JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تحقيقات محددة الهدف تمثل أداة مبتكرة لتحليل الآليات الجزيئية، مثل تعبير البروتين في أنواع مختلفة من الأمراض (مثل التهاب وعدوى توموريجينيسيس). في هذه الدراسة، يصف لنا إجراء تقييم كمي تمجربهك ثلاثي الأبعاد لتسلل بلعم المعوية في نموذج مورين من التهاب القولون باستخدام التصوير المقطعي الأسفار بوساطة خاصة-F4/80.

Abstract

نماذج مورين من المرض لا غنى عنها للبحث العلمي. ومع ذلك، لا تستخدم العديد من الأدوات التشخيصية مثل التنظير أو تصوير تمجربهك بشكل روتيني في نماذج حيوانية. قراءات التجريبية التقليدية غالباً ما يعتمدون على التحليلات بعد الوفاة و السابقين فيفو ، الذي منع فحوص المتابعة داخل الفرد وزيادة عدد الحيوانات الدراسة المطلوبة. الأسفار بوساطة التصوير المقطعي يمكن التقييم غير الغازية، المتكررة، والكمية، وثلاثي الأبعاد من المسابر الفلورسنت. وهي حساسة للغاية ويسمح باستخدام صانعي الجزيئية، مما يسمح بكشف محددة ووصف أهداف جزيئية متميزة. على وجه الخصوص، والمسابير المستهدفة تمثل أداة مبتكرة لتحليل التعبير الجيني التنشيط والبروتين في التهاب، أمراض المناعة الذاتية، والعدوى، وأمراض الأوعية الدموية، الهجرة الخلية، توموريجينيسيس، إلخ. في هذه المقالة، نقدم إرشادات خطوة بخطوة على هذا تكنولوجيا التصوير المتطورة للكشف في فيفو وتوصيف لالتهاب (أي تسلل بلعم F4/80-إيجابي) في نموذج مورين مستخدمة على نطاق واسع من التهاب الأمعاء. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية في مجالات البحث الأخرى، مثل تتبع الخلية أو الخلايا الجذعية محصنة.

Introduction

نماذج حيوانية تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية، ووجود العديد من الإجراءات غير الغازية لرصد المرض النشاط والحيوية، مثل التحديد الكمي لتغيرات وزن الجسم أو تحليل الدم والبول والبراز. ومع ذلك، هذه هي فقط المعلمات البديلات غير المباشرة التي تخضع أيضا للتباين بين الأفراد. أنهم كثيرا ما يجب أن تكملها بعد الوفاة من تحاليل لعينات الأنسجة، مما يمنع المسلسل من المراقبة في نقاط زمنية متكررة ومباشرة عمليات المراقبة الفسيولوجية أو المرضية في فيفو. ظهرت تقنيات التصوير المتطورة في الحيوانات الصغيرة، بما في ذلك عبر التصوير المقطعية والتصوير الضوئي، والتنظير، التي تمكن من التصور مباشرة لهذه العمليات ويسمح أيضا لإجراء تحاليل متكررة ل الحيوانات نفس1 , 2 , 3. بالإضافة إلى ذلك، إمكانية رصد متكررة الولايات المختلفة للمرض في الحيوان نفسه قد يخفض عدد الحيوانات اللازمة، والتي قد يكون من المستصوب من وجهة نظر أخلاق حيوانية.

توجد عدة تقنيات التصوير الضوئي مختلفة للتصوير في فيفو الأسفار. في الأصل، كان يعمل تصوير [كنفوكل] لدراسة الأحداث الفلورسنت السطحية والجوفية4،5. ، ومع ذلك، تمجربهك الأنظمة التي تسمح لتقييمات كمية الأنسجة ثلاثية الأبعاد في الآونة الأخيرة نمواً6. وقد تحقق من خلال وضع المسابر الفلورسنت التي ينبعث منها الضوء في الطيف (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء، تقدم الاستيعاب منخفضة وأجهزة حساسة للكشف عن مصادر الضوء أحادي اللون7. بينما تقنيات التصوير كروسسيكتيونينج التقليدية، مثل التصوير المقطعي (CT) أو التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)، أو الموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة)، يعتمد معظمها على البارامترات الفيزيائية وتصور مورفولوجيا، يمكن توفير تصوير بصري معلومات إضافية على العمليات الجزيئية الكامنة وراء استخدام الفلورية داخلية أو خارجية يسبر8.

التقدم في علم الأحياء الجزيئي ساعدت على تسهيل توليد المسابر الجزيئية الفلورسنت ذكية وهادفة لعدد متزايد من الأهداف. على سبيل المثال، بوساطة مستقبلات الامتصاص والتوزيع في منطقة مستهدفة معينة يمكن تصور استخدام الأجسام المضادة المسمى مشتق كاربوسيانيني9. الوفرة من الأجسام المضادة المتاحة، التي يمكن أن يكون المسمى لتؤدي وظيفة معينة تتبع في مناطق لا يمكن الوصول إليها إلا من الجسم، ويقدم أفكاراً لم يسبق له مثيل في العمليات الجزيئية والخلوية في نماذج توموريجينيسيس والأعصاب، 7من أمراض القلب والأوعية الدموية والمناعية والالتهابات.

في هذه الدراسة، يصف لنا استخدام التصوير المقطعي بوساطة fluorescence في نموذج مورين من التهاب القولون. كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS)-التهاب القولون المحرض هو نموذج مستحث كيميائيا ماوس قياسية لالتهاب الأمعاء يشبه التهاب الأمعاء المرض (بنك التنمية بين الأمريكتين)10. أنها مفيدة بشكل خاص لتقييم مساهمة نظام المناعة الفطرية لتطوير التهاب الأمعاء11. منذ تعيين والتنشيط، وتسلل وحيدات والضامة تمثل خطوات حاسمة في الآلية المرضية لبنك التنمية بين الأمريكتين، التصور لتجنيدهم والحركية من تسلل ضرورية للرصد، على سبيل المثال، أثر المواد العلاجية المحتملة في إعداد السريري12. ونحن تصف تنظيم دورات تعريفية لالتهاب القولون DSS وإثبات وصف التصوير المقطعي بوساطة بلعم تسلل إلى الغشاء المخاطي للقناة الهضمية استخدام التصوير المقطعي fluorescence الجزيئية لتصور محدد لعلامة الوحيدات/بلعم F4/80 13-وبالإضافة إلى ذلك، نحن لتوضيح الإجراءات الإضافية والتكميلية، مثل وضع العلامات جسم؛ الإعداد التجريبية؛ وتحليل وتفسير الصور التي تم الحصول عليها، وفي ترابط مع قراءات التقليدية مثل مؤشرات نشاط المرض، التدفق الخلوي والتحليل النسيجي، وإيمونوهيستوتشيميستري. نحن مناقشة القيود المفروضة على هذا الأسلوب ومقارنات بطرائق أخرى للتصوير.

Protocol

ووافق جميع التجارب على الحيوانات für لانديسامت Natur، أومويلت und فيربراوتشيرشوتز (لانوف) نوردراين-فيستفالن وفقا "قانون حماية الحيوانات الألمانية" (تيرشوتزجيسيتز).

1-المواد والإعداد التجريبية

  1. رعاية الحيوان.
    1. استخدام الفئران مطابقة الجنس والسن من أي سلالة DSS عرضه (مثلاً، C57BL/6) في وزن الجسم ز 20-25.
    2. خطة الفئران على الأقل خمسة أو أكثر من كل مجموعة تجريبية وبيت الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية للرعاية الحيوانية المحلية.
    3. تقدم تشو القوارض قياسية النظام الغذائي ومياه الشرب يعقم libitum الإعلانية.
    4. إزالة تشاو القياسية واستبدله تشاو خالية من البرسيم قبل ثلاثة أيام على الأقل من قبل المسح الضوئي للحد من اندولومينال السيارات-الأسفار.
  2. التعريفي لالتهاب القولون الحاد الناجم عن مفاجآت.
    1. حل ز 2 من مفاجآت صيف دبي (الوزن الجزيئي ~ 40,000 دا) في 100 مل يعقم مياه الشرب للحصول على نسبة 2% (w/v الحل).
    2. تعبئة إمدادات مياه الشرب للفئران حصرا بحل إدارة السلامة والأمن وتقدير 5 مل سائل كل الماوس لليوم الواحد. توفير مياه الشرب نفسه دون مفاجآت ل الفئران التحكم10.
      ملاحظة: رصد الفئران يوميا حتى نهاية التجربة. Euthanize الفئران التي تفقد أكثر من 20% وزن الجسم الأولية أو التي أصبحت تحتضر (أي، إصرار متحدب الموقف، وانخفاض حركة، احتملت التنفس، نصب ملحوظ معطف) وفقا للمبادئ التوجيهية المطبقة المحلية على الحيوان الرعاية.
  3. إعداد الأسفار بوساطة التصوير المقطعي.
    1. تسمية جسم المطلوب (مثل الفئران المضادة الماوس F4/80) مع صبغ الفلورية (مثلاً، Cyanine7، λالإثارة: 750 nm, λالانبعاثات: 776 nm) كما هو موضح في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. دياليزي جسم المنقاة في غشاء الديال مناسبة (حجم المسام < كاتشين 50-100) ضد 1 لتر كلوريد الصوديوم 0.15 متر على الأقل 2 ح أو بين عشية وضحاها.
      1. نقل الجسم إلى 1 لتر من 0.1 م ناكو3 ودياليزي على الأقل ح 2.
      2. يحل المبلغ المطلوب من صبغة الفلورسنت في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) (10.8 ميليلتر/مغ من الأجسام المضادة) وإضافتها إلى الحل الأجسام المضادة. استخدام صبغة الفلورسنت في برنامج الزائدة المولى لتحقيق نسبة الصبغة للبروتين من 1:3.
      3. احتضان في الظلام عند 4 درجة مئوية حاء 1 إزالة الأجسام المضادة غير مسمى بالغسيل الكلوي ضد 1 ل م 0.15 الصوديوم أو باستخدام عمود desalting PD-10 وحل في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) للتطبيق في فيفو .
      4. تحديد تركيز الأجسام المضادة النهائية ونسبة وضع العلامات التي كانت.
      5. قياس تركيز البروتين في استيعاب 250-330 نانومتر والنظر في امتصاص إضافية بواسطة الصبغة. تصحيح امتصاص الحد الأقصى في 280 نانومتر (البروتين) بنسبة 11% لاستيعاب الحد الأقصى في 750 نانومتر (الخطوة التالية) لوصف Cyanine7.
      6. قياس إضعاف المجمع (عادة 01:10) في 250-800 نانومتر واستخراج تركيز Cyanine7 في 750 نانومتر.
      7. تحديد نسبة الصبغة للبروتين ك: صبغ/جسم = استيعاب الحد الأقصى في 750 nm/200,000/(استيعاب الحد الأقصى في 280 nm-0.11 × امتصاص ماكس في 750 nm)/170,000.
      8. يبقى الحل جسم عند 4 درجة مئوية وأبعادها عن الضوء لتجنب تبيض قبل الحقن.
    2. تحميل حجم الحل الأجسام المضادة اللازمة في المحاقن معقمة مباشرة قبل الحقن ودرع من الضوء حتى يتم استخدامه.
    3. تحديد التوقيت الأمثل لحقن التحقيق وإجراءات المسح، اعتماداً على الراسم الدوائية.
    4. تخدير الفئران استخدام isoflurane 1.5-2.5% استنشاق الأوكسجين أو وضعها بشكل أمن في ريسترينير مخصصة لحقن الوريد الذيل من الأجسام المضادة المسماة.
    5. لأجسام كاملة الطول، حقن ح جسم المسمى مالا يقل عن 24 قبل المسح، مثل الماوس المضادة F4/80 بلعم التصور في القولون مورين. حقن الفئران عن طريق الوريد (رابعا) عن طريق الذيل الوريد مع الأجسام المضادة المسماة بمبلغ مماثل نمول 2.0 لصبغ.
    6. استخدام نفس القدر المسمى الأجسام المضادة غير محدد (مثل الفئران مفتش أو آخر ايستب المقابلة لتراث جسم الابتدائي) كعنصر تحكم ايستب في جرعات مساوية لتلك التحقيقات الخاصة.
      ملاحظة: تفحص النتائج في فيفو بعد الحقن في عنصر التحكم المجمع يمكن أن تخدم كمرجع لتفسير المسبار محددة تصوير البيانات.
    7. استخدام حلاقة الكهربائية حلق فرو الحيوانات في منطقة البطن للتقليل من انعكاس الضوء والاستيعاب.

2-المعدات

  1. استخدام جهاز التصوير المقطعي بيطرية بوساطة الفلورية (FMT) للأسفار الحيوانات الصغيرة ( الشكل 4).
  2. إنشاء إجراء دراسة جديدة لكل مشروع عن طريق النقر فوق "دراسة جديدة" زر، وتشمل في وصف الدراسة تتبع ذات الصلة، بما في ذلك تصوير المعلمات وجرعات للرجوع إليها في المستقبل.
  3. ضمن هذه الدراسة، إنشاء مجموعات الدراسة وفقا لتصميم الدراسة الخاصة بكل منها (مثلاً، للتتبع محددة ومراقبة ايستب غير محدد) بواسطة النقر فوق "فريق الدراسة الجديدة" الزر. تجهيز كل فريق الدراسة بعدد كل من الحيوانات.
  4. معايرة نظام بنيات الراسم.
    1. إجراء المعايرة لكل دفعة من تتبع لتطبيع للتباين في وضع العلامات والتمكين من قياس كمية من البيانات منظمة أوكسفام الدولية.
    2. اتبع إرشادات الشركة المصنعة أداة لمعايرة كل نظام الفردية؛ عند اختيار "إضافة جديدة التتبع"، سيوفر هذا النظام دليل من خلال الخطوات. توفير تمييع الحل جسم التطبيقية وتركيز المطلق المحسوبة للتتبع في التحقيق.
    3. لإنتاج المواد الانشطارية، استخدام الوهمية محاكاة الأنسجة لمعرفة خصائص سمك والاستيعاب (تشبه الأنسجة الحيوية) وملئه بحجم معين من الحل جسم المستخدم. هذا التدبير على الجهاز معاهدة المواد الانشطارية.
      ملاحظة: النظام سيستخدم قياس مرجعية التحقيق المقدمة، إلى جانب تركيز معين، لحساب تركيزات الراسم المطلقة من المستقبل في فيفو القياسات.
  5. استخدام شريط فحص هياتابل مع درجة حرارة 42 درجة مئوية.
    ملاحظة: وهذا ما يمنع الفئران من أن يصبح باردا أثناء الفحص.

3-الحيوان التخدير

  1. استخدام دفق مستمر من 1.5-2% المجلد % إيسوفلوراني ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) و 1.5 L O2دور/دقيقة تخدير الفئران.
استخدام أنظمة استنشاق المصممة خصيصا للقوارض التخدير (isoflurane المبخر) بسهولة التحكم في عمق التخدير والتقليل من التعرض للموظفين.
  • ضع الماوس في قاعة تعريفية مانعة للتسرب وقم بتشغيل المرذاذ لتوريد إيسوفلوراني (100% (v/v)، المجلد 5% في الأوكسجين، 3 لتر في الدقيقة). رصد الماوس حتى وراقد وفاقد الوعي.
  • وضعه في كاسيت الفحص للتصوير المقطعي، مع استنشاق isoflurane المستمر عبر مخروط الآنف بجرعة 100% v/v، 1.5% المجلد في الأوكسجين، 1.5 لتر في الدقيقة لتقليل حركة المصنوعات اليدوية أثناء الفحص. إجراءات تدوم فترة أطول من مدة 5 دقائق، لتطبيق مرهم العين لعيون الماوس لمنع تلف القرنية.
  • تقييم عمق التخدير عن طريق التحقق من ردود الفعل. وضع الماوس على ظهرها؛ إذا كان التخدير كافية، يجب عدم تشغيل الماوس. قرصه الماوس بهدوء بين أصابع لها؛ إذا كان التخدير كافية، لن تكون الساق سحب (مرحلة التسامح الجراحية).

    • 4-الأسفار بوساطة التصوير المقطعي المسح الضوئي

    ملاحظة: التكيف مع التفاصيل التالية، وخاصة بنظام معاهدة المواد الانشطارية المستخدمة في هذه الدراسة (انظر الجدول للمواد) لأجهزة التصوير الانعكاس fluorescence بديلة أو نظم معاهدة المواد الانشطارية، حسب الحاجة.

    1. ضع الماوس أنيسثيتيزيد على ظهرها في كاسيت الفحص.
    2. إجراء المسح الضوئي.
      1. إدراج الكاسيت في نظام التصوير وإغلاقه فورا لضمان استمرار التخدير. حدد عينة مناسبة من فريق الدراسة التي تم إنشاؤها مسبقاً. حدد التتبع التي تدار من القائمة المنسدلة التأكد من أنه يتم حساب قيم تركيز التتبع بشكل صحيح.
      2. الحصول على صورة الانعكاس fluorescence في الطول الموجي المناسب (720 نانومتر ل Cyanine7) لمسح التخطيط ومخطط الحقل المسح الضوئي عن طريق النقر فوق الزر "الحصول على الصورة".
      3. نرى أن يظهر الحقل المسح الضوئي كتراكب في صورة الانعكاس الأسفار. ضبطه في المنطقة لمصلحة (مثل القولون أو البطن)، تجنب الهواء أو مجالات الفراء المتبقية. اعتماداً على الصورة المستهدفة، تعيين عدد الصورة نقاط البيانات في مجال المسح الضوئي باختيار من الخشنة قرار المسح الميداني المتوسطة وغرامة في القائمة على اليمين.
        ملاحظة: الاحتفاظ في الاعتبار أن حقل مسح غرامة قد توفر أفضل المكانية القرار على حساب وقت مسح لم يعد إلى حد كبير.
      4. بدء الحصول على البيانات/الصور في الطول الموجي المحدد بواسطة النقر فوق "مسح".
        ملاحظة: سيتم وقت المسح الضوئي لمسح المتوسطة-غرامة من البطن كله حوالي 5 دقيقة؛ في هذا الوقت، كل نقطة بيانات مضاءة بشكل منفصل بالليزر الإثارة، وتسجل الأسفار الناتجة عن ذلك.
      5. إزالة الحيوان من الكاسيت التصوير في نهاية المسح الضوئي والسماح للحيوان للتعافي تماما قبل وضعه مرة أخرى إلى القفص.
      6. كرر معاهدة المواد الانشطارية إذا اقتضت الضرورة في نقاط زمنية مختلفة خلال التجربة (مثلاً، أيام 0، 5، و 9-10 (نهاية التجربة))، ولكن النظر في تراكم الأجسام المضادة في الجسم، وبالتالي زيادة إشارة fluorescence الخلفية.

    5-بعد انتهاء المسح الضوئي

    1. ضع الماوس في قفص منفصل على منشفة ورقية تحت مصباح الضوء الأحمر الاحترار ورصد الماوس لعلامات عدم الراحة أو الشدة حتى الشفاء التام. ضع الماوس مرة أخرى إلى قفصة كل منهما عند مستيقظا تماما.
    2. Euthanize الفئران في نهاية التجربة بتسليم CO2 إلى المعزل بجرعة 100% (v/v) و 100 المجلد %، و 3 لتر في الدقيقة. لا قبل ملء الدائرة مع شركة2، كما قد تسبب تعرض مفاجئ لتركيزات عالية من أول أكسيد الكربون2 الشدة. التحقق من الوفاة بعد توقف الماوس التنفس واسطة ثانوية لاحقة من القتل الرحيم مثل التفكك السريع عنق الرحم.
    3. Explant القولون بفتح البطن البطن وإجراء فحص السابقين فيفو القولون اكسبلانتيد، كما هو موضح في الخطوات 4.2.1-4-2-4. فتح كل القولون طوليا باستخدام مقص جراحي ميتزينبوم وشطف جيدا بالمحلول الملحي قبل إعدادها لمزيد من التحليل.
    4. استخدام مشرط لقطع جزء من 0.5 سم من القولون القاصي ثم ضعه مباشرة في أنبوب 1.5 مل مبردة. تجميد في النتروجين السائل ومخزن في-70 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى (مثلاً،القياسات ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات)).
    5. استخدام عصا خشبية والإظهار المتبقية طوليا فتح نقطتين من القاصي إلى نهاية الدانية، مع الخارج الغشاء المخاطي ("تقنية رول السويسرية")، لإجراء تحاليل نسيجية. مكان الإعداد في مثبت (انظر الجدول للمواد)، وتجميد في-80 درجة مئوية14.

    6-الإعمار البيانات وتفسيرها

    1. استخدم أداة إعادة الإعمار من برامج التصوير الخاصة بكل منها لإنشاء خرائط ثلاثية الأبعاد لتوزيع الأسفار من البيانات الخام التصوير؛ يتم تحديد مسح يتم إضافتها تلقائياً إلى أداة إعادة الإعمار، عند بناء على المسح، الوظيفة "إضافة إلى قائمة انتظار إعادة الإعمار".
      1. خلاف ذلك، حدد التفحص من القائمة المنسدلة تحت الدراسة الخاصة بكل منها ودراسة مجموعة، انقر بالزر الأيمن المسح الضوئي، وحدد "إضافة إلى إعادة الإعمار".
    2. لمزيد من التحليل، تحميل مجموعة البيانات إلى برمجيات التحليل. من القائمة المنسدلة في الشريط العلوي، حدد الدراسة الخاصة بكل منها وحدد فريق الدراسة والحيوان الفردية من القائمة على اليمين؛ سيظهر كل مسح أجرى لهذا الحيوان. حدد التفحص الصحيح ثم انقر فوق "تحميل".
      ملاحظة: سوف تظهر إعادة توزيع الراسم 3D على اليسار كتراكب الصورة الانعكاس fluorescence المكتسبة في البداية. يمكن استدارة الطراز وتضخيم لتحليل أسهل.
    3. تحديد بؤر تراكم التسمية غير محدد (مثلاً المثانة الكبد أو البول) في مخططات ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها وتمييزها عن الأنسجة المستهدفة (مثل الأمعاء أو الأمعاء).
    4. من الشريط العلوي، قم بتحديد الشكل عائد الاستثمار الأكثر ملاءمة لهذا الهدف. التسمية الأنسجة المستهدفة كمناطق للفائدة (ROI) بوضع أدوات القياس الخاصة بكل منها في تحليل البرمجيات؛ سيوفر البرنامج شدة الأسفار للعائد على الاستثمار، فضلا عن (بيكو-) المبالغ المولى للتتبع التي قد تم معايرة الفحص ل.
    5. تحديد المبلغ الإجمالي للتتبع في العائد على الاستثمار المناسبة، تطبيع لحجم العائد على الاستثمار، بما يعادل الأكثر مناسبة لتقييم نشاط المرض في ترابط مع ارتشاح التهابي (علم الأنسجة).
      ملاحظة: يمكن اختيار الميزات الأخرى من العائد على الاستثمار إذا كان ذلك مناسباً كممثل لنموذج معين.

    7.السابقين فيفو تحليلات

    1. الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ وتلطيخ الفلورة.
      1. ديبارافينيزي المقاطع بوضعها في الإيثانول 70% (EtOH) لمدة 2 دقيقة؛ شطف مع الماء المقطر بعد ذلك. وصمة عار مع الحل توضع لمدة 5 دقائق وبعد ذلك الشطف بماء الصنبور الحار لمدة 10 دقائق.
      2. شطف مع الماء المقطر، كونتيرستين مع الحل ثم لمدة 2 دقيقة، ويشطف مرة أخرى بالماء المقطر.
      3. مكان في 70% EtOH، 96% EtOH 99% EtOH وزيلين نفط (2 مرات) لكل يذوي ومسح المقاطع 2 دقيقة. جبل مع تصاعد راتنجية المتوسطة.
    2. تلوين الفلورة.
      1. استخدام مقاطع الأنسجة التي تم الحصول عليها سابقا ("رول السويسرية") لتلطيخ الفلورة وإعداد أقسام قطع البرد من 7 ميكرومتر.
      2. كتلة أقسام القولون ثابتة الأسيتون والمجمدة في مصل الجرذان 5.0 في المائة لمدة 10 دقائق، واحتضان بين عشية وضحاها مع (1/500 v/v) المخفف بيوتينيلاتيد الفئران الابتدائي الماوس المضادة F4/80 جسم. تغسل الأجزاء ثلاث مرات في تريس مخزنة المالحة (تبس) واحتضان مع ستريبتافيدين-فيتك (1: 100 v/v) في برنامج تلفزيوني/جيش صرب البوسنة (0.1% w/v) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      3. أغسل المقاطع في تبس ووصمة عار مع 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، 1: 1000 v/v) لتحقيق التباين. تحليل الصور الأسفار تحت مجهر [كنفوكل] (انظر الجدول للمواد؛ 40 x التكبير؛ تصفية مكعب N2.1 مع تصفية الإثارة 515-560) وحساب الخلايا F4/80-الإيجابية في كل حقل عالية الطاقة.
        ملاحظة: حاول استخدام الأجسام المضادة لاستنساخ نفسه وتنسيق عند الجمع في فيفو معاهدة المواد الانشطارية و بعد الوفاة علم الأنسجة التحليلات مثل إيمونوهيستوتشيميستري أو تلطيخ الفلورة، تبعاً للهدف المقصود. واستخدمت للكشف عن F4/80-إيجابية الضامة في فيفو و السابقين فيفو، بأشكال مختلفة.
    3. الخطة الرئيسية للعمليات القياسات في عينات القولون.
      1. استخدام الحصول عليها طازجة، برنامج تلفزيوني تشطف العينات القولون أو العينة المذابة للقياسات الخطة الرئيسية للعمليات. وزن جميع العينات ومجانسة الأنسجة في تحلل المخزن المؤقت المنصوص عليه في ELISA كيت (انظر الجدول للمواد) في وحدة تخزين من 20 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل كل مغ أنسجة.
      2. Sonicate لمدة 15 ق (التردد سونيكيشن: 20 كيلوهرتز، السلطة: 70 ث) والطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 200 × ز و 4 درجة مئوية.
      3. استخدام طقم أليسا متاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد) وفقا لوصف السلع المصنعة. القيام بالاختبار في التكرارات.

    النتائج

    تقييم التهاب القولون:

    التهاب القولون المستحثة بمفاجآت صيف دبي هو نموذج موريني مستحث كيميائيا من التهاب الأمعاء الذي يشبه الإنسان بنك التنمية بين الأمريكتين ويؤدي إلى فقدان الوزن ونزيف المستقيم وتقرح سطحي وتلف الأغشية المخاطية...

    Discussion

    على الرغم من أن تقنيات التصوير الطبية قد تطورت بسرعة في السنوات الأخيرة، ونحن لا تزال محدودة في قدرتنا على الكشف عن عمليات التهابات أو الأورام، فضلا عن الأمراض الأخرى، وفي هذه المراحل الأولى من التنمية. ومع ذلك، وهذا بالغ الأهمية لفهم نمو الورم والغزو، أو الانبثاث التنمية والعمليات الخلو...

    Disclosures

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    Acknowledgements

    ونشكر السيدة سونيا دوفينتيستير، والسيدة الكه فيبر، والسيدة كلاوديا Niepagenkämper للمساعدة التقنية الممتازة.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Reagents
    Alfalfa-free dietHarlan Laboritories, Madison, USA2014
    Bepanthen eye ointmentBayer, Leverkusen, Germany80469764
    Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SwedenDB001
    EosinSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 4382
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)                         Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 9884
    Florene 100V/VAbbott, Wiesbaden, GermanyB506
    Haematoxylin                                                    Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyHHS32-1L
    O.C.T. Tissue Tek compound                                 Sakura, Zoeterwonde, Netherlands4583fixative for histological analyses
    Phosphate buffered saline, PBSLonza, Verviers, Belgium4629
    Sodium Chloride 0,9%Braun, Melsungen, Germany5/12211095/0411
    Sodium bicarbonate powderSigma Aldrich Deisenhofen, GermanyS5761
    Standard dietAltromin, Lage, Germany1320
    Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Netherlands4566
    Hemoccult (guaiac paper test)Beckmann Coulter, Germany3060
    Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibodySerotec, Oxford, UKMCA497B
    Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 BD Pharmingen, Heidelberg Germany553125
    Streptavidin-Alexa546Molecular Probes, Darmstadt, GermanyS-11225excitation/emission maximum:  556/573nm
    Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TCCalteg, Burlingame, USAR2b06
    Purified anti-mouse F4/80 antibodyBioLegend, London, UK123102
    DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyD9542
    FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibodyBD Pharmingen, Heidelberg, Germany553104
    FACS bufferBD Pharmingen, Heidelberg, Germany342003
    Cy7 NHS EsterGE Healthcare Europe, Freiburg, GermanyPA17104
    MPO ELISAImmundiagnostik AG, Bensheim, GermanyK 6631B
    Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibodyBioLegend, London, UK123127ready to use labelled Antibodies (alternative)
    Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5eBioscience, Waltham, USA45-4801-80ready to use labelled Antibodies (alternative)
    DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany67-68-5
    IsofluraneSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany792632
    EthanolSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany64-17-5
    Bovine Serum Albumins (BSA)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyA4612
    Tris Buffered Saline Solution (TBS)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanySRE0032
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Equipment
    FACS Calibur Flow Cytometry SystemBD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany
    FMT 2000 In Vivo Imaging SystemPerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAFMT2000
    True Quant 3.1 Imaging Analysis SoftwarePerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAincluded in FMT2000
    Leica DMLB Fluorescent MicroscopeLeica,  35578 Wetzlar, Germany DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 Berlin, GermanyHD 2070ultrasonic homogenizer
    Disposable scalpel No 10Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyZ692395-10EA
    Metzenbaum scissors 14cmEhrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany22398330
    luer lock syringe 5mlSigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyZ248010
    syringe needlesSigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyZ192368 
    Falcon Tube 50mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgium352070

    References

    1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
    2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
    3. Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
    4. Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
    5. Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
    6. Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
    7. Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
    8. Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
    9. Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
    10. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
    11. Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
    12. Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
    13. Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
    14. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
    15. Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
    16. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
    17. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
    18. Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
    19. Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
    20. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
    21. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
    22. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
    23. Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
    24. Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
    25. Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
    26. Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
    27. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
    28. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
    29. Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
    30. Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
    31. Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
    32. Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
    33. Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
    34. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
    35. Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
    36. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    130

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved