JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Hedef özgü probları protein ifade çeşitli hastalık (Örneğin, iltihap, enfeksiyon ve tumorigenesis) gibi moleküler mekanizmaları analiz etmek için yenilikçi bir araç temsil eder. Bu çalışmada, bağırsak makrofaj infiltrasyonu F4/80 özel tomografi Floresans aracılı kullanarak kolit, fare modeli üç boyutlu bir nicel tomografik değerlendirilmesi açıklar.

Özet

Hastalığın fare modelleri bilimsel araştırma için vazgeçilmezdir. Ancak, endoskopi veya tomografik görüntüleme gibi birçok tanılama araçlarını düzenli olarak hayvan modellerinde istihdam değil. Geleneksel deneysel veriler çoğunlukla intra bireysel izleme sınavları önlemek ve çalışma hayvanların gerekli sayıda artışı post mortem ve ex vivo analizlere kullanır. Floresan-aracılı tomografi floresan problar non-invaziv, tekrarlayan, nicel, üç boyutlu bir değerlendirme sağlar. Son derece duyarlı ve özel algılama ve ayrı moleküler hedeflerin karakterizasyonu için izin veren moleküler yapımcıları, kullanımına izin verir. Özellikle, hedeflenen probları gen harekete geçirmek ve protein ekspresyonu inflamasyon, otoimmün hastalığı, enfeksiyon, damar hastalıkları, hücre göç, tumorigenesis, vbolarak analiz etmek için yenilikçi bir araç temsil eder. Vivo algılama ve inflamasyon (Yani, F4/80-pozitif makrofaj infiltrasyonu), yaygın olarak kullanılan bir fare modeli karakterizasyonu için bu makalede, biz bu sofistike görüntüleme teknolojisi üzerinde adım adım yönergeler sağlar bağırsak iltihabı. Bu teknik de bağışıklık hücre veya kök hücre izleme gibi diğer araştırma alanlarda kullanılabilir.

Giriş

Hayvan modelleri bilimsel araştırmalarda yaygın olarak kullanılır ve hastalık etkinliğini izleme ve canlılık, vücut ağırlığı değişiklikler miktar veya kan, idrar ve dışkı analizi gibi birçok non-invaziv prosedürleri var. Ancak, bu da tabi arası bireysel farklılıklarına sadece dolaylı temsilci parametre vardır. Onlar sık sık post mortem analizleri tekrarlanan zaman noktalarda seri gözlem engeller doku örnek tarafından tamamlanabilir gerekir ve gözlem fizyolojik veya patolojik içinde vivoişler doğrudan. Sofistike küçük hayvan görüntüleme teknikleri, çapraz kesit görüntüleme, optik görüntüleme ve Endoskopi, bu süreçlerin doğrudan görselleştirme ve ayrıca aynı hayvanlar1 tekrarlayan analizleri için sağlar bu da dahil olmak üzere ortaya çıkmıştır , 2 , 3. Ayrıca, sürekli aynı hayvan hastalığında çeşitli durumlarını izlemek için olasılık daha bir hayvan etik açıdan uygun olabilir gerekli, hayvan sayısını azaltmak.

Birkaç farklı optik görüntüleme teknikleri vivo içinde Floresans görüntüleme için mevcut. Aslında, confocal görüntüleme yüzey ve yeraltı floresan olayları4,5çalışmaya istihdam edildi. Son zamanlarda, ancak, nicel üç boyutlu doku değerlendirmeler için izin tomografik sistemleri gelişmiş6olmuştur. Bu düşük emilim, duyarlı detektörlerle ve monokromatik ışık kaynakları7sunan yakın kızılötesi (Nur) spektrumda ışık yayarlar floresan problar geliştirilmesi yoluyla gerçekleştirdi. Bilgisayarlı Tomografi (BT), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) veya ultrason (ABD), çoğunlukla fiziksel parametrelere dayanan ve Morfoloji, görselleştirmek gibi geleneksel cross-sectioning görüntüleme teknikleri, ek bilgiler optik görüntüleme sağlar temel moleküler süreçleri endojen veya eksojen floresan kullanarak8sondalar.

Moleküler Biyoloji gelişmeler hedefler giderek artan sayıda için akıllı ve hedeflenen floresan moleküler probları nesil kolaylaştırmak için yardımcı oldu. Örneğin, reseptör aracılı alımı ve belirli hedef alan dağıtım carbocyanine türev etiketli antikorlar9kullanarak görüntülenmeyecektir. Vücudun aksi ulaşılmaz yerlerde belirli tarayıcıları olarak çalışmaya etiketli, mevcut antikorlar bolluk tumorigenesis ve nörodejeneratif modellerinin moleküler ve hücresel işlemlerinde benzersiz anlayışlar sağlar, kalp, immünolojik ve inflamatuar hastalıkları7.

Bu çalışmada, Floresans aracılı tomografi kolit, fare modeli nasıl kullanılacağını açıklar. Dextran sodyum sülfat (DSS)-bağlı kolit olan standart bir kimyasal olarak indüklenen fare modeli iltihabi bağırsak hastalığı (IBD)10benzer bağırsak iltihabı. Doğuştan gelen bağışıklık sistemi bağırsak iltihabı11gelişimine katkısını değerlendirmek özellikle yararlıdır. İşe alma, harekete geçirmek ve monosit ve makrofaj infiltrasyonu IBD patogenezinde önemli adımları temsil ettiğinden, onların işe alım görselleştirme ve Kinetik infiltrasyon, örneğin, etkisini kontrol için gerekli Preklinik ayarı12olası tedavi edici maddeler. DSS kolit indüksiyon tarif ve makrofaj infiltrasyon Floresans moleküler tomografi monosit/makrofaj işaretçiyi F4/80 belirli görselleştirme için kullanarak bağırsak mukozası içine tomografi-aracılı karakterizasyonu göstermek 13. Ayrıca, antikor etiketleme gibi; yardımcı ve tamamlayıcı yordamlara göstermek deneysel Kur; ve analizi ve yorumu elde edilen görüntülerin hastalık aktivite endeksi gibi geleneksel çıktıları ile korelasyon Akış Sitometresi ve histolojik analizi ve immünhistokimya. Biz bu tekniği ve karşılaştırmalar diğer görüntüleme yöntemleri için sınırlamalar tartışıyorlar.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen göre Alman hayvan koruma kanunu (Tierschutzgesetz) tarafından kabul edildi.

1. malzeme ve deneysel Kur

  1. Hayvan bakımı.
    1. Cinsiyet ve yaş uyumlu fare DSS-duyarlı herhangi bir baskı (Örneğin, C57BL/6) 20-25 g vücut ağırlığı kullanın.
    2. Deney grubu ve ev başına en az beş veya daha fazla fare fareler yerel hayvan bakımı esaslarına göre planlayın.
    3. Standart bir kemirgen chow diyet ve autoclaved içme suyu ad libitumsağlar.
    4. Standart chow kaldırmak ve en az üç gün önce endoluminal auto-floresan azaltmak için tarama yonca-Alerjik chow ile değiştirin.
  2. Akut DSS kaynaklı kolit indüksiyon.
    1. DSS 2 g dağıtılması (moleküler ağırlık ~ 40.000 Da) 100 ml autoclaved içme suyu %2 (w/v çözüm) elde etmek için.
    2. Fareler içme teminini sadece DSS çözüm ile doldurun ve 5 mL sıvı fare günlük ücret de tahmin ediyoruz. Denetim fare10DSS olmadan aynı içme suyu sağlar.
      Not: fareler günlük deneme sonuna kadar izleyin. Bunu kaybetmek onların ilk vücut ağırlığının % 20'den büyük veya can çekişen haline fareler ötenazi (Yani, ısrarla Kambur duruş, azalan hareket, nefes çok çalışan, belirgin dik kat) hayvan üzerinde yerel ilgili yönergelere göre refah.
  3. Floresan-aracılı tomografi hazırlanması.
    1. Floresans boya ile istenen antikor (Örneğin, fare Anti-fare F4/80) etiket (Örneğin, Cyanine7, λuyarma: 750 nm, λemisyon: 776 nm) üreticinin iletişim kuralında tanımlandığı gibi. Bir uygun diyaliz zarda arıtılmış antikor Diyaliz (gözenek boyutu < 50-100 kDa) 0,15 M Sodyum Klorür için en az 2 h veya gecede 1 litre karşı.
      1. 1 litre 0.1 M NaHCO3 antikor transferi ve en az 2 h diyaliz.
      2. Dimetil sülfoksit (DMSO) floresan boya gerekli miktarda dağıtılması (10,8 µL/mg antikor) ve antikor ekleyin. Floresan boya 20-fold molar aşan bir boya protein oranı 1:3 elde etmek için kullanın.
      3. Karanlıkta 4 ° c için 1 h. çıkarmak diyaliz 0.15 M sodyum 1 L karşı veya PD-10 desalting sütun kullanarak etiketsiz antikor kuluçkaya ve fosfat tamponlu tuz (PBS) vivo uygulama için çözmek.
      4. Spectrophotometry tarafından son antikor konsantrasyon ve etiketleme oranı belirler.
      5. 250-330 nm bir emilimini protein konsantrasyonu ölçmek ve boya tarafından ek emme düşünün. 280 en fazla emme düzeltmek nm (protein) 750 maksimum emilim % 11'i tarafından nm (sonraki adım) Cyanine7 etiketleme için.
      6. 250-800 nm (genellikle 1:10) kampta seyreltme ölçmek ve hulâsa Cyanine7 konsantrasyonu 750 nm.
      7. Boya protein oranı olarak belirlemek: boya/antikor maksimum emilim 750 = nm / 200.000 / (en fazla emme 280 nm - max emme 750 x 0,11 nm) / 170.000.
      8. Antikor çözüm 4 ° C'de tutmak ve enjeksiyon önce beyazlatma önlemek için ışık kalkan.
    2. Bu kullanılana kadar steril enjektör gerekli antikor çözüm hacmindeki hemen önce enjeksiyon ve ışık kalkan yükleyin.
    3. En iyi zamanlama sonda enjeksiyon ve tarama yordama bağlı olarak izleyici farmakokinetik belirler.
    4. Oksijen inhale % 1.5-2.5 isoflurane kullanarak fare anestezi veya güvenli bir şekilde etiketlenmiş antikorlar kuyruk ven enjeksiyon için adanmış bir restrainer yer onları.
    5. Tam uzunlukta antikor tarama önce etiketli antikor en az 24 h Anti-fare F4/80 makrofaj görselleştirme fare kolit gibi enjekte. Fareler intravenöz enjekte (IV) yolu ile kuyruk damar etiketli antikor boya 2.0 nmol için karşılık gelen bir miktar ile.
    6. Kullanım aynı derecede belirsiz antikorlar (Örneğin, fare IgG veya başka bir izotip birincil antikor miras için karşılık gelen) bir izotip kontrol dozlarda belirli inceleyebilirsek eşdeğer etiket aynı derecede.
      Not: Vivo sonuçları tarar sonra enjeksiyon kontrol bahçedeki veri görüntüleme belirli sonda yorumlanması için bir başvuru olarak hizmet verebilir.
    7. Tıraş ışık yansıması ve emilimi en aza indirmek için karın bölgesinde hayvan kürk tıraş için kullanın.

2. teknik ekipman

  1. Bir veteriner Floresans aracılı tomografi (FMT) aygıtı küçük hayvan floresan ( şekil 4) kullanın.
  2. Her proje için yeni bir çalışma "yeni çalışması" yi tıklatarak oluşturun düğmesini tıklatın ve çalışma açıklamasında görüntüleme parametreleri ve doz ileride de dahil olmak üzere ilgili izleyiciler içerir.
  3. Bu çalışma içinde "yeni çalışma grubu" yi tıklatarak çalışma grupları (Örneğin, belirli izleme ve belirsiz izotip kontrol için) ilgili çalışma tasarımına göre oluşturun düğmesini. Her çalışma grubu ile ilgili sayı hayvanların donatmak.
  4. İzleme yapıları için sistemi kalibre.
    1. Her dizi izleyicileri etiketleme varyasyon için normal duruma getirmeye ve nicel ölçüm OI verilerden etkinleştirmek için kalibrasyon gerçekleştirin.
    2. Her bireysel sistem kalibrasyonu için araç üreticisinin kılavuzunu izleyin; "yeni eklemesini" seçimi, sistem bir kılavuz sayesinde adımları sağlar. Uygulamalı antikor çözüm seyreltme ve izleyici sonda içinde hesaplanan mutlak konsantrasyon sağlar.
    3. FMT, doku taklit eden hayalet (hayati doku benzeyen) tanımlanmış kalınlığı ve emme özellikleri kullanın ve kullanılan antikor çözüm belirli bir ses ile doldurun. FMT aygıtta ölçmek.
      Not: Sistem verilen konsantrasyonu ile birlikte sağlanan sonda referans ölçüm mutlak izleyici konsantrasyonları üzerinden gelecek vivo içinde ölçümleri hesaplamak için kullanır.
  5. Isıtılabilen muayene kaset 42 ° c sıcaklık ile kullanma
    Not: Bu fareler muayene sırasında hipotermik olmasını engeller.

3. hayvan anestezi

  1. % 1.5-2 vol % isoflurane ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) ve fareler anestezi için 1, 5 L O2/min., sürekli bir akış kullanın
Özel olarak tasarlanmış inhalasyon sistemi kolayca anestezik derinliği kontrol ve personel pozlandırmayı en aza indirmek kemirgen anestezi (isoflurane Buharlaştırıcı) kullanır.
  • Sızıntı geçirmez indüksiyon odasında fareyi getirin ve Buharlaştırıcı isoflurane sağlama işleri (%100 (v/v), 5 vol % oksijen, 3 L/dak) açın. Yaslanmış ve bilinçsiz kadar fare izleyin.
  • Tomografi, sürekli isoflurane inhalasyon yolu ile burun konisi, % 100 v/v, oksijen, muayene sırasında hareket eserlerin en aza indirmek için 1, 5 L/min 1,5 vol % bir doz ile muayene kaset yerleştirin. 5 dk daha uzun süren işlemler için kornea hasarı önlemek için fare gözleri göz merhem uygulamak.
  • Anestezi derinliği refleksleri kontrol ederek değerlendirmek. Fare sırtında yatıyordu; Anestezi yeterliyse, fare geri dönmeliyiz değil. Fareyi yavaşça onun ayak parmakları arasında çimdik; Anestezi yeterliyse, bacak çekilen (sahne) cerrahi hoşgörü olmayacaktır.

    • 4. floresan-aracılı tomografi taraması

    Not: Bu kullanılan FMT sistemine özgü aşağıdaki ayrıntıları uyum ( Tablo reçetesigörmek) alternatif Floresans yansıma görüntüleme aygıtları veya FMT sistemleri için gerektiği gibi çalışma.

    1. Muayene kaset sırtında imzalat fareyi getirin.
    2. Tarama yordamı gerçekleştirin.
      1. Kaset görüntüleme sistemi yerleştirin ve hemen sürekli anestezi emin olmak için kapatın. Uygun örnek önceden oluşturulmuş çalışma grubundan seçin. Yönetilen izleyici izleyici konsantrasyon değerleri doğru hesaplanmasını sağlamak için açılır menüden seçin.
      2. Uygun dalga boyu Floresans yansıma görüntü elde etmek (720 nm Cyanine7 için) tarama planlamak ve anahat "elde görüntüsü" düğmesini tıklatarak tarama alanı için.
      3. Bkz: tarama alanı Floresans yansıma görüntü üzerinde bir kaplama olarak görüntülenir. Faiz (Örneğin, kolon veya karın), bölge için ayarlamak hava veya kalan kürk alanlarında kaçınarak. Görüntü hedef bağlı olarak görüntü sayısını orta ve ince tarama alanı çözünürlük sağdaki menüde kaba tercih ederek tarama alanı içinde veri noktaları ayarlayın.
        Not: bir iyi tarama alanını önemli ölçüde uzun süre scanning zaman pahasına daha iyi Uzaysal çözünürlük sunuyor olabilir unutmayın.
      4. Veri/resim alma seçili dalga boyu, "tarama" tıklayarak başlatın
        Not: Tüm karın bir orta-ince tarama tarama süresi yaklaşık 5 dk olacak; Bu süre içinde her bir veri noktasını ayrı ayrı uyarma lazer tarafından aydınlatılmış ve elde edilen floresan kaydedilir.
      5. Tarama sonunda görüntüleme kaset hayvan kaldırmak ve hayvan tamamen kafesin içine yerleştirmeden önce kurtarmak izin verir.
      6. FMT deneme sırasında çeşitli zaman noktalarda gerekli görüldüğü takdirde tekrar (Örneğin, 0, 5 ve 9-10 gün (son deneme)), ama bu nedenle arka plan Floresans sinyal artan vücutta antikor birikimi göz önünde bulundurun.

    5. sonrası tarama

    1. Bir kağıt havlunun bir kırmızı ışık Isınma lamba altında ayrı bir kafeste fareyi getirin ve fareyi rahatsızlık veya sıkıntı belirtileri için tam kurtarma kadar izlemek. Fareyi geri onun kendi kafesin içine ne zaman tam olarak uyanık getirin.
    2. Fareler bir doz %100 (v/v), izolatör CO2 teslimini tarafından deney sonunda, 100 vol % ve 3 L/dak ötenazi. CO2 yüksek konsantrasyonda ani bir pozlama sıkıntıya neden gibi odası CO2 ile önceden doldurmayın. Fare ötenazi hızlı servikal çıkık gibi bir sonraki ikincil mod tarafından nefes durduktan sonra ölüm doğrulayın.
    3. Kolon karın laparotomi tarafından explant ve adımları 4.2.1 - 4.2.4 açıklanmıştır explanted iki nokta üstüste, bir ex vivo tarama gerçekleştirin. Her kolon boyuna Metzenbaum Cerrahi makas kullanarak açın ve tuzlu çözüm ile daha ayrıntılı bir çözümleme için hazırlamadan önce iyice durulayın.
    4. Bir neşter distal kolon bir 0,5 cm parçası keser ve hemen bir 1.5 mL kriyojenik tüpe yerleştirir için kullanın. Daha fazla kadar kullanmak (Örneğin,myeloperoxidase (MPO) ölçüler) sıvı azot ve-70 ° C'de store durdur.
    5. Tahta bir sopa kullanmak ve kalan boyuna kadar rulo mukoza dışa ("İsviçre rulo tekniği") ile proksimal sonuna iki nokta üst üste gelen distal histolojik analizler için açtı. Hazırlık bir sabitleştirici yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) ve-80 ° C14, Don.

    6. veri yeniden yapılanma ve yorumu

    1. 3D maps-in Floresans dağıtım ham görüntü verilerinden oluşturma için ilgili düşsel bilgisayar yazılımı yeniden yapılandırma aracını kullanın; taramaları otomatik olarak tarama zaman üzerine imar aracına eklenir, işlev "Ekle yeniden yapılanma kuyruğuna" seçilir.
      1. Aksi takdirde, taramaları ilgili çalışma altında açılır menüden seçin ve grup çalışması, tarama sağ tıklatın ve seçin "yeniden yapılmasına ekleyin."
    2. Daha fazla çözümleme için bir veri kümesi analiz yazılımı yükleyin. Üst çubuğundaki açılır menüsünden ilgili çalışma seçin ve ardından çalışma grubu ve bireysel hayvan sağ taraftaki menüden seçin; Bu hayvan için gerçekleştirilen tüm inceden inceye gözden geçirmek-ecek var olmak göstermek. Doğru Tara öğesini seçin ve "Yükle" seçeneğini tıklatın
      Not: İzleyici dağıtım 3D yeniden inşası başlangıçta alınan Floresans yansıma görüntü bir bindirme olarak sol tarafta görünür. Model döndürülmüş ve daha kolay çözümleme için büyütülmüş.
    3. Yeniden oluşturulan 3D haritalar üzerinde (Örneğin, karaciğer ve idrar kesesi) belirsiz etiket birikimi Foci belirlemek ve hedef dokulardan (Örneğin, bağırsak veya bağırsak) ayırt etmek.
    4. Üst çubuğu'ndan hedef için en uygun yatırım Getirisi şekli seçin. Etiket hedef doku bölgeleri analiz yazılımı ilgili ölçü araçları yerleştirerek ilgi (ROI) olarak; yazılım bir floresan yoğunluğu tarama için kalibre izleyici molar miktarda yatırım Getirisi, aynı zamanda için (pico-) sağlayacaktır.
    5. Hastalık aktivitesi (Histoloji) enflamatuar infiltrat ile ilişki içinde değerlendirilmesi için en uygun eşdeğer olarak yatırım Getirisi boyutu için normalleştirilmiş uygun yatırım Getirisi, izleyici toplam miktarı seçin.
      Not: Diğer şekil-in ROI uygunsa, belirli bir modeli temsilcisi olarak seçilebilir.

    7.Ex Vivo Analizleri

    1. Hematoksilen ve Eozin boyama ve ayirt boyama.
      1. Bölüm 2 min için % 70 etanol (alkol) yerleştirerek deparaffinize; daha sonra distile su ile durulayın. 5 min için Hematoksilen çözüm ile leke ve daha sonra 10 dk sıcak musluk suyu ile yıkayın.
      2. Counterstain için 2 dk, Eozin çözüm ile distile su ile durulama ve tekrar distile su ile durulayın.
      3. Yer % 70 alkol, %96 alkol, %99 alkol ve Ksilen (2 kez) için 2 dk her kurutmak ve bölümü temizlemek için. Reçineli montaj orta ile bağlayın.
    2. Ayirt boyama.
      1. Cryo-kesme bölümleri 7 µm hazırlamak ve ayirt boyama için daha önce alınan doku bölümler ("İsviçre rulo") kullanın.
      2. Aseton-sabit ve donmuş iki nokta üst üste bölümler için 10 dk % 5.0 sıçan Serumda engellemek ve gecede seyreltilmiş (1/500 v/v) biotinylated birincil fare Anti-fare F4/80 antikor ile kuluçkaya. Üç kez Tris tamponlanmış salin (TBS) bölümleri yıkama ve Streptavidin-FITC ile (1: 100 v/v) PBS/BSA içinde kuluçkaya (% 0,1 w/v) gecede 4 ° C'de
      3. TBS bölümlerde yıkama ve'ile 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1000 v/v) kontrast elde etmek için leke. Confocal mikroskop altında floresan görüntü analiz (bakınız Tablo reçetesi; 40 x büyütme; filtre küp N2.1 uyarma filtreli 515-560) ve yüksek güç alan başına F4/80-pozitif hücreleri saymak.
        Not: antikor aynı klon ve biçimi içinde vivo FMT ve post mortem Histoloji analizleri immünhistokimya veya hedef bağlı olarak ayirt, boyama gibi birleştirirken kullanmayı düşünün. F4/80-pozitif makrofajlar içinde vivo ve ex vivotespiti için farklı biçimlerde kullanılmıştır.
    3. MPO ölçümlerde kolon örnekleri.
      1. Taze elde, iki nokta üst üste örnekleri PBS durulanır ya da çözdürülen numune MPO ölçümler için kullanın. Tüm örneklerini tartmak ve doku homojenize ELISA içinde sağlanan lizis arabelleği ( Tablo reçetesigörmek) lizis arabelleği doku mg başına 20 µL hacmi, kit.
      2. 15 için solüsyon içeren temizleyicide s (sonication frekans: 20 kHz, güç: 70 W) ve örnekleri için 200 g ve 4 ° c x 10 dk santrifüj kapasitesi
      3. Piyasada bulunan bir ELISA kiti ( Tablo reçetesigörmek) kullanmak üretmektedir açıklama göre. Çoğaltmaları testinde yerine getirir.

    Sonuçlar

    Kolit değerlendirilmesi:

    DSS kaynaklı kolit insan IBD benzer ve kilo kaybı, rektal kanama, yüzeysel ülserasyonun ve duyarlı fareler15Mukozal hasara yol açar bağırsak iltihabı kimyasal olarak indüklenen bir fare modeldir. Doğuştan gelen bağışıklık sistemi bağırsak iltihabı10,11gelişimine katkısını incelemek...

    Tartışmalar

    Tıbbi görüntüleme teknikleri son yıllarda hızla geliştiğini rağmen biz hala bizim yetenek iltihabi süreçleri veya tümörler, hem de diğer hastalıklar erken onların geliştirme aşamalarında algılamak için sınırlıdır. Ancak, bu anlayış tümör büyüme, işgali, ya da metastaz kalkınma ve hücresel süreçler enflamatuar bozuklukları ve dejeneratif, kardiyovasküler ve immünolojik hastalıkların gelişiminde çok önemlidir. Geleneksel görüntüleme teknikleri fiziksel veya fizyolojik parametr...

    Açıklamalar

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Teşekkürler

    Bayan Sonja Dufentester, Bayan Elke Weber ve Bayan Klaudia Niepagenkämper mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.

    Malzemeler

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Reagents
    Alfalfa-free dietHarlan Laboritories, Madison, USA2014
    Bepanthen eye ointmentBayer, Leverkusen, Germany80469764
    Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SwedenDB001
    EosinSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 4382
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)                         Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 9884
    Florene 100V/VAbbott, Wiesbaden, GermanyB506
    Haematoxylin                                                    Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyHHS32-1L
    O.C.T. Tissue Tek compound                                 Sakura, Zoeterwonde, Netherlands4583fixative for histological analyses
    Phosphate buffered saline, PBSLonza, Verviers, Belgium4629
    Sodium Chloride 0,9%Braun, Melsungen, Germany5/12211095/0411
    Sodium bicarbonate powderSigma Aldrich Deisenhofen, GermanyS5761
    Standard dietAltromin, Lage, Germany1320
    Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Netherlands4566
    Hemoccult (guaiac paper test)Beckmann Coulter, Germany3060
    Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibodySerotec, Oxford, UKMCA497B
    Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 BD Pharmingen, Heidelberg Germany553125
    Streptavidin-Alexa546Molecular Probes, Darmstadt, GermanyS-11225excitation/emission maximum:  556/573nm
    Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TCCalteg, Burlingame, USAR2b06
    Purified anti-mouse F4/80 antibodyBioLegend, London, UK123102
    DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyD9542
    FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibodyBD Pharmingen, Heidelberg, Germany553104
    FACS bufferBD Pharmingen, Heidelberg, Germany342003
    Cy7 NHS EsterGE Healthcare Europe, Freiburg, GermanyPA17104
    MPO ELISAImmundiagnostik AG, Bensheim, GermanyK 6631B
    Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibodyBioLegend, London, UK123127ready to use labelled Antibodies (alternative)
    Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5eBioscience, Waltham, USA45-4801-80ready to use labelled Antibodies (alternative)
    DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany67-68-5
    IsofluraneSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany792632
    EthanolSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany64-17-5
    Bovine Serum Albumins (BSA)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyA4612
    Tris Buffered Saline Solution (TBS)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanySRE0032
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Equipment
    FACS Calibur Flow Cytometry SystemBD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany
    FMT 2000 In Vivo Imaging SystemPerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAFMT2000
    True Quant 3.1 Imaging Analysis SoftwarePerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAincluded in FMT2000
    Leica DMLB Fluorescent MicroscopeLeica,  35578 Wetzlar, Germany DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 Berlin, GermanyHD 2070ultrasonic homogenizer
    Disposable scalpel No 10Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyZ692395-10EA
    Metzenbaum scissors 14cmEhrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany22398330
    luer lock syringe 5mlSigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyZ248010
    syringe needlesSigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyZ192368 
    Falcon Tube 50mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgium352070

    Referanslar

    1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
    2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
    3. Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
    4. Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
    5. Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
    6. Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
    7. Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
    8. Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
    9. Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
    10. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
    11. Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
    12. Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
    13. Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
    14. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
    15. Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
    16. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
    17. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
    18. Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
    19. Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
    20. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
    21. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
    22. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
    23. Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
    24. Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
    25. Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
    26. Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
    27. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
    28. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
    29. Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
    30. Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
    31. Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
    32. Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
    33. Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
    34. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
    35. Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
    36. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).

    Yeniden Basımlar ve İzinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

    Izin talebi

    Daha Fazla Makale Keşfet

    T psay 130t pGastroenterolojiin vivo g r nt lemetan lama g r nt lemedeneysel kolitdextran s lfat sodyum kolitinflamatuvar barsak hastalFloresans g r nt leme

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Gizlilik

    Kullanım Şartları

    İlkeler

    Bize Ulaşın

    KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

    JoVE HABER BÜLTENLERİ

    Araştırma

    Eğitim

    Yazarlar

    Kütüphaneciler

    JoVE Hakkında

    Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır