検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

要約

ターゲット特定プローブなど各種疾患 (例えば炎症、感染、腫瘍) におけるタンパク質発現の分子機構を解析するための革新的なツールを表します。本研究では F4/80 固有蛍光を介したトモグラフィによる大腸炎のマウスモデルにおける腸管マクロファージ浸潤の定量的三次元断層評価について述べる。

要約

病気のマウスモデルが科学的な研究に不可欠であります。しかし、内視鏡や断層イメージングなど多くの診断ツールは、動物モデルで日常的には採用されません。従来実験的読み出しは、しばしば事後と前のヴィヴォ分析、個人内のフォロー アップ検査を防止し、必要な研究の動物の数を増やすに依存します。蛍光を介したトモグラフィーできます蛍光プローブの非侵襲的、反復的、定量的な三次元評価です。非常に敏感であり、特異的検出と異なる分子標的の特性評価を可能にする分子のメーカーの使用を許可します。特に、ターゲット プローブは、炎症、自己免疫疾患、感染症、血管疾患、細胞遊走、腫瘍などで遺伝子の活性化および蛋白質の表現の分析のための革新的なツールを表します。この記事で私たちは体内検出と (すなわちF4/80 陽性マクロファージ浸潤) の広く使用されているマウス モデルにおける炎症の評価のこの高度なイメージング技術のステップバイ ステップの手順を提供します。腸の炎症。この手法は免疫細胞と幹細胞の追跡など、他の研究分野でもされる可能性があります。

概要

動物モデルは、科学的な研究で広く使用されて、多くの非侵襲的な手順が存在するモニターの疾患活動性と活力を体重の増減の定量化や血液、尿、糞便の分析など。ただし、これらは個体間変動予告も間接代理パラメーターのみです。彼らはよく反復的な時点でシリアルの観察を防ぐ組織標本の事後分析によって補完する必要があります、生理や病理組織学的観察を処理で体内を直接します。断面イメージング、光学イメージング、および内視鏡検査は、これらのプロセスの直接可視化を実現し、同じ動物¹の反復的な解析ができますクロスを含む高度な小動物イメージング技術が浮上しています。^,2,3。 さらに、繰り返し同じ動物の疾患のさまざまな状態を監視する可能性、必要な動物の倫理の観点から望ましいと考えられる動物の数を減らします。

生体内蛍光イメージングのためにいくつか別の光イメージング技術が存在します。もともと、共焦点レーザー顕微鏡を用いて地表および地下の蛍光イベント^4,5を研究します。最近では、ただし、三次元組織の定量的評価を可能にする断層システム先進⁶をされています。これが単色光源⁷検波器、低吸収を提供する近赤外線 (NIR) スペクトルで発光する蛍光プローブの開発によって達成されました。伝統的な断面解析イメージングしながらコンピューター断層撮影 (CT) や磁気共鳴画像 (MRI)、超音波 (米国)、ほとんど物理的なパラメーターに依存して、形態を視覚化するなど光イメージングすることができます追加情報を提供します。基になる分子プロセスに内因性あるいは外因性蛍光プローブ⁸をの。

分子生物学の進歩は、ターゲットの増加する数のスマートかつターゲットを絞った蛍光分子プローブの生成を促進に貢献しています。たとえば、受容体を介した取り込みと特定のターゲット領域における分布視覚化できます carbocyanine 誘導体標識抗体⁹を使用しています。体のそうでなければアクセスできない領域に特定のトレーサーとして機能するラベル付けできますが、利用可能な抗体の豊富な腫瘍と神経変性のモデル分子・細胞のプロセスに前例のない洞察を提供します。心血管系、免疫学的、および炎症性疾患⁷。

本研究では大腸炎のマウスモデルにおける蛍光を介したトモグラフィの使用をについて説明します。デキストラン硫酸ナトリウム (DSS)-誘導大腸炎、炎症性腸疾患 (IBD)¹⁰のような腸の炎症の標準化学物質誘発マウス モデル。腸炎症¹¹の開発に生来の免疫システムの貢献を評価するために特に便利です。採用、アクティブ化、および単球やマクロファージの浸潤は、IBD の病因の重要なステップを表す、採用の可視化や浸潤の動態が、たとえばの効果をモニターします。¹²の臨床設定で、潜在的な治療剤。我々 は DSS 大腸炎の誘導をについて説明し、単球/マクロファージ マーカー F4/80 の具体的な可視化の蛍光分子トモグラフィーを用いた消化管粘膜へのマクロファージ浸潤の断層撮影による評価を示します¹³さらに、抗体はラベリング; などの補助および補足的な手順を示す。実験のセットアップ;疾患活動指標など従来の読み出しとの相関関係で、得られた画像の分析と解釈流れ cytometry と組織学的解析および免疫組織化学。我々 は、この手法との比較その他の画像診断装置の制限をについて説明します。

プロトコル

すべての動物実験は、Landesamt für Natur、ドイツ動物保護法 (Tierschutzgesetz) によると環 und Verbraucherschutz (LANUV) ノルトライン ・ ヴェストファーレン州によって承認されました。

1. 材料と実験のセットアップ

1. 動物の世話。
   1. 20-25 g の体重で (例えばC57BL/6) に任意の DSS 感受性系統の性別と年齢をマッチさせたマウスを使用します。
   2. ローカル動物のケアのガイドラインに従ってマウス実験群とハウスあたり少なくとも 5 つ以上のマウスを計画します。
   3. ダイエットとオートクレーブ飲料水広告自由標準的な齧歯動物の食事を提供します。
   4. 標準的な食事を削除し、腔内自動蛍光を減らすためにスキャンする前に、少なくとも 3 日間無料のアルファルファの食事でそれを置き換えます。
2. 急性 DSS 誘発大腸炎の誘導。
   1. DSS の 2 g を溶解 (分子量 40,000 〜 ダ) 2% (w/v ソリューション) を取得するオートクレーブ飲料水 100 ml。
   2. DSS ソリューション専用のマウスの酒の電源を記入し、推定 5 mL 1 日あたりマウスごとの液体の。コントロール マウス¹⁰DSS せず同じ飲料水を提供します。
      注: は、実験の終わりまで毎日マウスを監視します。初期体重の 20% 以上を失うことまたはそれが瀕死になるマウスを安楽死させる (すなわち、永続的に減少の動き、姿勢を猫背、コートを建てる不自然な呼吸法、著しく) 動物に該当するローカルのガイドラインによると福祉。
3. 蛍光を介した断層レントゲン写真撮影の準備。
   1. 目的とする抗体 (例えばラット抗マウス F4/80) 蛍光色素をラベル (例えばCyanine7、λ_励起: 750 nm、λ_放出: 776 nm) 製造元のプロトコルで説明したよう。適切な透析膜で浄化された抗体の dialyze (細孔サイズ < 50 100 kDa) 少なくとも 2 時間または一晩の 0.15 M 塩化ナトリウムの 1 L に対して。
      1. 0.1 M NaHCO₃の 1 L に抗体を転送し、少なくとも 2 時間の dialyze。
      2. ジメチルスルホキシド (DMSO) で蛍光染料の必要な量を解散 (抗体の 10.8 mg μ L/) 抗体溶液を加えると。20 モル過剰色素とタンパク質比は 1:3 を達成するために蛍光染料を使用します。
      3. 1 h. 無標号の抗体を削除は、0.15 M ナトリウムの 1 L に対して透析か PD 10 脱塩カラムを使用して、4 ° C で暗闇の中でインキュベートし、生体内でアプリケーションのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で解決します。
      4. 吸光光度法による最終的な抗体濃度とラベリングの比率を決定します。
      5. 250 330 nm の吸収でタンパク質濃度を測定し、染料による追加吸収を検討します。280 に極大吸収を修正 750 で最大の吸収の 11% (タンパク質) nm nm (次の手順) Cyanine7 の分類のため。
      6. 測定 250 800 nm (通常 1:10) 化合物の希釈と 750 Cyanine7 の濃度を抽出 nm。
      7. として色素とタンパク質比を決定する: 染料/抗体 = 750 で最大吸収 nm/200,000/(280 最大吸収 nm - 750 で最大吸収 x 0.11 nm)/170,000。
      8. 4 ° C で抗体溶液を保持し、注入前に漂白を避けるために光からシールドします。
   2. それが使用されるまで注入と光からの盾の直前に滅菌注射器に必要な抗体の解決の容積を読み込みます。
   3. プローブ注入の最適なタイミングとトレーサー動態に応じて、スキャンの手順を決定します。
   4. 酸素吸入 1.5 2.5% イソフルランを用いたマウスを麻酔安全標識抗体の尾静脈注射用専用落を置くか。
   5. フルレングスの抗体、標識抗体、少なくとも 24 h、スキャンする前にマウス大腸炎における抗マウス F4/80 マクロファージ可視化などを注入します。マウスを静脈注射 (静注) 尾経由で 2.0 nmol の色素に対応する額の標識抗体を静脈。
   6. 使用同様に標識非特異的抗体 (例えば、ラット IgG または一次抗体遺産に対応する別のアイソタイプ) 線量のアイソタイプ コントロールとして特定のプローブと同等。
      注:生体内での結果をスキャン制御化合物の注入を画像データ特定のプローブの解釈のための参考資料として提供することができます後。
   7. 光の反射・吸収を最小限に抑えるため腹部の動物の毛皮を剃る電気かみそりを使用します。

2. 技術的な装置

1. 小動物蛍光 (図 4) の獣医蛍光を介したトモグラフィ (FMT) デバイスを使用します。
2. 「新研究」をクリックしてしてプロジェクトごとに新しい研究を作成ボタンをクリックし、、撮像パラメーターおよび将来の参考のための線量を含む関連するトレーサー研究説明に含めます。
3. この研究の中で「新しい研究グループ」をクリックするとそれぞれの研究デザイン (例えば、特定のトレースと非特異的アイソタイプ コントロール) によると研究グループを作成するボタン。動物のそれぞれの番号を持つ各研究グループを装備します。
4. トレーサーの構成要素のシステムを調整します。
   1. ラベルのバリエーションの正規化し、大井データから定量的測定を有効にするのにトレーサーの各バッチのキャリブレーションを実行します。
   2. 個々 のシステムの校正用測定器メーカーのガイダンスに従ってください。「新しいトレーサーを追加」を選択する、システムは手順のガイドを提供します。応用抗体溶液の希釈と計算される絶対プローブのトレーサー濃度を提供します。
   3. FMT、(重要な組織に似ている)、定義済みの厚さと吸収特性の組織模倣ファントムを使用し、使用される抗体の溶液の体積でそれを埋めます。FMT のデバイスでこれを測定します。
      注: 将来体内測定から絶対トレーサー濃度を計算するのに指定されたプローブは、一緒に指定された濃度の基準値の測定は、システムが使用されます。
5. スリーブ検査カセットを使用し温度 42 ° C
   注: これは、検査中に低体温になるからマウスを防ぎます。

3. 動物の麻酔

1. 1.5-2% vol % イソフルラン ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) マウスを麻酔する 1.5 L O₂最低の連続的な流れを使用してください。

簡単に麻酔の深さをコントロールし、スタッフの露出を最小限に抑えるため齧歯動物麻酔 (イソフルラン気化器) の特別に設計された吸入システムを使用します。

防漏誘導チャンバーにマウスを置き、イソフルラン供給 (100% (v/v)、酸素 3 L/分で 5 vol %) 用気化器入れます。リカンベントと無意識になるまで、マウスを監視します。

100 %v/v、1.5 の vol %、検査中に動きの人工物を最小限に抑えるために 1.5 L/分の酸素投与のノーズコーンを介して連続イソフルラン吸入とトモグラフィーの検討カセットに配置します。5 分よりも長く持続する手順、角膜の損傷を防ぐためマウスの目に眼軟膏を適用します。

反射神経をチェックすることによって麻酔の深さを評価します。その背面にマウスを置く麻酔で十分な場合、マウスがにしないでください。その足の指の間そっとマウスをピンチします。麻酔は十分ですが、脚は撤退 (外科的許容範囲のステージ) をできません。

4. 蛍光を介した断層レントゲン写真撮影スキャン

注: 適応、この FMT システムに固有の次の詳細については、必要に応じて、代替蛍光反射イメージング デバイスまたは FMT システムの研究 (材料の表を参照してください)。

1. 検査カセットにその背中に麻酔下のマウスを置きます。
2. スキャンの手順を実行します。
   1. イメージング システムにカセットを挿入し、連続的な麻酔を確実にすぐにそれを閉じます。以前作成した研究グループから適切なサンプルを選択します。トレーサー濃度の値は正しく計算するドロップ ダウン メニューから管理されるトレーサーを選択します。
   2. 適切な波長の蛍光反射率画像を取得 (720 nm Cyanine7) スキャン計画・概要」イメージの取得」ボタンをクリックしてスキャン フィールド。
   3. スキャン フィールド蛍光反射イメージ上のオーバーレイとして表示されますを参照してください。(例えば、コロンまたは腹部)、関心の領域に調整空気または残りの毛皮の領域を回避します。イメージ ターゲットに応じて画像数データ ポイント スキャン フィールド内から選択して設定粗い右側のメニューの中、細かいスキャン フィールドの解像度に。
      注意: は、細かいスキャン フィールド可能性があります大幅に長くスキャン時間を犠牲にしてより良い空間分解能を提供することに注意します。
   4. 「スキャン」をクリックして選択した波長のデータ/画像の取得を開始します。
      注: 腹部全体の中細スキャンのスキャン時間; 約 5 分になります今回は、各データ ポイントは個別に励起レーザーに照らされたされ生じる蛍光性が記録されます。
   5. スキャンの終わりにイメージングのカセットから動物を削除し、ケージに戻ってそれを置く前に完全回復する動物を許可します。
   6. 実験中にさまざまな時点で必要と認められる場合は FMT を繰り返します (0、5、および 9-10 日間など(試験終了))、しかし、バック グラウンド蛍光信号を増加させる体内の抗体の蓄積を考慮します。

5. スキャン後

1. 個室ケージ赤光地球温暖化ランプの下でペーパー タオルの上にマウスを置きし、完全復旧までの不快感や苦痛の兆候をマウスを監視します。いつ完全に目を覚まし、それぞれのケージに戻るには、マウスを置きます。
2. 100% (v/v) の用量でアイソレータへの CO₂の配信実験の終わりにマウス、100 vol % と 3 L/分を安楽死させます。高濃度 CO₂の突然の暴露は、苦痛を引き起こす可能性がありますと、CO₂で商工会議所をあらかじめ記入しないでください。マウスが急激な頚部転位などの安楽死のそれに続くセカンダリ モードによる呼吸を停止した後は、死を確認します。
3. 腹部の開腹手術で大腸を外植体し、手順に従って 4.2.1 - 4.2.4 explanted コロンの前のヴィヴォスキャンを実行します。縦 Metzenbaum 外科はさみを使用して各コロンを開き、さらに分析のためにそれを準備する前に生理食塩液を徹底的にすすいでください。
4. メスを使用すると、遠位結腸から 0.5 cm の断片を切り取り、すぐに 1.5 mL クライオ チューブで。凍結液体窒素で-70 ° c 店さらに使用 (例えばミエロペルオキシダーゼ (MPO) 測定) まで。
5. 木の棒を使用し、組織学的解析の粘膜の外側 (「スイスロール技法」) との近位端に遠位から残り縦に開かれているコロンをロールアップします。定着剤で準備を配置 (材料の表を参照してください)、-80 ° C¹⁴で凍結します。

6. データ再構築と解釈

1. それぞれは、イメージング ソフトウェアの再構成ツールを使用して、raw 画像データから蛍光分布の 3次元マップを作成スキャンはスキャンしたときに、自動的に再構築ツールに追加する関数"キューに追加復興"が選択されます。
   1. それ以外の場合、それぞれの研究の下のドロップ ダウン メニューからスキャンを選択し研究グループ、スキャンを右クリックし、「復興に追加」を選択
2. 詳細な分析、解析ソフトウェアにデータ セットを読み込みます。上部バーのドロップ ダウン メニューからそれぞれの研究を選択し、右側のメニューから [研究グループと個々 の動物この動物のため実行するスキャンのすべてが表示されます。正しいスキャンを選択し、「読み込み」をクリックしてください
   注: トレーサー分布の三次元左側の当初取得蛍光反射率画像のオーバーレイとして表示されます。モデルを回転の分析を容易に拡大することができます。
3. 非特異的ラベル蓄積 (例えば肝臓や尿膀胱) 再建された 3 D マップ上の病巣を特定し、ターゲット組織 (例えば腸や腸) から区別するため。
4. 一番上のバーからターゲットの最も適切な ROI 形状を選択します。解析ソフトウェアのそれぞれの測定ツールを配置することによって利益 (率 ROI) の領域としてラベル対象組織ソフトウェアがモルのスキャンが済んでトレーサー量、投資収益率と同様、(ピコ) の蛍光強度を提供します。
5. (組織) の炎症性の浸潤との相関関係の疾患活動性の評価のために最も適した相当として ROI サイズに正規化された、適切な投資収益率でトレーサーの合計量を選択します。
   注: 特定のモデルの代表として適切な場合は、投資収益率の他の機能を選択できます。

7。Ex Vivo解析

1. ヘマトキシリンとエオシン染色と蛍光抗体法。
   1. 70% のエタノール (エタノール); 2 分でそれらを配置することによって、セクションを deparaffinize します。その後水ですすいでください。5 分のヘマトキシリン液で染色し、その後 10 分間ぬるま湯ですすいでください。
   2. エオシン溶液 2 分間で対比染色、蒸留水ですすぎ、もう一度蒸留水ですすぎ。
   3. 場所 70 %etoh、96 %etoh、99% エタノール、およびキシレン (2 回) が脱水し、セクションをクリア各 2 分の。メディアを樹脂製マウントをマウントします。
2. 蛍光抗体法。
   1. 螢光抗体の汚損のため以前に取得した組織切片 (「スイスロール」) を使用し、7 μ m の低温カット セクションを準備します。
   2. 10 分 5.0% ラット血清中のアセトン固定と冷凍コロン セクションをブロックし、希薄 (1/500 v/v) ビオチン化初代ラット抗マウス F4/80 抗体一晩インキュベートします。トリス緩衝生理食塩水 (TBS) で三度のセクションを洗浄し、PBS/BSA のストレプトアビジン FITC (1: 100 v/v) と孵化 (0.1 %w/v) 4 ° C でオーバー ナイト
   3. TBS の各セクションを洗って 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、1: 1000 v/v) コントラストを達成するために染まります。共焦点顕微鏡蛍光画像を分析 (フィルター キューブ N2.1 励起フィルター 515 560; 40 倍の倍率表の材料を参照) と高出力フィールドごと F4/80-陽性細胞をカウントします。
      注: は、生体内でFMT と事後組織解析免疫組織染色や蛍光染色、意図されていたターゲットによってなどを結合するときに同じクローンとフォーマットの抗体を使用してください。F4/80 陽性マクロファージ体内と体外の検出、さまざまな形式が使用されました。
3. MPO コロン サンプルの測定。
   1. 新鮮な取得、PBS 洗浄コロン サンプルや MPO 測定のため解凍試験片に使用します。すべてのサンプルの重量を量るし、組織を均質化、ELISA、換散バッファーのキット (材料の表を参照してください) 組織の mg 当たり換散バッファーの 20 μ L のボリュームで。
   2. 15 超音波 s (超音波周波数: 20 kHz、電力: 70 W) 200 x g と 4 ° C で 10 分間のサンプルを遠心力と
   3. 市販 ELISA キット (材料の表を参照) の使用のメーカー説明によると。重複のテストを実行します。

結果

大腸炎の評価:

DSS 誘発大腸炎は人間の IBD に似ており、減量、直腸出血、表面的な潰瘍、感受性のあるマウス¹⁵粘膜損傷につながる腸管炎症の化学物質誘発マウス モデルです。特に自然免疫炎症性腸^10,11の開発の貢献の研究に有用です。合併の炎症?...

ディスカッション

医療イメージング技術は、近年急速に進化してきたが我々 はまだ開発のごく初期の段階で炎症性プロセスまたは他の病気と同様、腫瘍を検出する当社の能力に制限されます。ただし、これは理解腫瘍の成長、侵略、または転移開発および炎症性疾患と変性、心血管及び免疫疾患の開発の細胞プロセスに重要です。伝統的なイメージング技術は、身体的または生理学的なパラメーターに依存し...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Alfalfa-free diet	Harlan Laboritories, Madison, USA	2014
Bepanthen eye ointment	Bayer, Leverkusen, Germany	80469764
Dextran sulphate sodium (DSS)	TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden	DB001
Eosin	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 4382
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 9884
Florene 100V/V	Abbott, Wiesbaden, Germany	B506
Haematoxylin	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	HHS32-1L
O.C.T. Tissue Tek compound	Sakura, Zoeterwonde, Netherlands	4583	fixative for histological analyses
Phosphate buffered saline, PBS	Lonza, Verviers, Belgium	4629
Sodium Chloride 0,9%	Braun, Melsungen, Germany	5/12211095/0411
Sodium bicarbonate powder	Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany	S5761
Standard diet	Altromin, Lage, Germany	1320
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, Leiden, Netherlands	4566
Hemoccult (guaiac paper test)	Beckmann Coulter, Germany	3060
Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody	Serotec, Oxford, UK	MCA497B
Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1	BD Pharmingen, Heidelberg Germany	553125
Streptavidin-Alexa546	Molecular Probes, Darmstadt, Germany	S-11225	excitation/emission maximum:  556/573nm
Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC	Calteg, Burlingame, USA	R2b06
Purified anti-mouse F4/80 antibody	BioLegend, London, UK	123102
DAPI	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	D9542
FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody	BD Pharmingen, Heidelberg, Germany	553104
FACS buffer	BD Pharmingen, Heidelberg, Germany	342003
Cy7 NHS Ester	GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany	PA17104
MPO ELISA	Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany	K 6631B
Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody	BioLegend, London, UK	123127	ready to use labelled Antibodies (alternative)
Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5	eBioscience, Waltham, USA	45-4801-80	ready to use labelled Antibodies (alternative)
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	67-68-5
Isoflurane	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	792632
Ethanol	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	64-17-5
Bovine Serum Albumins (BSA)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	A4612
Tris Buffered Saline Solution (TBS)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	SRE0032
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
FACS Calibur Flow Cytometry System	BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany
FMT 2000 In Vivo Imaging System	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	FMT2000
True Quant 3.1 Imaging Analysis Software	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	included in FMT2000
Leica DMLB Fluorescent Microscope	Leica,  35578 Wetzlar, Germany	DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Berlin, Germany	HD 2070	ultrasonic homogenizer
Disposable scalpel No 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z692395-10EA
Metzenbaum scissors 14cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany	22398330
luer lock syringe 5ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z248010
syringe needles	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z192368
Falcon Tube 50ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgium	352070