fibre di collegamento, lungo lo strato interno dove l'ippocampo si unisce alla corteccia sovrapposta. Applicare la microspasta sul lato esterno di questo strato e far scivolare contro la spatola rivestita per tagliare il filo di collegamentoBers.
   12. Per completare l'estrazione, ruotare il piatto di dissezione e inserire la spatola rivestita sotto l'ippocampo ventrale. Tenga leggermente l'interno della piega corticale con la spatola e taglia attraverso le connessioni entorhinal utilizzando un movimento di taglio contro la microspatola.
       NOTA: L'intero complesso septohippocampale può essere rimosso posizionando la spatola rivestita sotto l'intero ippocampo e tirando fuori il tessuto cerebrale rimanente da sotto.
   13. Una volta che l'isolamento è completo, mantenere l'ippocampo appoggiato sul piatto e aggiungere una goccia di soluzione di saccarosio ghiacciata per mantenerlo fresco. Tagliare con cautela qualsiasi residua corteccia e fibre e separare l'ippocampo dal setto applicando delicatamente una lama del rasoio attraverso il fornix.
       NOTA: Se le coppie di patch patch devono essere eseguite da celle piramidali (vedi sezione 4.6 Controllo ottogenetico), l'ippocampo isolato può essere tagliato trasversalmente ad un angolo di 45 ° per esporre lo strato piramidale di CA1 ("anglE-cut ") senza compromettere la circuiteria di rete locale nella parte rimanente dell'ippocampo.
   14. Trasferire la preparazione a soluzione a saccarosio a temperatura ambiente e lasciarlo ripristinare per 15 - 30 minuti prima di trasferirla nella camera di registrazione.

3. Impostare la Perfusione veloce per la registrazione dell'Ippocampo Isolato

1. Impostare il sistema di perfusione alimentato a gravità per consentire un flusso continuo ad alta velocità di aCSF ossigenato a 20-25 mL / min.
   1. Preparare in anticipo i fiaschi aCSF (1X) e immergerli in un bagno di riscaldamento (~ 30 ° C) almeno 15 minuti prima dell'inizio dell'esperimento. Accendere il sistema di riscaldamento in linea (30 ° C).
   2. Utilizzare gorgogliatori acquari e linee tubo collegato ad un serbatoio carbogeno per ossigenare aCSF tutto l'esperimento, e aggiungere CaCl ₂ [2 mM] prima dell'inizio della perfusione.
   3. Arrestare il flusso aCSF e trasferire l'ippocampo nella camera di registrazione utilizzando l'ampioFine di una pipetta di vetro. Lasciare che la preparazione satura di saccarosio si affonda e si deposita in fondo.
   4. Posizionare la preparazione al centro della camera di registrazione (in linea con l'asse di entrata) con la superficie liscia di CA1 e SUB sulla parte superiore. Stabilizzare l'ippocampo con piccoli pesi alle estremità septali e temporali e riavviare il flusso aCSF.

4. Elettrofisiologia nell'Ippocampo Isolato

1. Registrazione extracellulare delle oscillazioni di theta ippocampo in vitro
   1. Per il monitoraggio extracellulare del potenziale di campo locale (LFP) o l'attività di un singolo gruppo dall'ippocampo isolato in vitro , utilizzare micropipette di vetro (1-3 MΩ) riempite con aCSF. Registri i segnali di potenziale di campo accoppiati a basso rumore con un amplificatore a strappo di gain x1000, filtro a banda in linea da 0,1 a 500 Hz e una frequenza di campionamento di 5-20 kHz.
      NOTA: Il microscopio personalizzato utilizzato in questo protocolloÈ dotato di obiettivi bassi (2,5X) e ad alta magnificazione (40X) per una visione a basso ingrandimento dell'ippocampo, nonché la microscopia a raggi infrarossi e l'epifluorescenza per il riconoscimento singolo cellulare. I componenti di questo sistema includono il microscopio a fluorescenza verticale, i cubi dei filtri a fluorescenza, una videocamera analogica e il grabber digitale con software di imaging, una camera di perfusione personalizzata in fase ( figura 2A , inset) e micromanipulatori ad alta precisione per le registrazioni neuronali Collocazione di fibre ottiche.
   2. Utilizzare la fotocamera montata sul microscopio e collegata a un display del computer per controllare la preparazione ippocampale a bassa ingrandimento (2,5x) e verificare rapidamente che non ci siano sottostanti o danni alla superficie esterna. La disposizione orientata diagonalmente di fibre alvee lungo la superficie liscia di CA1 dovrebbe essere visibile ( Figura 2A , insetto ii) quando brilla la luce trasmessa attraverso l'hippocampus.
   3. Utilizzare l'obiettivo a campo largo di ingrandimento per visualizzare l'ippocampo isolato e il posizionamento degli elettrodi LFP in posizioni di registrazione specifiche.
      NOTA: Un disegno della preparazione ippocampale isolato con più elettrodi disposti in diverse posizioni di registrazione è illustrato nella Figura 2A .
   4. Abbassare un elettrodo LFP nel bagno fino a toccare la superficie (alveo) dell'area CA1.
      NOTA: in genere produce un transitorio veloce nella registrazione accoppiata ad AC simile a ciò che accade quando l'elettrodo viene a contatto con il supporto di registrazione. Un monitor audio può essere utile per ascoltare il segnale del canale LFP dopo questo passaggio.
      NOTA: Spesso, segni precoci di attività appariranno solo dopo 10 - 15 minuti, quindi è importante non avanzare rapidamente nella preparazione. Se dopo questo periodo l'elettrodo LFP di superficie non sta ancora prendendo l'attività, avanzando un po 'più in basso attraverso gli strati oriensE metti in pausa periodicamente per vedere se si crea una qualsiasi forma di attività mentre si avvicina allo strato principale della cellula. Se non viene rilevato nulla dopo altri 5-10 minuti, attentamente tirare l'elettrodo e posizionarlo altrove nella stessa regione.
   5. Avanzate l'elettrodo LFP attraverso lo strato piramidale. Osserva che l'attività di spiking extracellulare inizialmente aumenta in quanto si rileva una scarica unitaria da singoli neuroni (per lo più cellule cestate piramidali e inibitorie). Abbassare ulteriormente l'elettrodo e notare che il picco comincia a sbiadirsi mentre la punta attraversa il radiato. Osservate che una oscillazione della rete chiaramente visibile nella gamma di frequenza theta (4-12 Hz) diventa apparente e raggiunge l'ampiezza massima (~ 100 - 300 μV) poiché la posizione di registrazione viene abbassata attraverso il radiato.
2. Oscillazioni Theta in una singola regione
   1. Per testare le proprietà spaziali delle oscillazioni theta spontanee attraverso la regione CA1, posizionare la punta oFa l'elettrodo LFP di riferimento in un sito CA1 mediale (posizionato medialmente lungo l'asse septo-temporale longitudinale) e abbassarlo nella radiata come descritto in precedenza.
   2. Inserire un secondo elettrodo LFP in un sito CA1 (sezionato da 200 a 800 μm o temporale dal primo LFP) e osservare che le oscillazioni di CA1 possono essere sincronizzate su distanze relativamente grandi.
3. Oscillazioni Theta attraverso strati
   1. Per testare le proprietà delle oscillazioni theta attraverso gli strati ippocampali, lasciare un elettrodo LFP di riferimento in un sito di radiotum CA1. Partendo da appena sopra gli strati di oriens, abbassare un secondo elettrodo nello strato di cellule piramidali, e attraverso il radiato. Osservare una graduale inversione del segnale LFP (inversione di fase relativa) attraverso lo strato piramidale.
      NOTA: per esempi rappresentativi di questi tipi di attività, vedere la Figura 2B . Esempi di profili laminari / profondità e analisi di densità di origine (CSD)Sta illustrando il sito di inversione di fase in ippocampi isolati sono stati pubblicati in precedenza ^{23 , 24 , 25} .
4. Oscillazioni gamma e accoppiamento theta-gamma nell'ippocampo intatto
   1. Posizionare un elettrodo del campo al bordo CA1 / SUB e abbassarlo finché non si posiziona sull'interfaccia tra gli strati piramidali e molecolari. A questo livello, un potenziale di campo che visualizza oscillazioni gamma chiare con variazioni di ampiezza che possono essere registrate dal blocco di fase al ritmo locale di theta ²⁴ . Regolare la scala per osservare la scala temporale lenta dell'accoppiamento theta-gamma. Si noti che le bande gamma si verificano in due distinte bande di frequenza, che possono essere rivelate mediante filtraggio a banda passante, filtrando il segnale LFP in corso nell'ampliamento lento (25-50 Hz) e gamma veloce (150-250 Hz) (vedere la figura 2C per il rappresentante filtrato tracce).
5. Registrazione di morsetti per patch intere cellule durante oscillazioni theta ippocampali in vitro
   NOTA: In questa parte del protocollo, l'obiettivo è quello di ottenere registrazioni di clamp di patch a cellule visivamente guidate da interneuroni identificati in ippocampi isolati da topi PV-TOM transgenici che esprimono la proteina fluorescente, tdTomato, sotto il controllo del promotore PV Maggiori dettagli vedere i materiali e Rif ²⁶ ).
   1. Utilizzare microscopia video a fluorescenza con ingrandimento basso (2,5X) e potenza elevata (40X) per visualizzare i interneuridi tdTomato positivi situati vicino alla superficie di una preparazione ippocampale da un topo PV-TOM ( Figura 3 ). Si noti che mentre i neuroni PV-TOM possono essere visualizzati con successo e mirati per la patch attraverso l'alveo (fino a 100 μm), le cellule piramidali non fluorescenti possono essere raggiunte anche relativamente facilmente quando l'ippocampo viene preparato con la tecnica di taglio ad angolo (vedere Sezione 2.2.14 nota).
   2. Sotto la vista a ingrandimento a bassa dell'ippocampo, posizionare un elettrodo LFP in CA1 / SUB per monitorare le oscillazioni di theta durante la preparazione per esperimenti di morsetti patch.
   3. Passare a 40x ingrandimento e immergere l'obiettivo sulla regione di destinazione; Abbassarlo finché gli strati superiori diventano visibili. Manipolare la posizione del microscopio per garantire un sufficiente accesso aperto per l'applicazione della pipetta patch dal lato opposto.
   4. Sotto la microscopia a fluorescenza, selezionare una cellula fluorescente PV-TOM e avvicinarla con una pipetta patch (2 - 3 MΩ) riempita con soluzione standard intracellulare.
   5. Utilizzare un boccaglio per applicare pressione positiva alla pipetta e monitorare la resistenza quando l'elettrodo viene abbassato sulla cella. Quando la punta incontra la cella bersaglio, la resistenza della pipetta aumenta e una fessura chiara appare come pressione positiva spinge sulla membrana. Rilasciare la pressione e verificare che l'impulso attuale si appiattisca come una guarnizione inizia a formarsi. Immediatamente clAmplificatore ad un potenziale iperpolarizzato (-70 mV) e una volta ottenuta una sigillatura GΩ, rottura la membrana cellulare con una piccola quantità di pressione negativa applicata attraverso il porta pipetta.
   6. Una volta nella configurazione a cellule intere, esaminare le proprietà fisiologiche della cellula PV identificata durante oscillazioni ippocampali spontanei ( Figura 3B ).
   7. Osservare che la registrazione delle potenzialità delle membrane intracellulari dalle cellule fotovoltaiche è caratterizzata da comportamenti rapidi e da bursts di potenziali d'azione sincronizzati con il ritmo continuo di CA1 / SUB.
   8. Passare al morsetto di tensione e tenere la cella a diversi potenziali della membrana per caratterizzare il rapporto delle correnti sinaptiche eccitatrici e inibitorie generate dall'attività intrinseca ritmica. Un esempio di registrazione di morsetti di patch da una cella piramidale è mostrato nella Figura 3A per il confronto.
6. Controllo ottogenetico nell'ippocampo isolato
   NOTA: Per il controllo ottogenetico dell'attività di rete ippocampale, viene utilizzata una strategia specifica di tipo cellulare che coinvolge l'attivazione ritmica delle cellule GABAergiche contenenti PV, poiché queste cellule sono state mostrate per svolgere un ruolo importante nella sincronizzazione delle popolazioni delle cellule principali nell'ippocampo isolato ²⁵ . L'espressione selettiva del channelrhodopsin-2 (ChR2) eccitatorio nelle cellule PV è ottenuta attraversando la linea del mouse di PV-Cre con topi che esprimono costantemente ChR2 Cre-dipendente (Ai32), generando così i topi PV-ChY. In alternativa, i costruttori di virus virali ( es . AAVdj-ChETA-eYFP) possono essere iniettati nell'ippocampo dei topi PV-Cre o PV-TOM (P15-16) per guidare l'espressione dell'opsina eccitatoria negli interneuroni CA1 / SUB ( Figura 4A ).
   NOTA: Questa strategia è stata descritta in precedenza ²⁵ .
   1. Posizionare un elettrodo LFP nell'area CA1 / SUB e patch una cella piramidale vicina nell'ippo isolatoAmpio di un topo che esprime l'opsina eccitatorica sensitiva blu-chiara ChR2 negli interneuroni fotovoltaici.
   2. Posizionare una guida ottica di fibre ottiche (diametro 0,2 - 1 mm) sopra la preparazione ippocampale e centrarla sulla regione registrata. Usare la luce blu (473 nm) da una sorgente a LED per la stimolazione ottogenetica, composta da impulsi di luce (10-20 ms, innescato da un segnale di transistor-transistore logico) o comandi di tensione sinusoidale erogati alle frequenze di tensione (4-12 Hz).
      NOTA: L'assemblaggio personalizzato di stimolazione luminosa a LED è stato descritto altrove ²⁵ .
   3. Passare alla pinza corrente e caratterizzare l'attività della piramide durante le oscillazioni spontanee theta.
   4. Avviare il protocollo di stimolazione e registrare le risposte di luce. Tenendo presente che le oscillazioni di campo e l'attività sinaptica nel neurone registrato diventano sempre più sincronizzate durante la stimolazione ottogenetica e che la stimolazione ritmica delle cellule PV produce un controllo robusto di entrambe le frequenzeEncy e potenza delle oscillazioni theta ( Figura 4 ).

Risultati

Questa sezione illustra esempi di risultati che possono essere ottenuti studiando le oscillazioni di theta nella preparazione ippocampale isolata in mouse in vitro . La procedura di dissezione per estrarre l'ippocampo isolato è illustrata in Figura 1 . Utilizzando questa preparazione, le oscillazioni di theta intrinseca possono essere esaminate durante il posizionamento di elettrodi di campo multiplo, registrando l'attività complessi...

Discussione

Mentre le registrazioni elettrofisiologiche da fette acute di ippocampo costituiscono una tecnica standard in vitro , i metodi presentati qui differiscono sostanzialmente dal metodo classico. A differenza delle preparazioni sottili di fetta dove sono visibili strati cellulari specifici sulla superficie e possono essere esaminati direttamente, i preparati ippocampali intatti sono più simili alle configurazioni in vivo in cui gli elettrodi vengono abbassati in regioni cerebrali mirate attraversando sing...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9625
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S8282
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M7506
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P3911
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7528
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C5080
Sodium Ascorbate	Sigma Aldrich	A7631-25G
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Standard Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-951-25	brain extraction
Scalpel Handle #4, 14cm	WPI	500237	brain extraction
Filter forceps, flat jaws, straight (11cm)	WPI	500456	brain extraction
Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20	Ultident	02-90010-20	brain extraction
Fine Point Curved Dissecting Scissors	Thermo Fisher Scientific	711999	brain extraction
Teflon (PTFE) -coated thin spatula	VWR	82027-534	hippocampal preparation
Hayman Style Microspatula	Fisher Scientific	21-401-25A	hippocampal preparation
Lab spoon	Fisher Scientific	14-375-20	hippocampal preparation
Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A	hippocampal preparation
Droper	Fisher Scientific		hippocampal preparation
Razor blades Single edged	VWR	55411-055	hippocampal preparation
Lens paper (4X6 inch)	VWR	52846-001	hippocampal preparation
Glass petri dishes (100 x 20 mm)	VWR	25354-080	hippocampal preparation
Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm	n.a.	n.a.	hippocampal preparation
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	SH-27B	perfusion system
Aquarium air stones for bubbling	n.a.	n.a.	perfusion system
Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8)	Fisherbrand	14-171-129	perfusion system
Electric Skillet	Black & Decker	n.a.	perfusion system
95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen)	Vitalaire	SG466204A	perfusion system
Glass bottles/flasks (4 x 1 L)	n.a.	n.a.	perfusion system
Submerged recording Chamber	custom design (FM)	n.a.	Commercial alternative may be used
Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) )	WPI	1B150F-4	electrophysiology
Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator	Quest Scientific	Q-Humbug	electrophysiology
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular devices	MULTICLAMP	electrophysiology
Multiclamp 700B Commander Program	Molecular devices	MULTICLAMP	electrophysiology
Digital/Analogue converter	Molecular devices	DDI440	electrophysiology
PCLAMP10	Molecular devices	PCLAMP10	electrophysiology
Vibration isolation table	Newport	n.a.	electrophysiology
Micromanipulators (manually operated )	Siskiyou	MX130	electrophysiology (LFP)
Micromanipulators (automated)	Siskiyou	MC1000e	electrophysiology (patch)
Audio monitor	A-M Systems	Model 3300	electrophysiology
Micropipette/Patch pipette puller	Sutter	P-97	electrophysiology
Custom-built upright fluorescence microscope	Siskiyou	n.a.	Imaging
Analogue video camera	COHU	4912-2000/0000	Imaging
Digital frame grabber with imaging software	EPIX, Inc	PIXCI-SV7	Imaging
Olympus 2.5x objective	Olympus	MPLFLN	Imaging
Olympus 40x water immersion objective	Olympus	UIS2 LUMPLFLN	Imaging
Custom-made light-emitting diode (LED) system	custom	n.a.	optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
PV::Cre (KI) mice	Jackson Laboratory	stock number 008069	Allow  Cre-directed gene expression in PV interneurons
Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	Jackson Laboratory	stock number 007905	Express TdTomato following Cre-mediated recombination
Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	Jackson Laboratory	stock number 012569	Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase
PVChY mice	In house breeding	n.a.	Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP