肌肉干细胞中自噬的原位免疫荧光染色

摘要

活动性自噬与生产性肌肉再生有关，肌肉再生对肌肉干细胞（MuSC）的激活至关重要。在这里，我们提供了原位检测LC3的方案，这是来自对照组和受伤小鼠的肌肉组织切片的MyoD阳性MuSC中的自噬标记。

摘要

越来越多的证据表明自噬是维持组织稳态的重要调节过程。已知自噬涉及骨骼肌发育和再生，并且自噬过程已经在几种肌肉病理学和年龄相关的肌肉疾病中描述。与肌肉修复期间卫星细胞的功能衰竭相关的自噬过程的最近描述的块支持活性自噬与生产性肌肉再生相结合的概念。这些数据揭示了在正常和病理状态（如肌营养不良）的肌肉再生过程中自噬在卫星细胞活化中的关键作用。在这里，我们提供了在肌肉再生条件下监测成年肌肉干细胞（MuSC）隔室中的自噬过程的方案。该协议描述了LC3的原位免疫荧光成像的设置方法，autophagy标记和MyoD，一种肌原性谱系标记，来自对照组和受损小鼠的肌肉组织切片。报告的方法允许监测一个特定细胞室的自噬过程，MuSC隔室在调节肌肉再生中起着核心作用。

引言

骨骼肌再生是成体干细胞（肌肉卫星细胞，MuSCs）与参与再生过程的其他细胞类型之间相互作用的结果。肌肉的体内平衡和功能由肌肉利基和全身线索^1,2所组合的信号保持。在整个一生中，已经报告了MuSC功能，肌肉利基和系统线索的变化，导致老年人的功能能力下降³ 。 MuSCs位于基底层下方的一个利基，并且在肌肉损伤时被激活以修复损伤的肌肉^4,5 。为了确保有效的再生反应，至关重要的是，MuSC协调退出静止，自我更新和增殖扩张阶段所需的不同过程通过肌原性分化⁶ 。在老年人和肌肉慢性疾病中，所有这些功能受到损害，导致肌肉功能变化2,3,6,7,8,9,10,11,12,13。

Macroautophagy（以下称为自噬）正在成为维持组织稳态至关重要的生物过程¹⁴ 。自噬过程包括贩运机制，其中细胞质，细胞器和蛋白质的部分被吞入囊泡，其最终通过溶酶体途径降解，促进有毒分子的去除和大分子的再循环cules。这提供了能量丰富的化合物，以支持在应激或其他不利条件下的细胞和组织适应^15,16 。与其细胞存活活动一起，自噬也可以作为细胞死亡诱导剂，取决于细胞组织背景（ 例如，正常与癌组织）和应激刺激的类型^17,18 。

最近的证据表明，自噬需要维持肌肉质量和肌纤维完整性^{19,20 ，}据报道在不同的肌营养不良^{21,22,23 中}受损，包括Duchenne肌营养不良症（DMD）24,25,26,27 ， ^35,36,37和肌纤维存活³⁸ 。

热带实验室的一项研究预计自噬和骨骼肌再生潜能之间有着密切的关系，这表明热量限制增强了MuSC的可用性和活性。这不行最近观察到Foxo3-Notch轴激活了自我更新期间的自噬过程⁴⁰以及从静止到增殖状态的MuSC转变。这些数据符合青年时期老年人和老年人的基础性自噬的逐渐减少，以及老年期间MuSCs的数值和功能下降⁴² 。

在最近的一篇论文中，我们展示了自噬和补偿性肌肉再生之间的密切关系，区分了DMD进展的早期阶段。因此，当肌肉再生受损和纤维化组织沉积发生时，我们观察到疾病进展后期阶段的自噬通量减少。有趣的是，我们表明，在再生条件下，自噬在MuSCs中被激活，并且调节自噬过程影响MuSC激活和fu功能³⁰

总而言之，这些数据突显了在正常和病理状况下以及整个寿命期间，在肌肉再生过程中探索MuSCs自噬过程的紧迫性。在这里，我们提供了一个协议，通过对微管相关蛋白1A / 1B-轻链3（LC3） 进行原位免疫染色监测肌肉再生条件下的自噬过程，LC3是自噬标志物⁴³ ，MyoD是一种标记肌原纤维谱系，在对照组和受损小鼠的肌肉组织切片中。报告的方法允许监测一个特定细胞室的自噬过程，MuSC在编排肌肉再生中起关键作用。

研究方案

根据标准动物设施程序培育和维持小鼠，所有实验方案均经过动物福利保证和意大利卫生部内部动物研究伦理委员会批准，并遵守"NIH护理和使用指南"实验动物。

肌肉损伤和自噬通量的体内阻滞

1. 肌肉受伤。
   1. 为了诱导急性骨骼肌损伤，将20μL的10μM心脏毒素（CTX）直接注射到体重约为20g的2个月大的C57BL / 6J小鼠的左胫骨前部（TA）肌肉中。使用相等数量的男性和女性。使用不受干扰的对侧肢体作为对照。
      注意:在0.9％氯化钠溶液中的10μMCTX应过滤（0.22μmPVDF过滤器）并储存在-20°C。避免反复冻融循环。
   2. 使用我具有30G针头的nsulin注射器，在TA的中间注射CTX。为了在TA中引起精确的伤害，确保注射器的针进入从肌肉的底部到顶部5mm深的远端肌腱附近（ 图1A ）。
2. 在不受干扰和受伤的小鼠中阻断自噬通量。
   1. 为了评估自噬通量，24小时后损伤（pi）通过腹膜内注射（IP）每24小时给予50mg / kg氯喹（CLQ）4天（ 图1B ）。
      1. 将CLQ（10mg / mL）溶于PBS 1X中并过滤0.2μm膜。称量每只老鼠，计算注射量的CLQ。
         注意:在同一天准备和使用CLQ解决方案。 CLQ库存可在-20°C下储存长达一个月。由于自噬是一种与代谢有关的过程，因此总是在同一时间执行CLQ治疗（ 即早晨befo）10 AM）。

肌肉组织切片

1. 老鼠牺牲
   1. 损伤后5天对小鼠进行安乐死。
   2. 通过颈椎脱位或CO ₂进行安乐死（随后进行颈椎脱位确认）。由于自噬过程与小鼠睡眠/饮食习惯有关，因此始终同时牺牲小鼠，优选在早晨（ 即早上10点之前）。
2. TA隔离和包容。
   1. 解剖前，用70％乙醇喷雾小鼠。
   2. 使用剪刀在臀部水平的小鼠的背部皮肤上做一个小的垂直切口（3毫米长）。切割尾巴和脚部以简化皮肤清除。将皮肤拉向尾部，并将其取出以暴露下面的肌肉; TA肌肉容易定位， 如图2A所示 。
   3. 在两个镊子的帮助下，抓住远端肌腱。
   4. 切远端肌腱; TA和伸肌腱（EDL）肌腱通常被共同剪切并分开（见步骤2.2.6）。
   5. 使用镊子，用肌腱保持TA肌肉，并小心地将肌肉拉近近端（靠近膝盖; 图2B ）。
      注意:此时，EDL和TA肌肉易于识别，TA比EDL更大，更肤浅。
   6. 通过沿相反方向拉拽两根远端肌腱将TA与EDL肌肉分开（ 图2C ）。
   7. 切开近端肌腱。
   8. 使用镊子，去除覆盖肌肉的薄筋膜，而不会损坏组织。
   9. 借助纸巾去除样品中的过多水分。确保肌肉既不潮湿也不会过度干燥，因为过多的水分会产生信号对肌肉造成重大损害，危及下一次染色。
   10. 将最佳切割温度（OCT）化合物放置在模具底部，并将肌肉放入其中，方向如图2D所示。向烧杯中加入100％异戊烷，直至达到约3-4cm的深度。将放置在聚苯乙烯箱中的烧杯与液氮接触。
   11. 不要让液氮进入烧杯，因为它会产生一个泡沫泡沫，这可能会影响夹杂物并损伤肌肉部分。
   12. 观察异戊烷，并等到达到适当的温度（-140°C和-150°C之间）;在适当的温度下，冷却​​的异戊烷的固体白色层将在烧杯的底部结晶。
   13. 如果异戊烷完全冻结固体，熔化并冷却至冷冻温度，然后再进行下一步骤。
   14. 使用预制镊子，精细地将模具降低异戊烷约20-30秒。将冷冻的样品放入带有干冰的容器中，直至转移到-80°C的冷冻箱中。
       注意:协议可以在这里暂停。
3. 肌肉组织冷冻切片。
   1. 在-80°C至少一夜之后，进行冷冻切片。
   2. 将低温恒温刀和防滚板从-20°C冷冻箱中取出，并将它们放在相应的支架上进入低温恒温柜。
   3. 将OCT上的一滴OCT放在样品柱上，并将其放置在垂直NS方向的冷冻样品上， 如图2D所示 。
   4. 将样品桩放在卡盘上。
   5. 不要将抗卷板向下拉在刀上，在40微米处做一些切割，以摆脱不包括肌肉的OCT。当肌肉变得可见时，将切片厚度减小到7-8μm。
   6. 拉下防卷板直到与其对齐刀的边缘或一点点以上。
   7. 切割7-8μm厚的横切面，每个组织学载玻片安装3-4片。
      注意:建议的低温恒温器温度在-15°C和-23°C之间。样本的横截面需要随后的分析来确定卫星位置的肌肉干细胞。
   8. 为了使切片的粘附最大化，将载玻片在室温下保持10-15分钟，以防止其在抗体孵育过程中脱落。
      注意:空气干燥步骤可能会影响免疫染色，提供不明确的结果。幻灯片可以在-80°C下保存几个月。协议可以在这里暂停。
4. 通过进行苏木精曙红（H＆E）染色检查TA肌肉冷冻切片中的肌肉损伤。
   1. 评估肌肉的质量（ 即损伤的有效性，肌肉的分离和包容离子和冷冻切片），进行H＆E染色。对于每个实验时间点，用4％PFA固定一个幻灯片10分钟。固定后，在1x PBS的几个变化中清洗载玻片。
      注意:注意。 PFA是致癌物质，必须小心处理。
   2. 为每个实验点取一张幻灯片，并将其放入染色罐中。
   3. 用9克/升苏木精填充罐，直到切片被覆盖并孵育8分钟。
   4. 回收苏木精。
   5. 将瓶子放在流水下10分钟，以除去过量的苏木精。
      注意:确保不要将水直接流入各部分。
   6. 用无菌水冲洗。
   7. 在酸化的90％乙醇中孵育0.5％（w / v）曙红1分钟。
   8. 回收曙红。
   9. 用无菌水洗涤两次，洗涤3分钟。
      注意:在化学防护罩上执行以下步骤。
   10. 用70％乙醇洗涤切片。
   11. 洗具有90％乙醇的切片。
   12. 用100％乙醇洗涤切片。
   13. 使用0.879 g / mL邻二甲苯孵育切片。
       注意:注意。邻二甲苯是易燃和中等毒性的。在化学防护罩下操作，戴防护装备，包括手套，实验室外套和面罩。
   14. 回收o-二甲苯。
   15. 将幻灯片放在一张纸上干燥。
   16. 使用快速硬化的基于二甲苯的安装介质封闭载玻片。
   17. 以10倍放大倍率在光学显微镜下检查切片的质量（ 见图3 ）
       注意:协议可以在这里暂停。

3.在损伤的肌肉组织切片中LC3和MyoD的免疫染色

1. 肌肉组织切片的固定。
   1. 通过润湿一张纸并将其放置在可关闭的塑料盒的底部以保持较高的温度来准备孵育室室内湿度很大。将组织切片用1％PBS中的4％多聚甲醛（PFA）固定10分钟。
      注意:使用湿纸张以避免样品干燥。准备新鲜的PFA或使用储存在-20°C的PFA。警告。 PFA有毒;制造原料溶液时，必须小心处理粉末。该操作必须在化学防护罩上进行，并带有防护装备，包括手套，实验室外套和面罩。此外，在解决方案时，应仔细操作PFA。
   2. 取出PFA，用1x PBS洗涤5〜7分钟;重复这一步3次。
2. 肌肉组织切片的渗透。
   1. 使用pap笔在组织切片周围绘制疏水屏障。
      注意:此步骤定义了组织切片周围的表面，并使步骤3.4,3.6,3.7和3.9中描述的抗体体积最小化。
   2. 用200μL冷（-20°C）覆盖切片，甲醇，并将孵育室水平置于-20℃的冷冻箱中5分钟。
   3. 从冷冻箱中取出孵育室，抽出甲醇，并在室温下用1X PBS洗涤切片5-7分钟;重复此步骤3x。
3. 闭塞
   1. 准备4％牛血清白蛋白（BSA）在PBS 1X中的新鲜块溶液。
      注意:BSA溶液可以在4℃下储存1周。
   2. 在室温下用块溶液孵育至少60分钟。
   3. 移除阻塞解决方案。
   4. 通过稀释1×PBS中的20μg/ mL抗Fab制备100μL抗Fab混合物。使用非偶联亲和纯化的抗小鼠IgG的F（ab）片段在室温孵育切片1小时。
4. 初级抗体孵育。
   1. 通过将LC3和MyoD抗体溶解在1％PBS中的4％BSA中，为每个载玻片制备100μL的一抗混合物。使用5μg/mL抗LC3（兔多克隆抗体）和10mg / L抗MyoD（小鼠单克隆抗体）。在4℃孵育一次抗体混合物过夜。
5. 洗。
   1. 取出一级抗体混合物。
   2. 在1X PBS中用1％BSA洗涤切片10分钟;重复此步骤3x。
6. 二次抗体孵育。
   1. 为每个载玻片准备100μL的二抗混合物。在1％PBS中的4％BSA中溶解山羊抗兔488（5μg/ mL）和山羊抗小鼠594（5μg/ mL）。
      注意:避免过度的光照，以防止荧光染色。在黑暗中执行以下步骤。
   2. 在室温下使用二级抗体混合物孵育切片45分钟。
   3. 取出第二抗体混合物，用1x PBS洗涤切片5-7分钟;重复此步骤3x。
7. 初级抗体孵育。
   1. 稀释层压板在1％PBS中的4％BSA中的n-2（α-2-链）单克隆抗体（0.33μg/ mL），每个载玻片使用100μL混合物。在一次抗体混合物中孵育1-2小时。
8. 洗。
   1. 取出一级抗体混合物。
   2. 在1X PBS中用1％BSA洗涤切片10分钟;重复此步骤3x。
9. 二次抗体孵育。
   1. 通过在1％PBS中的4％BSA中稀释山羊抗大鼠647（5μg/ mL），为每个载玻片制备100μL的二抗混合物。在二级抗体混合物中孵育45分钟。
   2. 取出第二抗体混合物，用1x PBS洗涤切片5-7分钟;重复此步骤3x。
10. 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育。
    1. 在每个载玻片中加入200μL300 nM DAPI溶液，在1×PBS中。在室温下孵育5分钟。将DAPI溶液储存在4℃黑暗。
    2. 用1x PBS洗涤切片5-7分钟;重复此步骤3x。
11. 安装染色肌肉部分。
    1. 从部分去除多余的洗涤溶液。
    2. 将10μL甘油在1×PBS（3:1）中放置在载玻片中间的染色部分，并加入盖玻片，避免形成气泡。

共聚焦显微镜获取

1. 使用与图像采集系统和分析软件集成的四激光共焦显微镜获取图像。
   注意:MyoD与594染料（一种亮红色荧光染料）共轭，其激发理想地适用于594nm激光（激发:590nm，发射:617nm）。 LC3与488染料（其是亮绿色荧光染料）共轭，理想地适用于488nm激光线（激发:495nm，发射:519nm）。层粘连蛋白与647染料缀合一种明亮的远红荧光染料，具有理想适用于647nm激光线（激发:650nm，发射:668nm）的激发。
2. 将幻灯片放置在显微镜托盘中并使用放大倍数63倍以检测核信号。通过使活动再生的领域居中，依靠肌肉形态，手动聚焦在再生区域（参见图4 ）。
   注意:在无刺激的肌肉中，肌纤维的大小几乎是恒定的（ 图4A ），损伤介导的肌肉再生可以通过更新的肌纤维的外观来识别，这是再生后新形成的纤维。此外，主动再生中的肌肉的特征在于由巨噬细胞，纤维成脂前体以及定位于受损肌肉以编排肌肉再生的细胞形成的广泛浸润（ 图4B ）。
3. 评估再生中的免疫荧光染色重点是位于肌纤维基底层下的MuSCs。
4. 专注于对MyoD染色阳性的MuSCs，并位于由层粘连蛋白染色标记的肌纤维内（参见图4B ，白色箭头）。
5. 使用至少3只小鼠/实验组，并使用显微镜获得每个实验组至少7个场的63倍放大图像。
6. 一旦识别再生区域，使用DAPI染色进行聚焦，然后调整其他单个通道。
   1. 使用以下显微镜设置:通道A594针孔1.2通风单元，增益791;通道A488针孔1.6通风单位，增益659;通道A647针孔1.4通风单位，增益719。
7. 调整单个通道的焦点后，继续采集1,024 x 1,024帧大小和12.61μs像素停留的图像。
8. 计算MyoD阳性细胞的百分比（对照t他正确地位于层下）LC3阴性和显示LC3信号的MyoD阳性细胞的百分比。
   注意:显示LC3染色的MyoD阳性细胞的百分比是该方案的读数。

结果

该方案描述了在肌肉再生过程中检测MuSCs中的自噬的有效的原位方法。

CTX 体内治疗:

使用CTX诱导TA肌肉的肌肉损伤，并使用不受干扰的肌肉作为对照。由于自噬是高度动态的，通过执行CLQ的IP注射来阻断自噬通量（ 图1 ）。 CLQ治疗对于评估自噬通?...

讨论

该协议描述了如何在代偿性肌肉再生期间监测骨骼肌干细胞中的自噬。尝试了几种用于LC3和MyoD共染色的抗体，在这里列出了在小鼠组织切片中工作并产生成功结果的抗体 （参见材料表 ）。强烈推荐使用甲醇渗透（见步骤3.2.2）以进行成功染色。

该方案的局限性与小鼠的内在变异性相关，强迫使用至少3只小鼠/实验组。该方法反映了在骨骼肌再生...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	WT mice
Cardiotoxin 1	Latoxan	L8102
Millex-VV	Merck Millipore	SLVV033RS	Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Chloroquine diphosphate salt	Sigma-Aldrich	C6628	Caution: Harmful if swallowed
BD Micro-Fine + 0.5 mL	BD	324825
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura Finetek	25608-930
Tissue-Tek Cryomold Intermediate	Sakura Finetek	4566
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	277258
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma-Aldrich	HHS32
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110132
o-Xylene	Sigma-Aldrich	X1040	Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Eukitt - Quick-hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	3989
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-007-003
LC3B Antibody	Cell signaling Technology	2775
Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A	DAKO - Agilent Pathology Solutions	M3512
Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody	Enzo Life Sciences	4H8-2
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Life technologies	A11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Life technologies	A11005
Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody	Life technologies	A21248
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306