JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويرتبط البلعمة الذاتية النشطة مع تجديد العضلات المنتجة، وهو أمر ضروري لتنشيط الخلايا الجذعية العضلات (موسك). هنا، ونحن نقدم بروتوكول للكشف في الموقع من LC3، علامة التلقيح الذاتي في ميوس إيجابية موسس من أقسام الأنسجة العضلية من السيطرة والفئران المصابة.

Abstract

زيادة الأدلة على أن البلعمة الذاتية عملية تنظيمية حاسمة للحفاظ على التوازن الأنسجة. ومن المعروف أن البلعمة الذاتية تشارك في تطوير العضلات والهيكل العظمي والتجدد، وقد وصفت عملية البلعمة الذاتية في العديد من الأمراض العضلية واضطرابات العضلات المرتبطة بالعمر. وهناك كتلة وصفت مؤخرا من عملية البلعمة الذاتية التي ترتبط مع استنفاد وظيفي للخلايا الأقمار الصناعية خلال إصلاح العضلات يدعم فكرة أن يقترن النتوء الذاتي النشط مع تجديد العضلات المنتجة. تكشف هذه البيانات عن الدور الحاسم للالتهام الذاتي في تنشيط الخلايا الفضائية خلال تجديد العضلات في كل من الظروف الطبيعية والمرضية، مثل التصنع العضلي. هنا، ونحن نقدم بروتوكول لمراقبة عملية البلعمة الذاتية في حجرة الخلايا الجذعية العضلات (موسك) خلال ظروف التجدد العضلات. يصف هذا البروتوكول منهجية الإعداد لأداء في التصوير المناعي الموقع من LC3، وأوتوفاجي ماركر، و ميود، علامة النسب العضلي، في أقسام الأنسجة العضلية من السيطرة والفئران المصابة. المنهجية ذكرت يسمح لرصد عملية البلعمة الذاتية في حجرة واحدة محددة الخلية، مقصورة موشك، والتي تلعب دورا محوريا في تنظيم تجديد العضلات.

Introduction

تجدد العضلات والهيكل العظمي هو نتيجة للتفاعل بين الخلايا الجذعية للبالغين (خلايا الأقمار الصناعية العضلات، موسس) وأنواع الخلايا الأخرى التي تشارك في عملية التجدد. يتم الحفاظ على التوازن العضلات وظائف من قبل الإشارات مجتمعة الناشئة عن مكانة العضلات والعظة النظامية 1 ، 2 . طوال فترة الحياة، تم الإبلاغ عن التغيرات في وظائف موسك، مكانة العضلات، والإشارات النظامية، مما أدى إلى انخفاض القدرات الوظيفية في كبار السن 3 . يتم تعيين موسس في مكانة تحت الصفيحة القاعدية، وعند إصابة العضلات، يتم تنشيط لإصلاح العضلات التالفة 4 ، 5 . من أجل ضمان استجابة تجديدية منتجة، من الأهمية بمكان أن تنسق مراكز الخدمة المتعددة العمليات المختلفة اللازمة للخروج من السكون، والتجديد الذاتي، ومرحلة التوسع التكاثريمن خلال التمايز العضلي 6 . في المسنين وفي الأمراض المزمنة العضلات، كل هذه الوظائف للخطر، مما يؤدي إلى تغيير وظائف العضلات 2 ، 3 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 .

ماكرووتوفاجي (المشار إليها فيما يلي باسم البلعمة الذاتية) آخذة في الظهور باعتبارها عملية حيوية حاسمة ضرورية للحفاظ على التوازن الأنسجة 14 . عملية التلقيح الذاتي تشمل آليات الاتجار، حيث يتم اجتياح أجزاء من السيتوبلازم، العضيات، والبروتينات في الحويصلات التي تتحلل في نهاية المطاف عن طريق مسار ليسوسوم، وتعزيز إزالة الجزيئات السامة وإعادة تدوير ماكرومولcules. وهذا يوفر مركبات غنية بالطاقة لدعم التكيف مع الخلايا والأنسجة تحت الإجهاد أو الظروف المعاكسة الأخرى 15 ، 16 . جنبا إلى جنب مع نشاطها على البقاء على قيد الحياة الخلية، يمكن أن البلعمة الذاتية تعمل أيضا كمحفز للموت الخلية، اعتمادا على سياق الأنسجة الخلية (على سبيل المثال، طبيعية مقابل الأنسجة السرطانية) ونوع التحفيز الإجهاد 17 ، 18 .

وتشير الأدلة الأخيرة إلى أن البلعمة الذاتية مطلوب للحفاظ على كتلة العضلات وسلامة ميوفيبر 19 و 20 ، وقد أفيد أن ضعاف في مختلف العضلات التصنع 21 ، 22 ، 23 ، بما في ذلك ضمور العضلات دوشين (دمد) 24 ، 25 ، 26 ، 27 ، 28 ، 29 ، 30. وبالمثل، لوحظ انخفاض تدريجي في عملية البلعمة الذاتية في كبار السن 31 ، 32 ، 33 ، 34 ، 35 ، بعد فقدان كتلة العضلات (المشار إليها ساركوبينيا) 32 ، 33 ، 34 ، 35 ، 36 ، 37 ، وفي بقاء ميوفيبر 38 .

وكان من المتوقع وجود علاقة وثيقة بين البلعمة الذاتية والإمكانات التجددية للعضلات الهيكلية من خلال دراسة من مختبر واغرز، والتي أظهرت أن تقييد السعرات الحرارية يعزز توافر ونشاط موسك 39 . هذا لاوقد أيدت آخر من قبل الملاحظة الأخيرة أن محور Foxo3-نوتش ينشط عملية البلعمة الذاتية أثناء التجديد الذاتي 40 والانتقال موسك من هادئة إلى الدولة المتكاثر 41 . هذه البيانات تتفق مع التخفيض التدريجي للالبلعمة الذاتية من الشباب إلى مسس القديمة وكبار السن، جنبا إلى جنب مع الانخفاض العددي والوظيفي من مراكز الخدمات الطبية خلال الشيخوخة 42 .

في ورقة حديثة، أثبتنا وجود علاقة وثيقة بين البلعمة الذاتية وتجديد العضلات التعويضية التي تميز المراحل المبكرة من تقدم دمد. وبناء على ذلك، لاحظنا تدفق تدفق الذات الذاتي في مراحل لاحقة من تطور المرض، عندما يتم اختراق تجديد العضلات وتليف الأنسجة ترسيب يحدث. ومن المثير للاهتمام، أظهرنا أنه في ظروف التجديد، يتم تنشيط البلعمة الذاتية في موكس، وأن تحوير عملية البلعمة الذاتية يؤثر على تنشيط موسك و فونكتيوناليتي 30 .

وإجمالا، هذه البيانات تسلط الضوء على الحاجة الملحة لاستكشاف عملية البلعمة الذاتية في موكس أثناء تجديد العضلات في الظروف الطبيعية والمرضية وطوال فترة الحياة. هنا، ونحن نقدم بروتوكول لرصد عملية البلعمة الذاتية في موكس في ظروف العضلات التجدد عن طريق أداء المناعية في الموقع لالبروتين المرتبطة 1A / 1B سلسلة الخفيفة 3 (LC3)، علامة من التلقيح الذاتي 43 ، وميود، علامة من في عضلات الأنسجة العضلية من السيطرة والفئران المصابة. المنهجية ذكرت يسمح لرصد عملية البلعمة الذاتية في حجرة واحدة محددة الخلية، و موسك، التي تلعب دورا رئيسيا في تنظيم تجديد العضلات.

Protocol

تم تربيتها والحفاظ على الفئران وفقا لإجراءات منشأة الحيوان القياسية، وتمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل ضمان رعاية الحيوان واللجنة الأخلاقية البحوث الحيوانية الداخلية وفقا لوزارة الصحة الإيطالية وامتثل دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. إصابة العضلات و في كتلة فيفو من التدفق التلقائي

  1. إصابة العضلات.
    1. للحث على إصابة العضلات والهيكل العظمي الحاد، وضخ 20 ميكرولتر من 10 ميكرومتر القلبية (كتكس) الأسهم مباشرة في العضلات الظنبوبية اليسرى (تا) العضلات من الفئران C57BL / 6J البالغ من العمر 2 التي تزن حوالي 20 غرام. استخدام عدد متساو من الذكور والإناث. استخدام الطرف المقابل غير مثقل كعنصر تحكم.
      ملاحظة: يجب أن يتم تصفيتها 10 ميكرومتر كتكس في 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم (0.22 ميكرون فلتر بفدف) وتخزينها في -20 درجة مئوية. تجنب تكرار تجميد ذوبان دورات.
    2. باستخدام iنسولين حقنة مع إبرة 30 G، حقن كتكس في منتصف تا. للحث على إصابة دقيقة في تا، وضمان أن إبرة الحقنة يدخل بالقرب من وتر البعيدة، 5 ملم عميق، من أسفل إلى الجزء العلوي من العضلات ( الشكل 1A ).
  2. حصار من التدفق الذاتي الذاتي في الفئران الجرحى والجرحى.
    1. لتقييم التدفق الذاتي، 24 ساعة بعد الإصابة (بي)، وإدارة 50 ملغ / كلغ كلوروكين (كلق) كل 24 ساعة لمدة 4 د عن طريق الحقن داخل الصفاق (إب) ( الشكل 1B ).
      1. حل كلق (10 ملغ / مل) في برنامج تلفزيوني 1X وتصفية من خلال غشاء 0.2 ميكرون. تزن كل فأر وحساب كمية كلق لحقن.
        ملاحظة: إعداد واستخدام حل كلق في نفس اليوم. يمكن تخزين الأسهم كلق لمدة تصل إلى شهر واحد في -20 درجة مئوية. منذ البلعمة الذاتية هي عملية ذات الصلة بالتأقل، ودائما أداء العلاج كلق دائما في نفس الوقت ( أي في بيفو الصباحري 10 آم).

2. أقسام الأنسجة العضلات

  1. ماوس التضحية.
    1. الموت ببطء الفئران بعد 5 أيام من الإصابة.
    2. أداء القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم أو عن طريق كو 2 (أن يتبعها خلع عنق الرحم لتأكيد). منذ عملية البلعمة الذاتية تتعلق الماوس النوم / عادات الأكل، دائما التضحية الفئران في نفس الوقت، ويفضل أن يكون في الصباح ( أي قبل 10 صباحا).
  2. تا العزلة والشمول.
    1. قبل تشريح، رذاذ الماوس مع الايثانول 70٪.
    2. باستخدام مقص جعل صغيرة، شق عمودي (3 مم طويلة) على الجلد الظهري للفأر على مستوى الوركين. قطع الذيل والقدمين لتبسيط إزالة الجلد. سحب الجلد نحو الذيل وإزالته لفضح العضلات الكامنة. العضلات تا من السهل توطين، كما هو مبين في الشكل 2A .
    3. مع مساعدة من اثنين من ملقط، فهم الأوتار البعيدة.
    4. قطع الأوتار البعيدة. وغالبا ما يتم قطع الأوتار تا و إكستينسور ديجيتوريوم لونغوس (إدل) بشكل مشترك وفصل لاحقا (انظر الخطوة 2.2.6).
    5. باستخدام ملقط، وعقد العضلات تا عن طريق وتر وسحب بعناية العضلات حتى نحو نهاية القريبة (بالقرب من الركبة؛ الشكل 2B ).
      ملاحظة: عند هذه النقطة، و إدل و تا العضلات يمكن التعرف عليها بسهولة، و تا أكبر وأكثر سطحية من مؤسسة كهرباء لبنان.
    6. فصل تا من العضلات إدل عن طريق سحب الأوتار البعيدة اثنين في الاتجاهات المعاكسة ( الشكل 2C ).
    7. قطع وتر القريبة.
    8. باستخدام ملقط، وإزالة اللفافة رقيقة التي تغطي العضلات، دون الإضرار الأنسجة.
    9. إزالة الرطوبة الزائدة في العينة مع مساعدة من منشفة ورقية. تأكد من أن العضلات ليست رطبة، ولا جافة بشكل مفرط، والرطوبة المفرطة تنتج سيجضرر كبير للعضلات ويعرض تلطيخ المقبل.
    10. مكان الأمثل قطع درجة الحرارة (أكتوبر) مجمع في الجزء السفلي من العفن ووضع العضلات في ذلك، في التوجه هو مبين في الشكل 2D . إضافة 100٪ الأيزوبنتان إلى كوب حتى يصل إلى عمق حوالي 3-4 سم. وضع الكأس في اتصال مع النيتروجين السائل في مربع البوليسترين.
    11. لا تدع النيتروجين السائل يدخل الكأس، كما أنها سوف تنتج رغوة محتدما، والتي يمكن أن تؤثر على إدراج وتلف أقسام العضلات.
    12. مراقبة الأيزوبنتان والانتظار حتى تصل إلى درجة الحرارة المناسبة (بين -140 درجة مئوية و -150 درجة مئوية). في درجة الحرارة المناسبة، طبقة بيضاء صلبة من الأيزوبنتان المجمدة سوف تبلور على الجزء السفلي من الكأس.
    13. إذا كان إيزوبنتان يتجمد تماما الصلبة، تذوب والبرد إلى درجة حرارة التجمد قبل الشروع في الخطوة التالية.
    14. باستخدام ملقط بريشيلد، خفض بدقة العفن فيالإيزوبنتان لمدة 20-30 ثانية تقريبا. وضع العينة المجمدة في وعاء مع الثلج الجاف حتى يتم نقله إلى الفريزر -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا.
  3. العضلات كريوسكتيونس الأنسجة.
    1. بعد ليلة واحدة على الأقل في -80 درجة مئوية، وإجراء كريوسكتيونينغ.
    2. تأخذ سكين ناظم البرد و لوحة مكافحة لفة من الفريزر -20 درجة مئوية ووضعها على الدعم منها في مجلس الوزراء ناظم البرد.
    3. وضع قطرة من أكتوبر على كعب عينة ومكان على ذلك العينة المجمدة، في التوجه نس نسبي، كما تصور في الشكل 2D .
    4. وضع كعب العينة على تشاك.
    5. دون سحب لوحة مكافحة لفة أسفل على السكين، وجعل بعض التخفيضات في 40 ميكرون للتخلص من أكتوبر التي لا تشمل العضلات. عندما تصبح العضلات مرئية، والحد من سمك شريحة إلى 7-8 ميكرون.
    6. اسحب لوحة مكافحة لفة حتى يتم محاذاةعلى حافة السكين أو قليلا فوقه.
    7. قطع المقاطع المستعرضة 7-8 ميكرون سميكة وجبل شرائح 3-4 في الشريحة النسيجي.
      ملاحظة: درجة الحرارة البرد اقترح بين -15 درجة مئوية و -23 درجة مئوية. وهناك حاجة إلى أقسام عرضية من العينات للتحليل اللاحق لتحديد الخلايا الجذعية العضلية في مكانة الأقمار الصناعية المتخصصة.
    8. لتحقيق أقصى قدر من الالتزام من القسم، والحفاظ على الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة وذلك لمنع انفصالهم خلال حضانة الأجسام المضادة.
      ملاحظة: خطوة تجفيف الهواء يمكن أن تؤثر المناعية، وتوفير نتائج غامضة. الشرائح يمكن تخزينها غير المثبتة لعدة أشهر في -80 درجة مئوية. يمكن إيقاف البروتوكول هنا.
  4. التحقق من تلف العضلات في كريوسكتيونس العضلات تا من خلال أداء هيماتوكسيلين يوسين (H & E) تلطيخ.
    1. لتقييم نوعية العضلات ( أي فعالية الإصابة، العزلة العضلات و إنكلوسأيون، و كريوسكتيونس)، إجراء H & E تلطيخ. لكل نقطة زمنية تجريبية، إصلاح شريحة واحدة مع بفا 4٪ لمدة 10 دقيقة. بعد التثبيت، وغسل الشرائح جيدا في عدة تغييرات من برنامج تلفزيوني 1X.
      ملاحظة: الحذر. بفا هو مادة مسرطنة ويجب التعامل معها بعناية.
    2. تأخذ شريحة واحدة لكل نقطة تجريبية ووضعها في جرة تلطيخ.
    3. ملء جرة مع 9 غرام / لتر الهيماتوكسيلين حتى يتم تغطية المقاطع واحتضان لمدة 8 دقائق.
    4. إعادة تدوير الهيماتوكسيلين.
    5. ترك جرة تحت الماء الجاري لمدة 10 دقيقة لإزالة الفائض من الهيماتوكسيلين.
      ملاحظة: تأكد من عدم تدفق الماء مباشرة على المقاطع.
    6. يغسل باستخدام الماء المعقم.
    7. احتضان المقاطع مع يوزين 0.5٪ (ث / ت) في حمض الإيثانول 90٪ لمدة 1 دقيقة.
    8. إعادة تدوير يوزين.
    9. اغسل مرتين بالماء المعقم لمدة 3 دقائق / غسل.
      ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية على غطاء محرك كيميائي.
    10. غسل المقاطع مع الايثانول 70٪.
    11. غسلوالأقسام مع الايثانول 90٪.
    12. غسل المقاطع مع الايثانول بنسبة 100٪.
    13. احتضان المقاطع مع 0.879 غرام / مل O-زيلين.
      ملاحظة: الحذر. o-زيلين قابل للاشتعال وسمي معتدل. التعامل معها تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية، وارتداء معدات واقية، بما في ذلك القفازات، معطف المختبر، وقناع.
    14. إعادة تدوير الزيلين.
    15. وضع الشرائح على قطعة من الورق لتجف.
    16. إغلاق الشرائح باستخدام سريعة تصلب، القائم على الزيلين تصاعد المتوسطة.
    17. تحقق من جودة الأقسام تحت المجهر الضوئي في 10X التكبير (انظر الشكل 3 )
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا.

3. إمونوستينينغ ل LC3 و ميود في إصابة العضلات الأنسجة أقسام

  1. تثبيت أقسام الأنسجة العضلية.
    1. إعداد غرفة الحضانة عن طريق ترطيب قطعة من الورق ووضعه على الجزء السفلي من مربع البلاستيك قابل للإغلاق للحفاظ على ارتفاع ليفيل من الرطوبة داخل الغرفة. إصلاح أقسام الأنسجة مع بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: يتم استخدام قطعة رطبة من الورق لتجنب تجفيف العينة. إعداد بفا الطازجة أو استخدام بفا المخزنة في -20 درجة مئوية. الحذر. بفا سامة. يجب التعامل مع مسحوق بعناية عند تقديم حل المخزون. يجب أن يتم تنفيذ هذه العملية في غطاء كيميائي، مع معدات واقية، بما في ذلك القفازات، معطف المختبر، وقناع. أيضا، عندما يكون في حل، بفا ينبغي التلاعب بها بعناية.
    2. إزالة بفا وغسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5-7 دقيقة. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
  2. بيرمابيليزاتيون من أقسام الأنسجة العضلية.
    1. رسم حاجز مسعور حول أقسام الأنسجة باستخدام قلم حبر.
      ملاحظة: هذه الخطوة تحدد السطح حول أقسام الأنسجة ويقلل من حجم الأجسام المضادة الموصوفة في الخطوات 3.4، 3.6، 3.7، و 3.9.
    2. تغطية الأقسام مع 200 ميكرولتر من البرد (-20 درجة مئوية)الميثانول ووضع غرفة الحضانة أفقيا داخل الفريزر في -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. إزالة غرفة الحضانة من الثلاجة، نضح الميثانول، وغسل المقاطع with1X بس لمدة 5-7 دقيقة في رت. كرر هذه الخطوة 3X.
  3. حجب
    1. إعداد حل كتلة جديدة من 4٪ البقري المصل ألبومين (بسا) في برنامج تلفزيوني 1X.
      ملاحظة: يمكن تخزين حل بسا تصل لمدة 1 أسبوع في 4 درجات مئوية.
    2. احتضان المقاطع مع حل كتلة لمدة 60 دقيقة على الأقل في رت.
    3. إزالة الحل حظر.
    4. إعداد 100 ميكرولتر من مزيج مكافحة فاب عن طريق تمييع 20 ميكروغرام / مل مكافحة فاب في برنامج تلفزيوني 1X. احتضان المقاطع مع مقاربة تقارب F (أب) ونكونجوغاتد من مفتش المضادة للماوس لمدة 1 ساعة في رت.
  4. حضانة الأجسام المضادة الأولية.
    1. إعداد 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية لكل شريحة عن طريق إذابة LC3 والأجسام المضادة ميود في 4٪ بسا في برنامج تلفزيوني 1X. استخدام 5 ميكروغرام /مل من مكافحة LC3 (الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة) و 10 ملغم / لتر من المضادة لل ميود (الماوس الأجسام المضادة وحيدة النسيلة). احتضان مزيج الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. يغسل.
    1. إزالة مزيج الأجسام المضادة الأولية.
    2. غسل المقاطع مع 1٪ بسا في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 3X.
  6. الثانوية حضانة الأجسام المضادة.
    1. إعداد 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية لكل شريحة. حل الماعز المضادة للأرنب 488 (5 ميكروغرام / مل) والماعز المضادة للفأر 594 (5 ميكروغرام / مل) في 4٪ بسا في برنامج تلفزيوني 1X.
      ملاحظة: تجنب التعرض المفرط للضوء لمنع تبييض تلوين. قم بتنفيذ الخطوات التالية في الظلام.
    2. احتضان المقاطع مع مزيج الأجسام المضادة الثانوية لمدة 45 دقيقة في رت.
    3. إزالة مزيج الأجسام المضادة الثانوية وغسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5-7 دقيقة. كرر هذه الخطوة 3X.
  7. حضانة الأجسام المضادة الأولية.
    1. تمييع لامينيn-2 (α-2-شين) الأجسام المضادة أحادية النسيلة (0.33 ميكروغرام / مل) في 4٪ بسا في برنامج تلفزيوني 1X باستخدام 100 ميكرولتر من الخليط لكل شريحة. احتضان المقاطع في مزيج الأجسام المضادة الأولية لمدة 1-2 ساعة في رت.
  8. يغسل.
    1. إزالة مزيج الأجسام المضادة الأولية.
    2. غسل المقاطع مع 1٪ بسا في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 3X.
  9. الثانوية حضانة الأجسام المضادة.
    1. إعداد 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية لكل شريحة عن طريق تمييع الماعز المضادة للفئران 647 (5 ميكروغرام / مل) في 4٪ بسا في برنامج تلفزيوني 1X. احتضان المقاطع في مزيج الأجسام المضادة الثانوية لمدة 45 دقيقة في رت.
    2. إزالة مزيج الأجسام المضادة الثانوية وغسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5-7 دقيقة. كرر هذه الخطوة 3X.
  10. 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (دابي) الحضانة.
    1. إضافة 200 ميكرولتر من 300 نانومتر حل دابي في برنامج تلفزيوني 1X لكل شريحة. احتضان لمدة 5 دقائق في رت. تخزين الحل دابي في 4 درجات مئوية فيداكن.
    2. غسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5-7 دقيقة. كرر هذه الخطوة 3X.
  11. تصاعد أقسام العضلات الملون.
    1. إزالة الفائض من الحل الغسيل من الأقسام.
    2. مكان 10 ميكرولتر من الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X (3: 1) على أقسام ملطخة في منتصف الشريحة وإضافة ساترة، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء.

4. متحد البؤر المجهري اكتساب

  1. الحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر أربعة الليزر متكاملة مع نظام التقاط الصور والبرمجيات التحليلية.
    ملاحظة: مترافق ميود مع صبغ 594 الذي هو مشرق أحمر الفلورسنت صبغ، مع الإثارة مناسبة بشكل مثالي ل 594 نانومتر ليزر (الإثارة: 590 نانومتر، الانبعاثات: 617 نانومتر). يترافق LC3 مع صبغ 488 الذي هو مشرق الأخضر الفلورسنت صبغ، مع الإثارة مناسبة بشكل مثالي لخط ليزر 488 نانومتر (الإثارة: 495 نانومتر، الانبعاثات: 519 نانومتر). يترافق لامينين مع صبغ 647 هذا هومشرق أحمر أحمر الفلورسنت صبغ، مع الإثارة مناسبة بشكل مثالي لخط ليزر نانومتر 647 (الإثارة: 650 نانومتر، الانبعاثات: 668 نانومتر).
  2. وضع الشرائح في علبة المجهر واستخدام التكبير 63X للكشف عن الإشارات النووية.تركيز يدويا على المناطق التجدد من خلال توسيط مجالات التجديد النشط، والاعتماد على مورفولوجيا العضلات (انظر الشكل 4 ).
    ملاحظة: بينما في العضلات غير مثقل، وحجم ميوفيبر ثابت تقريبا ( الشكل 4A )، والإصابة بوساطة تجديد العضلات يمكن التعرف عليها من قبل ظهور ميوفيبرز أصغر، والتي هي الألياف التي شكلت حديثا بعد التجديد. وعلاوة على ذلك، وتتميز العضلات في التجديد النشط من خلال التسلل واسعة النطاق التي يتم إجراؤها من الضامة، السلائف الليفية أديبوجينيك، والخلايا التي مترجمة إلى العضلات التالفة لنسج تجديد العضلات ( الشكل 4B ).
  3. تقييم تلطيخ إمونوفلورسنت في ريجنالمناطق الاستشفائية من خلال التركيز على موكس التي تقع تحت الصفيحة القاعدية من ميوفيبرز.
  4. التركيز على موسس التي هي إيجابية ل ميود تلطيخ ووضعه داخل ميوفيبرز ملحوظ تلطيخ لامينين (انظر الشكل 4B ، والسهام البيضاء).
  5. استخدام ما لا يقل عن 3 الفئران / المجموعة التجريبية واستخدام المجهر للحصول على صور التكبير 63X من 7 حقول على الأقل لكل مجموعة التجريبية.
  6. مرة واحدة يتم التعرف على المناطق التجدد، والتركيز باستخدام تلطيخ دابي ثم ضبط قنوات واحدة أخرى.
    1. استخدام إعدادات المجهر التالية: قناة A594 الثقب 1.2 وحدة مهواة، كسب 791؛ قناة A488 الثقب 1.6 وحدة تهوية، كسب 659؛ قناة A647 الثقب 1.4 وحدة مهواة، كسب 719.
  7. بعد ضبط التركيز من قنوات واحدة، والشروع في الحصول على الصور في 1024 × 1024 حجم الإطار و 12.61 μs بكسل يسكن.
  8. حساب النسبة المئوية للخلايا إيجابية ميود (السيطرة على رانه موقع الصحيح تحت الصفيحة) التي هي LC3 سلبية ونسبة الخلايا إيجابية ميود التي تعرض إشارة LC3.
    ملاحظة: النسبة المئوية للخلايا إيجابية ميود التي تظهر تلطيخ LC3 هو قراءات هذا البروتوكول.

النتائج

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة في الموقع للكشف عن البلعمة الذاتية في موسس خلال تجديد العضلات.

كتكس في العلاجات فيفو :

استخدام كت?...

Discussion

يصف هذا البروتوكول كيفية مراقبة البلعمة الذاتية في الخلايا الجذعية العضلات والهيكل العظمي خلال تجديد العضلات التعويضية. وقد حاولت عدة أجسام مضادة للتلطيخ المشترك من LC3 و ميود، وتلك التي تعمل في أقسام الأنسجة الماوس وخلق نتائج ناجحة مدرجة هنا (انظر الجدول الم...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل نيامز AR064873، مشروع إبيجن ي. P01.001.019 / بروجيتو بانديرا إبيجينوميكا إفت تو ل

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664WT mice
Cardiotoxin 1LatoxanL8102
Millex-VVMerck MilliporeSLVV033RSSyringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Chloroquine diphosphate saltSigma-AldrichC6628Caution:
Harmful if swallowed
BD Micro-Fine + 0.5 mLBD324825
Tissue-Tek O.C.T. compoundSakura Finetek25608-930
Tissue-Tek Cryomold IntermediateSakura Finetek4566
2-MethylbutaneSigma-Aldrich277258
Hematoxylin Solution, Harris ModifiedSigma-AldrichHHS32
Eosin Y solution, alcoholicSigma-AldrichHT110132
o-XyleneSigma-AldrichX1040Caution:
Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148Caution:
Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190-094
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA7030
GlycerolSigma-AldrichG5516
Eukitt - Quick-hardening mounting mediumSigma-Aldrich3989
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-007-003
LC3B AntibodyCell signaling Technology2775
Monoclonal mouse anti-MyoD
(concentrated) clone 5.8A		DAKO - Agilent Pathology SolutionsM3512
Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibodyEnzo Life Sciences4H8-2
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Life technologiesA11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Life technologiesA11005
Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM AntibodyLife technologiesA21248
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306

References

  1. Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
  2. Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
  3. Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
  4. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
  5. Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
  6. Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
  7. Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
  8. Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
  9. Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
  10. Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
  11. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
  12. Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
  13. Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs?. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
  14. Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
  15. Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
  16. Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
  17. Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, 1468-1472 (2005).
  18. Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
  19. Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
  20. Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
  21. Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
  22. Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
  23. Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
  24. De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
  25. Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
  26. Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
  27. Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
  28. Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
  29. Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
  30. Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
  31. Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
  32. Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
  33. Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
  34. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
  35. Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
  36. Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
  37. Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
  38. Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
  39. Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
  40. Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
  41. Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
  42. Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
  43. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124 LC3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved