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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'autofagia attiva è associata alla rigenerazione muscolare produttiva, che è indispensabile per l'attivazione della mucosa muscolare (MuSC). Qui forniamo un protocollo per la rilevazione in situ di LC3, un marker di autofagia in MuOs MyoD positivi delle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti.

Abstract

L'aumento delle evidenze indica l'autofagia come un processo regolatorio cruciale per preservare l'omeostasi dei tessuti. È noto che l'autofagia è coinvolta nello sviluppo e nella rigenerazione muscolare dello scheletro, e il processo autofagico è stato descritto in molte patologie muscolari e nei disturbi muscolari legati all'età. Un blocco recentemente descritto del processo autofagico che è correlato con l'esaurimento funzionale delle cellule satellitari durante la riparazione muscolare supporta la nozione che l'autofagia attiva è accoppiata con la rigenerazione muscolare produttiva. Questi dati scoprono il ruolo cruciale dell'autofagia nell'attivazione delle cellule satellite durante la rigenerazione muscolare sia nelle condizioni normali che patologiche, come le distrofie muscolari. Qui forniamo un protocollo per monitorare il processo autofagico nel vano adulto di cellule staminali muscolari (MuSC) durante le condizioni di rigenerazione muscolare. Questo protocollo descrive la metodologia di setup per eseguire in situ immunofluorescenza imaging di LC3, un aMarcatore di utopia, e MyoD, un marcatore di linee miogenico, nelle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti. La metodologia riportata consente di monitorare il processo autofagico in uno specifico compartimento cellulare, il compartimento MuSC, che svolge un ruolo centrale nell'orchestrare la rigenerazione muscolare.

Introduzione

La rigenerazione muscolare scheletrica è il risultato dell'interazione tra cellule staminali adulte (Cellule Muscle Satellite, MuSCs) e altri tipi di cellule che sono coinvolti nel processo rigenerativo. L'omeostasi muscolare e la funzionalità vengono mantenuti dai segnali combinati derivanti dalla nicchia muscolare e dai segnali sistemici 1 , 2 . Durante tutta la vita, sono stati segnalati cambiamenti nella funzionalità MuSC, nella nicchia muscolare e nei segnali sistemici, portando al declino delle capacità funzionali negli anziani 3 . Gli MuSC sono posizionati in una nicchia sotto la lamina basale e, dopo lesioni muscolari, vengono attivate per riparare i muscoli danneggiati 4 , 5 . Al fine di garantire una risposta produttiva rigenerativa, è fondamentale che i MuSC coordinino diversi processi necessari per l'uscita dalla quiescenza, l'autoconsapimento e la fase di espansione proliferativaDalla differenziazione myogenica 6 . Negli anziani e nelle malattie croniche muscolari, tutte queste funzioni sono compromesse, portando a alterate funzionalità muscolare 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .

Macroautophagy (qui di seguito chiamata autofagia) sta emergendo come un processo biologico essenziale essenziale per preservare l'omeostasi dei tessuti 14 . Il processo autofagico racchiude meccanismi di traffico, in cui parti di citoplasma, organelli e proteine ​​vengono inglobate in vescicole che alla fine sono degradate attraverso il sentiero lisosomico, promuovendo la rimozione di molecole tossiche e il riciclaggio di macromolomolecole. Ciò fornisce composti ricchi di energia per supportare l'adattamento cellulare e tessuto sotto stress o altre condizioni avverse 15 , 16 . Insieme all'attività di sopravvivenza della cellula, l'autofagia può anche funzionare come induttore di cellule-morte, a seconda del contesto dei tessuti cellulari ( ad es. Normale rispetto al tessuto tumorale) e del tipo di stress 17 , 18 .

Recenti evidenze indicheranno che l'autofagia è necessaria per mantenere la massa muscolare e l'integrità miofibra 19 e 20 ed è stato riportato di essere alterato nelle distrofie muscolari differenti 21 , 22 , 23 , tra cui la distrofia muscolare Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 31 , 32 , 33 , 34 , 35 dopo una perdita di massa muscolare (chiamata sarcopenia) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , e nella sopravvivenza di myofiber 38 .

Un rapporto stretto tra l'autofagia e il potenziale rigenerativo dei muscoli scheletrici è stato anticipato da uno studio del laboratorio di Wagers, che ha dimostrato che una restrizione calorica aumenta la disponibilità e l'attività 39 di MuSC. Questo noÈ stato ulteriormente sostenuto dalla recente osservazione che l'asse Foxo3-Notch attiva il processo autofagico durante l'autocompensamento 40 e la transizione MuSC dalla quiescenza allo stato proliferante 41 . Questi dati sono d'accordo con la progressiva riduzione dell'autofagia basale da giovani a muSC vecchi e geriatriche, in associazione al declino numerico e funzionale delle mucsi durante l'invecchiamento 42 .

In un recente studio abbiamo dimostrato una stretta relazione tra l'autofagia e la rigenerazione muscolare compensativa che distingue le prime fasi della progressione del DMD. Di conseguenza, abbiamo osservato un flusso autofagico ridotto nelle fasi successive della progressione della malattia, quando si compromette la rigenerazione muscolare e si verifica la deposizione di tessuti fibrotici. Intrigante, abbiamo mostrato che, in condizioni di rigenerazione, l'autofagia è attivata in MuSCs e che la modulazione del processo autofagico impatta l'attivazione di MuSC e fuNicità 30 .

Complessivamente, questi dati evidenziano l'urgenza di esplorare il processo autofagico in MuSC durante la rigenerazione muscolare in condizioni normali e patologiche e per tutta la durata della vita. Qui forniamo un protocollo per monitorare il processo autofagico in MuSCs in condizioni di rigenerazione muscolare eseguendo in immunoterapia in situ la catena leggera 1A / 1B-light 3 (LC3), un marker di autophagy 43 e MyoD, un marker di Lineage miogenico, nelle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti. La metodologia riportata consente di monitorare il processo autofagico in uno specifico compartimento cellulare, il MuSC, che svolge un ruolo chiave nell'orchestrare la rigenerazione muscolare.

Protocollo

I topi sono stati allevati e mantenuti secondo le procedure standard degli animali, e tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dall'Assicurazione per la Protezione degli Animali e dal Comitato Etico Comunitario per la Ricerca sugli Animali secondo il Ministero della Salute italiano e hanno rispettato la Guida NIH per la cura e l'uso di Animali da laboratorio.

1. Lesioni muscolari e il blocco in vivo del flusso autofagico

  1. Lesioni muscolari.
    1. Per indurre lesioni muscolari scheletriche acute, iniettare 20 μL di 10 μM cardiotossina (CTX) direttamente nel muscolo anteriore (TA) di sinistra di tibiale anteriore di due mesi di vecchi C57BL / 6J che pesano circa 20 g. Utilizzare un numero uguale di maschi e femmine. Utilizzare l'arto contralaterale non trattato come un controllo.
      NOTA: 10 μM CTX in soluzione di cloruro di sodio 0,9% deve essere filtrato (0,22 μm di filtro PVDF) e conservato a -20 ° C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
    2. Utilizzando un iLa siringa di nsulin con un ago da 30 G, inietta CTX nel mezzo dell'AT. Per indurre una lesione accurata nell'AT, assicurarsi che l'ago della siringa entri vicino al tendine distale, profondo da 5 mm, dal basso verso l'alto del muscolo ( figura 1A ).
  2. Blocco del flusso autofagico in topi non feriti e feriti.
    1. Per valutare il flusso autofagico, 24 h Post-Injury (pi), somministrare 50 mg / kg di clorochina (CLQ) ogni 24 ore per 4 d mediante iniezione intraperitoneale (IP) ( Figura 1B ).
      1. Sciogliere CLQ (10 mg / mL) in PBS 1X e filtrarlo attraverso una membrana da 0,2 μm. Pesare ogni mouse e calcolare la quantità di CLQ da iniettare.
        NOTA: Preparare e utilizzare la soluzione CLQ nello stesso giorno. La riserva CLQ può essere conservata fino a un mese a -20 ° C. Poiché l'autofagia è un processo metabolico, eseguire sempre il trattamento CLQ sempre allo stesso tempo ( cioè al mattino befoOre 10.00).

2. Sezioni del tessuto muscolare

  1. Sacrificare il mouse.
    1. Eutanizzare i topi 5 giorni dopo l'infortunio.
    2. Effettuare l'eutanasia da dislocazione cervicale o da CO 2 (da seguire da dislocazione cervicale per conferma). Poiché il processo di autofagia è legato alle abitudini di dormire / mangiare del mouse, sacrifica sempre i topi contemporaneamente, preferibilmente alla mattina ( vale a dire prima delle 10.00).
  2. Isolamento e inclusione della TA.
    1. Prima della dissezione, spruzzare il mouse con il 70% di etanolo.
    2. Utilizzando forbici, fare una piccola incisione perpendicolare (3 mm di lunghezza) sulla pelle dorsale del mouse al livello dei fianchi. Tagliare la coda ei piedi per semplificare la rimozione della pelle. Tirare la pelle verso la coda e rimuoverla per esporre i muscoli sottostanti; Il muscolo TA è facile da localizzare, come mostrato nella Figura 2A .
    3. Con l'aiuto di due pinze, afferrare i tendini distali.
    4. Tagli i tendini distali; I tendini TA e extensor digitorium longus (EDL) vengono spesso tagliati congiuntamente e successivamente separati (vedi punto 2.2.6).
    5. Usando le pinze, tenere il muscolo TA dal tendine e tirare con attenzione il muscolo verso l'estremità prossimale (vicino al ginocchio, Figura 2B ).
      NOTA: A questo punto i muscoli EDL e TA sono facilmente riconoscibili, l'TA è più grande e superficiale rispetto all'EDL.
    6. Separare l'TA dal muscolo EDL tirando i due tendini distali nelle direzioni opposte ( figura 2C ).
    7. Tagliare il tendine prossimale.
    8. Usando le pinze, rimuovere la fascia sottile che copre il muscolo, senza danneggiare il tessuto.
    9. Rimuovere l'umidità eccessiva nel campione con l'aiuto di un tovagliolo di carta. Assicurarsi che il muscolo non sia né umido né eccessivamente asciutto, poiché l'umidità eccessiva produrrà sigDanni nocivi al muscolo e compromettono la prossima colorazione.
    10. Posizionare il composto ottimale di taglio (OCT) sul fondo di uno stampo e collocare il muscolo in esso, nell'orientamento mostrato nella figura 2D . Aggiungere il 100% isopentane ad un bicchiere fino a raggiungere una profondità di circa 3-4 cm. Mettere il bicchiere in contatto con l'azoto liquido in una scatola di polistirolo.
    11. Non lasciare che l'azoto liquido entri nel bicchiere, in quanto produrrà una schiuma bubbling, che può influenzare l'inclusione e danneggiare le sezioni muscolari.
    12. Osservare l'isopentane e aspettare fino a raggiungere la temperatura corretta (tra -140 ° C e -150 ° C); Alla temperatura appropriata, uno strato bianco solido di isopentano congelato si cristallizzerà sul fondo del bicchiere.
    13. Se l'isopentane interamente blocca il solido, sciogliere e raffreddare a temperatura di congelamento prima di procedere al passo successivo.
    14. Utilizzando pinze prechillate, abbassare delicatamente lo stampoL'isopentano per circa 20-30 s. Posizionare il campione congelato in un contenitore con ghiaccio secco fino a trasferirlo in un congelatore da -80 ° C.
      NOTA: il protocollo può essere sospeso qui.
  3. Criosezioni del tessuto muscolare.
    1. Dopo almeno una notte a -80 ° C, eseguire la criocuzione.
    2. Prendere il coltello criostato e la lastra antirollio dal congelatore -20 ° C e posizionarli sui rispettivi supporti nell'armadio criostato.
    3. Mettere una goccia di OCT sullo stub del campione e posizionarla sul campione congelato, in orientamento verticale NS, come mostrato nella Figura 2D .
    4. Posizionare il tappo del campione sul mandrino.
    5. Senza tirare la piastra anti-roll verso il basso sul coltello, fare alcuni tagli a 40 μm per sbarazzarsi di OCT che non include muscoli. Quando il muscolo diventa visibile, ridurre lo spessore della fetta a 7-8 μm.
    6. Tirare verso il basso la piastra antirumbo fino a che non sia allineataIl bordo del coltello o un poco sopra di esso.
    7. Tagliare le sezioni trasversali 7-8 μm di spessore e montare 3-4 fette per diapositiva istologica.
      NOTA: la temperatura di criostato suggerita è compresa tra -15 ° C e -23 ° C. Le sezioni trasversali dei campioni sono necessarie per la successiva analisi per individuare le cellule staminali muscolari nella posizione di nicchia satellitare.
    8. Per massimizzare l'aderenza della sezione, tenere le diapositive a temperatura ambiente per 10-15 minuti per evitare il loro distacco durante l'incubazione degli anticorpi.
      NOTA: La fase di asciugatura dell'aria potrebbe influenzare l'immunostaining, fornendo risultati ambigui. Le diapositive possono essere immagazzinate per diversi mesi a -80 ° C. Il protocollo può essere interrotto qui.
  4. Controllo dei danni muscolari nelle criose dei muscoli TA mediante la colorazione di Hematoxylin Eosin (H & E).
    1. Per valutare la qualità del muscolo ( cioè l'efficacia del danno, dell'isolamento muscolare e inclusoIone e criose), eseguire una colorazione H & E. Per ogni punto temporale sperimentale, fissare una diapositiva con 4% PFA per 10 minuti. Dopo la fissazione, lavare bene le diapositive in vari cambiamenti di 1x PBS.
      NOTA: Attenzione. PFA è cancerogeno e deve essere manipolato con cura.
    2. Prendete una diapositiva per ogni punto sperimentale e metteteli in un vaso di colorazione.
    3. Riempire il vaso con 9 mg / l di ematoxilina fino a quando le sezioni sono coperte e incubare per 8 min.
    4. Riciclare l'ematossilina.
    5. Lasciare il vaso sotto acqua corrente per 10 minuti per rimuovere l'eccesso di ematossilina.
      NOTA: Assicurarsi di non scorrere l'acqua direttamente sulle sezioni.
    6. Lavare con acqua sterilizzata.
    7. Incubare le sezioni con eosina 0,5% (w / v) in etanolo acidificato al 90% per 1 min.
    8. Riciclare l'eosina.
    9. Lavare due volte con acqua sterile per 3 minuti / lavaggio.
      NOTA: eseguire le seguenti operazioni in un cappuccio chimico.
    10. Lavare le sezioni con il 70% di etanolo.
    11. lavaggioLe sezioni con etanolo al 90%.
    12. Lavare le sezioni con etanolo al 100%.
    13. Incubare le sezioni con 0,879 g / mL o-xilene.
      NOTA: Attenzione. O-xilene è infiammabile e moderatamente tossico. Manipolarlo sotto cappuccio chimico, indossando equipaggiamento protettivo, compresi guanti, un cappotto da laboratorio e una maschera.
    14. Riciclare l'o-xilene.
    15. Mettere le diapositive su un pezzo di carta per asciugare.
    16. Chiudere le diapositive utilizzando un supporto di montaggio a base di xilene a rapido indurimento.
    17. Controllare la qualità delle sezioni con un microscopio ottico a 10x ingrandimento (vedere la figura 3 )
      NOTA: il protocollo può essere sospeso qui.

3. Immunostaining per LC3 e MyoD nelle sezioni muscolari del tessuto muscolare

  1. Fissazione delle sezioni del tessuto muscolare.
    1. Preparare una camera di incubazione bagnando un pezzo di carta e posizionandolo sul fondo di una scatola di plastica chiusa per mantenere unDi umidità all'interno della camera. Separare le sezioni dei tessuti con 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS per 10 min.
      NOTA: viene utilizzato un foglio di carta bagnato per evitare l'essiccazione del campione. Preparare PFA fresco o utilizzare PFA conservato a -20 ° C. Attenzione. PFA è tossico; La polvere deve essere manipolata con cura quando si effettua la soluzione di magazzino. Questa operazione deve essere eseguita in un cappuccio chimico, con equipaggiamento protettivo, compresi guanti, un cappotto di laboratorio e una maschera. Inoltre, quando in soluzione, il PFA deve essere manipolato con attenzione.
    2. Rimuovere il PFA e lavare le sezioni con 1x PBS per 5-7 min; Ripetere questo passaggio 3 volte.
  2. Permeabilizzazione delle sezioni del tessuto muscolare.
    1. Disegnare una barriera idrofobica attorno alle sezioni del tessuto utilizzando una penna opaca.
      NOTA: Questo passaggio definisce la superficie attorno alle sezioni del tessuto e minimizza il volume degli anticorpi descritti nei passaggi 3.4, 3.6, 3.7 e 3.9.
    2. Coprire le sezioni con 200 μl di freddo (-20 ° C)Metanolo e mettere la camera di incubazione orizzontalmente all'interno di un congelatore a -20 ° C per 5 min.
    3. Rimuovere la camera di incubazione dal congelatore, aspirare il metanolo e lavare le sezioni con X PBS per 5-7 minuti a RT; Ripetere questo passaggio 3x.
  3. Blocco
    1. Preparare una soluzione di blocco fresco del 4% di albumina serica bovina (BSA) in PBS 1x.
      NOTA: la soluzione BSA può essere conservata per una settimana a 4 ° C.
    2. Incubare le sezioni con soluzione di blocco per almeno 60 minuti a RT.
    3. Rimuovere la soluzione di blocco.
    4. Preparare 100 μL di miscela anti-Fab diluendo 20 μg / mL anti-Fab in 1x PBS. Incubare le sezioni con un frammento F (ab) di IgM anti-mouse purificato affinità per 1 ora a RT.
  4. Incubazione primaria dell'anticorpo.
    1. Preparare 100 μL di miscela anticorpale primaria per ciascuna diapositiva sciogliendo gli anticorpi LC3 e MyoD nel 4% di BSA in 1x PBS. Utilizzare 5 μg /Ml di anti-LC3 (anticorpo policlonale coniglio) e 10 mg / L di anti-MyoD (anticorpo monoclonale del mouse). Incubare la miscela anticorpale primaria a notte a 4 ° C.
  5. Lavaggi.
    1. Rimuovere il mix di anticorpi primario.
    2. Lavare le sezioni con 1% BSA in 1X PBS per 10 min; Ripetere questo passaggio 3x.
  6. Incubazione secondaria anticorpale.
    1. Preparare 100 μL di miscela anticorpale secondaria per ogni diapositiva. Sciogliere l'anti-coniglio caprino 488 (5 μg / mL) e l'anti-topo di capra 594 (5 μg / mL) in 4% BSA in 1x PBS.
      NOTA: Evitare un'eccessiva esposizione alla luce per evitare lo sbiancamento fluorochrome. Eseguire le seguenti operazioni al buio.
    2. Incubare le sezioni con il miscuglio secondario anticorpale per 45 minuti a RT.
    3. Rimuovere il miscuglio secondario anticorpale e lavare le sezioni con 1x PBS per 5-7 min; Ripetere questo passaggio 3x.
  7. Incubazione primaria dell'anticorpo.
    1. Diluire le laminiN-2 (α-2-chain) anticorpo monoclonale (0,33 μg / mL) in 4% BSA in 1x PBS utilizzando 100 μL di miscela per ogni diapositiva. Incubare le sezioni nel mix di anticorpi primario per 1-2 h a RT.
  8. Lavaggi.
    1. Rimuovere il mix di anticorpi primario.
    2. Lavare le sezioni con 1% BSA in 1X PBS per 10 min; Ripetere questo passaggio 3x.
  9. Incubazione secondaria anticorpale.
    1. Preparare 100 μL di miscela anticorpale secondaria per ogni diapositiva diluendo 647 (5 μg / mL) di capra anti-rat 64% in BSA in 1X PBS. Incubare le sezioni in miscela anticorpale secondaria per 45 minuti a RT.
    2. Rimuovere il miscuglio secondario anticorpale e lavare le sezioni con 1x PBS per 5-7 min; Ripetere questo passaggio 3x.
  10. 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
    1. Aggiungere 200 μL di 300 nM DAPI soluzione in 1x PBS a ciascuna diapositiva. Incubare per 5 minuti a RT. Conservare la soluzione DAPI a 4 ° C nelbuio.
    2. Lavare le sezioni con 1x PBS per 5-7 min; Ripetere questo passaggio 3x.
  11. Montaggio delle sezioni muscolari macchiate.
    1. Rimuovere l'eccesso di soluzione di lavaggio dalle sezioni.
    2. Posizionare 10 μL di glicerolo in 1x PBS (3: 1) sulle sezioni macchiate in mezzo alla diapositiva e aggiungere una copertura, evitando la formazione di bolle d'aria.

4. Acquisizione microscopica confocale

  1. Acquisite le immagini usando un microscopio confocale a quattro laser integrato con un sistema di acquisizione di immagini e software analitico.
    NOTA: MyoD è coniugato con un colorante 594 che è un colorante rosso-fluorescente luminoso, con eccitazione ideale per il laser a 594 nm (eccitazione: 590 nm, emissione: 617 nm). LC3 è coniugato con un colorante 488 che è un colorante verde-fluorescente brillante, con eccitazione idealmente adatta alla linea laser 488 nm (eccitazione: 495 nm, emissione: 519 nm). Laminina è coniugata con un colorante 647 che èUn colorante fluorescente a grana lunga e luminosa, con eccitazione ideali per la linea laser a 647 nm (eccitazione: 650 nm, emissione: 668 nm).
  2. Posizionare le diapositive nel vassoio del microscopio e utilizzare l'ingrandimento 63X per rilevare i segnali nucleari. Attenersi a metodi di rigenerazione centrando i campi della rigenerazione attiva, basandosi sulla morfologia muscolare (vedere la figura 4 ).
    NOTA: Mentre in muscoli imperturbabili, la dimensione del miofibra è praticamente costante ( Figura 4A ), la rigenerazione muscolare mediata da lesioni può essere riconosciuta dalla comparsa di miofibri più piccoli, che sono le fibre appena formate dopo la rigenerazione. Inoltre, il muscolo in rigenerazione attiva è caratterizzato da un ampio infiltrato fatto di macrofagi, precursori fibro-adipogenici e cellule localizzate ai muscoli danneggiati per orchestrare la rigenerazione muscolare ( Figura 4B ).
  3. Valutare la colorazione immunofluorescenza in regenAree focalizzandosi su MuSC che si trovano sotto la lamina basale delle miofibere.
  4. Focus su MuSCs positivi per la colorazione MyoD e posizionati all'interno di miopi contrassegnati dalla colorazione laminina (vedi figura 4B , frecce bianche).
  5. Utilizzare almeno 3 topi / gruppo sperimentale e utilizzare il microscopio per acquisire immagini di ingrandimento 63X di almeno 7 campi per ogni gruppo sperimentale.
  6. Una volta individuate le aree rigenerative, concentrarsi utilizzando la colorazione DAPI e quindi regolare gli altri singoli canali.
    1. Utilizzare le seguenti impostazioni del microscopio: Canale A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, guadagno 791; Canale A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, guadagno 659; Canale A647 Pinhole 1.4 Aerea, guadagno 719.
  7. Dopo aver regolato la messa a fuoco dei singoli canali, procedere per acquisire le immagini con una dimensione di fotogramma di 1.024 x 1.024 e un dimensione di pixel di 12.61 μs.
  8. Conte la percentuale di cellule MyoD positive (controllo per tPosizione corretta sotto la lamina) che sono LC3-negativi e la percentuale di cellule MyoD-positive che visualizzano un segnale LC3.
    NOTA: la percentuale di cellule MyoD-positive che presentano la colorazione LC3 è la lettura di questo protocollo.

Risultati

Questo protocollo descrive un metodo efficace in situ per rilevare l'autofagia in MuSC durante la rigenerazione muscolare.

CTX trattamenti in vivo :

Utilizzare CTX per indurre danni muscolari nei muscoli TA e utilizzare i muscoli non protetti come controlli. Poiché l'autofagia è altamente dinamico, bloccare il flusso autofagico eseguendo ini...

Discussione

Questo protocollo descrive come monitorare l'autofagia nelle cellule staminali muscolari scheletriche durante la rigenerazione muscolare compensatoria. Diversi anticorpi per la co-colorazione di LC3 e MyoD sono stati testati e quelli che lavorano nelle sezioni dei tessuti del mouse e creano risultati efficaci sono elencati qui (vedi tabella dei materiali ). La permeabilizzazione con metanolo (vedere la fase 3.2.2) è altamente raccomandata per una corretta colorazione.

Divulgazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT a LL

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664WT mice
Cardiotoxin 1LatoxanL8102
Millex-VVMerck MilliporeSLVV033RSSyringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Chloroquine diphosphate saltSigma-AldrichC6628Caution:
Harmful if swallowed
BD Micro-Fine + 0.5 mLBD324825
Tissue-Tek O.C.T. compoundSakura Finetek25608-930
Tissue-Tek Cryomold IntermediateSakura Finetek4566
2-MethylbutaneSigma-Aldrich277258
Hematoxylin Solution, Harris ModifiedSigma-AldrichHHS32
Eosin Y solution, alcoholicSigma-AldrichHT110132
o-XyleneSigma-AldrichX1040Caution:
Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148Caution:
Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190-094
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA7030
GlycerolSigma-AldrichG5516
Eukitt - Quick-hardening mounting mediumSigma-Aldrich3989
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-007-003
LC3B AntibodyCell signaling Technology2775
Monoclonal mouse anti-MyoD
(concentrated) clone 5.8A		DAKO - Agilent Pathology SolutionsM3512
Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibodyEnzo Life Sciences4H8-2
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Life technologiesA11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Life technologiesA11005
Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM AntibodyLife technologiesA21248
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306

Riferimenti

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