A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
قياس الملامح الجزيئية البيولوجية DSC مع يغاندس ثيرمولابيلي لوصف سرعة قابلة للطي والربط التفاعلات
In This Article
Summary
نقدم بروتوكول لتوصيف الجزيئية البيولوجية قابلة للطي وملزمة التفاعلات مع يغاندس ثيرمولابيلي باستخدام القياس فرق المسح السريع.
Abstract
فرق المسح القياس (DSC) تقنية قوية للتحديد الكمي لمعلمات دينامي حراري تحكم الجزيئية البيولوجية قابلة للطي والتفاعلات ملزمة. تعتبر هذه المعلومات الحاسمة في تصميم المركبات الدوائية الجديدة. ومع ذلك، العديد من يغاندس فارماسيوتيكالي ذات الصلة غير مستقرة كيميائيا عند درجات الحرارة العالية المستخدمة في التحليلات DSC. وهكذا، قياس التفاعلات ملزم هو التحدي لأن تركيزات يغاندس وتحويلها حرارياً المنتجات المتغيرة باستمرار داخل الخلية مسعر. وهنا، يقدم بروتوكول باستخدام يغاندس ثيرمولابيلي و DSC لسرعة الحصول على المعلومات الحرارية والحركية على الطي والربط، ويجند عمليات التحويل. لقد قدمنا طلبا لدينا طريقة للحمض النووي ابتمر MN4 الذي يربط بين الكوكايين يجند ثيرمولابيلي. استخدام تحليل تركيب عالمية جديدة التي تستأثر بتحويل يجند ثيرمولابيلي، يتم الحصول على مجموعة كاملة من طي ومعلمات الربط من زوج من تجارب DSC. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض أن يمكن الحصول على معدل ثابت للتحويل يجند ثيرمولابيلي مع واحد فقط dataset DSC التكميلية. وترد المبادئ التوجيهية لتحديد وتحليل البيانات من عدة سيناريوهات أكثر تعقيداً، بما في ذلك تجميع بيوموليكولي وطي بطيئة، بطيئة ملزمة والاستنفاد السريع ليجند ثيرمولابيلي لا رجعة فيه.
Introduction
فرق المسح القياس (DSC) وسيلة قوية كوانتيتاتينج الجزيئية البيولوجية ملزمة وقابلة للطي التفاعلات1،،من23. وتشمل مواطن قوة DSC قدرتها على توضيح ملزمة وقابلة للطي آليات، وأن تسفر عن2،معلمات دينامي حراري المقابلة3. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤديها في حل الظروف الفسيولوجية قرب DSC ولا تشترط وسم بيوموليكولي أو يجند، مثلاً، مع فلوروفوريس، وتدور التسميات أو النظائر النووية4. يمسح الصك في درجة الحرارة، وقياس كمية الحرارة المطلوبة لتجريدها في بيوموليكولي في وجود وغياب ليجند. ثيرموجرامس الناتجة عن ذلك تستخدم لاستخراج معلمات دينامي حراري يجند ملزمة وقابلة للطي عمليات الإدارة. المعلومات المقدمة من DSC أو غيرها من التقنيات الحرارية ضروري لتوجيه تصميم المخدرات تستهدف الجزيئات الحيوية1،،من56،،من78. ومع ذلك، المسح المتكرر لدرجات حرارة عالية (~ 60-100 درجة مئوية) يمكن أن يكون مشكلة. على سبيل المثال، العديد من المركبات الهامة فارماسيوتيكالي الخضوع لإعادة ترتيب أو التحلل عند التعرض المستمر لدرجات الحرارة المرتفعة9،،من1011، أي، ثيرمولابيلي. يتطلب دراسة ملزمة التفاعلات التي DSC عادة متعددة إلى الأمام وعكس الأشعة بغية التحقق من إمكانية تكرار نتائج للشخصية لتحليل دينامي حراري12. تحويل الحرارية يجند الأولية إلى نموذج ثانوية مع خصائص ربط تغيير يؤدي إلى الفروق وضوحاً في الشكل والموقف من ثيرموجرامس المتعاقبة، نظراً لتركيز يجند الأولية تتناقص مع كل عملية مسح في حين منتجات التحويل الحراري تتراكم. مجموعات البيانات هذه غير قابلة للتحليل التقليدي.
مؤخرا قمنا بتطوير أسلوب عالمي مناسب ليجند ثيرمولابيلي DSC مجموعات البيانات التي تعطي مجموعة كاملة من معلمات دينامي حراري الإدارة الجزيئية البيولوجية قابلة للطي وملزمة التفاعلات من تجربة واحدة يجند زمنياً المشار إليها إلى الشخصية المطلوبة ل بيوموليكولي الحرة4. التحليل يقلل الوقت التجريبي والعينة التي تتطلبها ~ 10 إضعاف بالمقارنة مع نهج DSC قياسية. ونحن قد شكلت ليجند التحويل الحراري بافتراض هذا يحدث أثناء الجزء درجة حرارة عالية لمسح كل حيث الشخصية لا تعتمد على تركيز يجند. ولذلك، يتم تركيز يجند ثابت داخل جزء الشخصية التي تستخدم لاستخراج معلمات دينامي حراري. بالإضافة إلى ذلك أظهرنا كيف يمكن الحصول على معدل ثابت ليجند التحويل الحراري عن طريق إجراء تجربة تكميلية واحدة مع فترة الموازنة أطول في درجة حرارة عالية. لأنظمة التحويل الحراري يجند فيها تعتمد على درجة حرارة أقل (أيحدوث ملحوظ في جميع درجات الحرارة)، التحليل ويمكن تعديلها لتشمل تركيزات يجند متغير. هنا نظهر هذا الإجراء للحمض النووي ابتمر MN4 حضور الكوكايين يجند ثيرمولابيلي، الذي تحول سريعاً إلى بينزويليكجونيني في درجات حرارة عالية (> 60 درجة مئوية). يتم استخدام الكينين كعنصر تحكم سلبية ليجند ثيرمولابيليتي نظراً لأنها لا تخضع للتحويل في هذه درجات الحرارة التجريبية، وأيضا بربط MN4. يصف لنا اقتناء يجند ثيرمولابيلي DSC مجموعات البيانات وتحليلها مما أسفر عن معلمات دينامي حراري والحركية للطي والربط، ويجند عمليات التحويل.
Protocol
1. إعداد نموذج
- تنقية بيوموليكولي المطلوب13.
ملاحظة: هذا البروتوكول الأغراض التي تم شراؤها الكوكايين-ربط الحمض النووي ابتمر MN4 بعد تبادل ضد 2 من كلوريد الصوديوم م ثلاث مرات تليها ثلاث جولات من المياه باستخدام عامل تصفية الطرد مركزي مع غشاء وقف وزن الجزيئي كاتشين 3. - توليف وتنقية، أو شراء المطلوب يجند ثيرمولابيلي13.
ملاحظة: ربط MN4 الكوكايين يجند ثيرمولابيلي. كما يربط MN4 الكينين، الذي يستخدم كعنصر تحكم سلبية ليجند ثيرمولابيليتي في هذه درجات الحرارة التجريبية. - تجهيز المخازن المؤقتة للغسيل الكلوي بيوموليكولي المنقي وانحلال يغاندس (المخزن كلوريد الصوديوم فوسفات الصوديوم و 140 ملم 20 ملم، ودرجة الحموضة 7.4، MN4 ويغاندس المستخدمة هنا).
- دياليزي بيوموليكولي ضد على الأقل 2 لتر من المخزن المؤقت باستخدام أنابيب الغسيل الكلوي مع 0.5-1.0 كاتشين وقف إنتاج المواد الانشطارية.
- تصفية المخزن المؤقت النهائي (المشار إليها كعامل المخزن المؤقت) عن طريق فلتر 0.2 ميكرون وقد تم اكويليبراتيد تماما مع المخزن المؤقت.
- تزن بها الجماهير المرجوة من يغاندس وحل لهم في المخزن المؤقت الذي تم تصفيته للعامل. إذا كانت تركيزات يجند المنشودة تتطلب الجماهير التي أصغر من أن تزن بدقة، تجعل حل يجند تتركز أسهم (10 x على سبيل المثال).
ملاحظة: من الأهمية بمكان أن جميع DSC تجارب استخدام المخزن المؤقت العامل نفسه للعينة ويجند، أيابدأ إجراء تجربة حيث يحل يجند في مجموعة مختلفة من المخزن المؤقت للعامل من بيوموليكولي كما سيؤدي هذا المخزن المؤقت عدم تطابق القطع الأثرية في البيانات. - تصفية الحل بيوموليكولي الأسهم من خلال فلتر 0.2 ميكرون قد تم اكويليبراتيد تماما مع المخزن المؤقت للعمل.
- تحديد تركيز بيوموليكولي بامتصاص القياسات (260 nm للأحماض النووية مثل MN4 و 280 نانومتر للبروتينات).
- تخزين بيوموليكولي المعدة ويجند في ثلاجة 4 درجة مئوية (مناسبة ل MN4 ويغاندس المستخدمة هنا)، أو في-20 أو-80 درجة مئوية إذا بيوموليكولي ويغاندس تحمل التخزين التجميد والطويل مطلوب. ديغا الحلول المخزن المؤقت، وبيوموليكولي، ويجند في أعلى جدول ديجاسير (انظر الجدول للمواد) قبل التحميل إلى DSC.
ملاحظة: ولﻵﻻت يساعد على منع تكوين فقاعة في DSC في ارتفاع درجات الحرارة. تسبب فقاعات التحف الإشارات التي تحجب DSC ذروة الأشكال وخطوط الأساس.
2-إعداد DSC
- فك المقبض الضغط من DSC (انظر الجدول للمواد).
- تشغيل أنابيب السيليكون من المخزن المؤقت العامل وإرفاقه بشفة الجبهة (الافتتاحية معدنية) شعري مرجع.
- إنشاء جسر بين الشعيرات الدموية المرجعية وعينه عن طريق توصيل المرجع الخلفي الشفة شفة عينة الجبهة.
- إرفاق قطعة من السليكون أنابيب شفة عينة الخلفي يتعارض قارورة نفايات مع خط فراغ المرفقة.
- قم بتشغيل خط فراغ لطرد DSC مع 200 مل من المخزن المؤقت للعمل.
- تحميل الشعرية مرجع من DSC مع المخزن المؤقت للعمل. إرفاق تقريبا الأقسام 3-5 سم من أنابيب السيليكون للشفاه الشعرية مرجع.
- إدراج تلميح ماصة 1 مل في أنابيب السيليكون لشفة الخلفي. رسم 0.8 مل من المخزن المؤقت للعمل مع ماصة، وإدراج تلميح ماصة مع المخزن المؤقت في أنابيب السيليكون لاستقبال إشارة شفة.
- اضغط برفق المكبس ماصة وصولاً إلى تمرير المخزن المؤقت العامل عن طريق أنابيب السيليكون الجبهة إلى الشعرية مرجع ويصل إلى شفة الخلفي لتعلق نصيحة ماصة. اضغط لأسفل المكبس ماصة حتى يصل إلى مستوى العمل المخزن المؤقت فقط فوق أنابيب السيليكون الجبهة، ثم الإفراج عن المكبس ماصة حتى يصل إلى مستوى العمل المخزن المؤقت فقط فوق أنابيب السيليكون الخلفي.
- كرر تمرير المخزن المؤقت العمل ذهابا وإيابا لإزالة وحدة التخزين في الشعرية مرجع الفقاعات.
ملاحظة: عادة ما يمر 10 الحل ذهابا وإيابا كافية لمسح أي فقاعات.
- كرر تمرير المخزن المؤقت العمل ذهابا وإيابا لإزالة وحدة التخزين في الشعرية مرجع الفقاعات.
- كاب نصيحة ماصة الخلفي مع الإبهام وسحب ما يصل بلطف على الحافة الخلفية ماصة وماصة الجبهة لإزالتها من الشفاه مرجع مع أنابيب السيليكون المرفقة.
- تحميل الشعرية عينة مع المخزن المؤقت للعمل كما هو الحال في الخطوات 2.6 2.9. ضع قبعة بلاستيكية سوداء على مرجع خلفي وعينه الشفاه، تاركاً الشفاه الجبهة التي اكتشفت.
- إرفاق مؤشر الضغط.
- فتح برنامج DSC (انظر الجدول للمواد)، وممارسة الضغط على الصك بواسطة النقر فوق الأحمر السهم في الجزء العلوي من الواجهة إلى متى استقر القراءة السلطة؛ سلطة DSC يشار في مربع في الجزء العلوي اليمين من الواجهة إلى جانب صك درجة الحرارة والضغط القراءة.
ملاحظة: مراقب سلطة القراءة ك DSC تحفزها. التغييرات في السلطة لأكثر من ~ 10 µW تشير إلى تشكيل فقاعة في الشعيرات الدموية، التي يمكن أن تسبب النتائج الملموسة في البيانات. الحلول التي يجب إزالتها ويطرد المزيد قبل المتابعة. - حجته DSC مع المخزن المؤقت للعمل بإجراء مسح للأمام وعكس. في علامة التبويب "المنهج التجريبي" على الجانب الأيسر من الشاشة، تأكد من تحديد الخيار "مسح" لتشغيل DSC في درجة حرارة وضع المسح.
ملاحظة: معلمات التجريبية هي درجة الحرارة مسح نطاق معدل المسح الضوئي، ودرجات الحرارة المنخفضة والعالية الموازنة والوقت عدد عمليات التفحص.- في داخلي "معلمات درجة الحرارة" ضمن علامة التبويب "المنهج التجريبي"، انقر فوق الزر "التدفئة". قم بإدخال 1 و 100 درجة مئوية لأعلى وأدنى درجات تجريبي، 1 درجة مئوية/دقيقة لمعدل المسح الضوئي، و 60 ثانية لفترة الموازنة.
- انقر فوق الزر "إضافة سلسلة" ضمن حقل الإدخال لفترة الموازنة. إدخال 2 في الحقل "خطوات لإضافة" في نافذة منبثقة (لتدفئة واحدة وفحص التبريد واحدة) والتحقق من المربع "البديل التدفئة/التبريد". انقر فوق "موافق"؛ بالأشعة وأضاف تظهر في الجزء السفلي من الواجهة. تحقق من أن المعلمات لكل عملية مسح كالمطلوب.
- تبدأ التجربة بواسطة النقر فوق الزر الأخضر "مسرحية" في الجزء العلوي من الواجهة. انتقل إلى المجلد المطلوب وإدخال اسم ملف لحفظ التجربة في نافذة منبثقة. عرض تقدم التجربة عن طريق النقر فوق علامة التبويب "البيانات" إلى يمين علامة التبويب "أسلوب التجربة".
3-جمع مجموعات البيانات DSC يجند ثيرمولابيلي
ملاحظة: الإجراء الحد الأدنى الذي يتكون من خمس تجارب: المخزن المؤقت التجارب المرجعية مع أو بدون [ليغند] (المستخدمة للطرح الأساس، انظر المناقشة)، عينة تجارب مع بيوموليكولي الحرة، بيوموليكولي يجند زمنياً، بيوموليكولي يجند زمنياً مع فترة الموازنة أطول في درجة حرارة عالية.
- تشغيل التجارب المرجعية للطرح الأساس لنموذج البيانات. إعادة تحميل DSC مع المخزن المؤقت للعمل في كلا من الشعيرات الدموية وجمع عدة إلى الأمام وعكس الأشعة عبر نطاق درجة حرارة مناسبة في 1 درجة مئوية دقيقة-1 مع الشيوخ (ارتفاع درجة الحرارة) وقت الموازنة من 120 ثانية.
- حذف مسح المخزن المؤقت السابق على الموازنة من الجزء السفلي من الواجهة بتسليط الضوء على كل منها على حدة والنقر فوق علامة X الحمراء إلى منتصف اليمين للواجهة. إضافة مسح جديد بالنقر فوق الزر "إضافة سلسلة" وإدخال 20 في حقل "خطوات لإضافة" والتحقق من المربع "البديل التدفئة/التبريد". انقر فوق موافق، وتشغيل هذه التجربة عن طريق النقر على زر التشغيل الأخضر كما ذكر أعلاه.
- كرر الخطوات من 3، 1-تجارب 3.1.1 مع عامل مخزن يحتوي على تركيز المطلوب ليجند في الشعيرات الدموية على حد سواء للحصول على المرجع ليجند (جمع تجربتين منفصلتين باستخدام 120 s و s 600 درجة حرارة مرتفعة الموازنة مرات على التوالي، لاستخدامها في الحصول على معدل ثابت ليجند ثيرمولابيلي التحويل).
ملاحظة: معدل المسح المستخدمة هنا يضمن بيوموليكولي في التجارب اللاحقة في التوازن الحراري في فحص الأمامية والعكسية (انظر المناقشة). مسح معدلات < 0.1-0.2 درجة مئوية دقيقة-1 يؤدي إلى ثيرموجرامس صاخبة ولا تطبق في تجارب DSC. ينبغي أن تمتد إلى درجات حرارة من البئر تحت درجة حرارة ذوبان من بيوموليكولي الحرة إلى ما فوق درجة حرارة ذوبان بيوموليكولي المشبعة يجند (~ 20-80 درجة مئوية ل MN4). تحقق من إمكانية تكرار نتائج للمسح الضوئي (بالنسبة مثلاً إلى الأمام 10 ومسح عكس 10 ل 20 مجموع غير كافية). - في حالة استخدام يغاندس متعددة (مثل الكوكايين ومادة الكينين)، تدفق DSC مع 200 مل من المخزن المؤقت العامل (كرر من الخطوة 2، 5) بين يعمل من أجل إزالة يجند من الشعيرات الدموية، ومنع التلوث عبر.
ملاحظة: أنها مفيدة لإجراء تجربة نسخ متماثل في بيوموليكولي الحرة بعد تشغيل يجند زمنياً من أجل التحقق من إذا كان يجند السابقة تمتز بقوة على الجدران الشعرية ولا تتم إزالة على نحو كاف مع مسح المخزن المؤقت. إذا كان ثيرموجرامس بيوموليكولي الحرة تظهر إلى أن تحول إلى حجم أكبر وأعلى درجة حرارة تمسخ بعد التجربة يجند زمنياً، من المرجح أن يجند السابقة لا تزال موجودة في مسعر بعد التنظيف. إزالة يجند الممتزة بحضانة الشعيرات الدموية مع 20% كونتراد-70 ح 1 عند 60 درجة مئوية مع أغطية بلاستيكية وضغط مقبض قبالة. في برنامج DSC، تغيير وضع التجريبية إلى "متحاور" ضمن علامة التبويب "الأسلوب التجريبي" s اختر 3,600 لمدة 60 درجة مئوية لدرجة الحرارة متحاور، مع صفر دخلت فترة الموازنة. انقر فوق "إضافة إلى المنهج التجريبي". التجربة متحاور يظهر في الجزء السفلي من الشاشة. بعد الانتهاء، تدفق الصك مع 2 لتر منزوع الماء وكرر من الخطوة 2، 5.
- تشغيل عينة تجارب باستخدام نفس DSC تحميل الإجراء ومعلمات التجريبية كما مسح الإشارة. لمجموعة البيانات بيوموليكولي الحرة، ضمان أن الشعرية مرجع يحتوي على المخزن المؤقت العامل بينما الشعرية نموذج يحتوي على بيوموليكولي الحرة في تركيز المطلوب في المخزن المؤقت للعمل.
- لتجارب يجند زمنياً، ضمان أن يجند في المخزن المؤقت للعامل في الشعرية مرجع، وبيوموليكولي بالإضافة إلى يجند في المخزن المؤقت للعامل في شعري عينة. مسح النظام بين إضافات يغاندس مختلفة كما هو الحال في الخطوة 2، 5.
- نفذ إحدى تجربة إضافية مع بيوموليكولي ملزمة ليجند ثيرمولابيلي حيث تمت زيادة فترة الموازنة ارتفاع درجة الحرارة إلى 600 s وكافة المعلمات الأخرى التجريبية هي نفس الخطوة 3.2.1.
ملاحظة: يتم اختيار فترة الموازنة ارتفاع درجة الحرارة في التجربة الثانية يجند زمنياً ببساطة التأكد من يجند المستنفد أكثر سرعة من التجربة المرة الموازنة قصيرة. إذا كان على قمم يجند زمنياً من الأول تجربة تسوس ببطء كدالة لفحص عدد (مثلاً، الاختلافات في ماكسيما ذروة المتعاقبة هي ≤ 0.5 درجة مئوية)، تقدير الزيادات 10 إلى 20 ضعفا في فترة الموازنة ارتفاع درجة الحرارة من أجل تستنفد على نحو كاف يجند خلال التجربة الثانية. حساب دقيق لمعدل ثابت للتحويل [ليغند] يتطلب أن التجربة الثانية استنزاف أسرع ليجند بالنسبة إلى الأولى. سوف تكون تركيزات يجند المستخرجة من التحليل الشامل لأن التجربتين مماثلة وذلك غير قابل للاستخدام إذا لا هو تسارع نضوب يجند بما فيه الكفاية في التجربة الثانية.
4-معالجة البيانات
- فتح الملفات في برنامج تحليل البيانات DSC تجربة DSC (انظر الجدول للمواد)، وتصدير البيانات الخام والطاقة كجداول البيانات.
- استيراد جداول البيانات التي تحتوي على البيانات الخام والطاقة إلى برمجيات للبيانات المناسب.
- الأساس طرح نموذج للبيانات عن طريق طرح في المخزن المؤقت لبيانات السلطة من الحر وتجارب بيوموليكولي يجند زمنياً.
ملاحظة: ليجند ثيرمولابيلي التجربة، يتناقص تركيز يجند الأولية مع كل عملية مسح. ولذلك، ومثالي لطرح مسح المخزن المؤقت 1 من عينة المسح الضوئي 1، وهلم جرا. وقد وجدنا أن بمسح المخزن المؤقت مع الكوكايين لا تغير ملحوظ كما يجند تحويل العائدات وذلك مسح المخزن مؤقت ليجند ثيرمولابيلي واحدة يمكن استخدامها لطرح كافة البيانات المرتبطة يجند ثيرمولابيلي. - تحويل بيانات السلطة عينة طرح خط الأساس لقدرة الحرارة.
ملاحظة: يتطلب التحويل حجم بيوموليكولي محددة الجزئية، التي يمكن أن تكون ما يقدر14،،من1516. المعادلة لتحويل الطاقة إلى قدرة الحرارة قد سبق وصفها17.
5-بيانات التحليل
- على الصعيد العالمي تناسب الموازنة قصيرة الوقت ثيرمولابيلي السعة الحرارية يجند زمنياً dataset مع مجموعة واحدة من خط الأساس وتركيز يجند وقابلة للطي، ويجند ربط المعلمات كما هو موضح سابقا4.
- كرر صالح العالمي ل dataset وقت طويل الموازنة من أجل حساب معدل ثابت ليجند ثيرمولابيلي التحويل كما هو موضح سابقا4.
النتائج
وترد بيانات تمثيلية ليجند ثيرمولابيلي DSC في الشكل 1. الموقف وارتفاع ذروة يجند زمنياً ثيرمولابيلي تباعا التحولات إلى أسفل نحو من بيوموليكولي غير منضم كما زف يجند ثيرمولابيلي مع كل عملية مسح (الشكل 1a). يتم استخدام التشكيل الجانبي تمسخ الحرة ?...
Discussion
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
تفاصيل التحليل المناسب العالمية المستخدمة في الشكل 1 و الشكل 2 تم وصف سابقا4. هنا، فإننا مخطط الجوانب العملية لتنفيذ وتحليل تجارب DSC ملزمة مع يغاندس ثيرمولابيلي. ملاحظة الحصول على خط ?...
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgements
ر. دبليو حاء الخامس أيده ماكغيل العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة) البرنامج التدريبي في بيونانوماتشينيس. أ. م. ك. وب. أ. ج. كانت تدعمها في منح الأموال 327028-09 (أ. ك. م) و 238562 (ب. أ. ج.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
- Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
- Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
- Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
- Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
- Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
- Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
- Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
- Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
- Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
- Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).
- Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
- Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
- Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
- Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
- Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved